四川雪茄系列品種煙堿轉(zhuǎn)化率及品種純化效果

張藍月,周 迪,趙園園,秦艷青,王 俊,李晶晶,雷云康,周 駿,史宏志

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心,鄭州 450002; 2.中國煙草總公司四川省公司,成都 600041; 3.四川省煙草公司德陽市公司,四川 德陽 618400; 4.上海煙草集團北京卷煙廠有限公司,北京 100024)

【研究意義】隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和人們消費水平的提高,國內(nèi)雪茄消費逐漸增長,這對優(yōu)質(zhì)低害雪茄煙葉原料的生產(chǎn)和供應(yīng)提出了更高要求[1]。生物堿不僅是影響煙葉感官質(zhì)量的核心化學(xué)成分,而且是煙草有害成分煙草特有亞硝胺(Tobacco specific N-nitrosamines, TSNAs)的前體物,與煙葉安全性密切相關(guān)[2-3]。TSNAs一直是國際上煙草研究的熱點之一,本試驗通過品種純化顯著降低雪茄煙葉TSNAs含量,為雪茄煙葉減害研究提供了新方法?！厩叭搜芯窟M展】在正常情況下,煙堿是煙葉中最主要的生物堿[3],但有一些植株會發(fā)生基因突變產(chǎn)生煙堿去甲基酶活性,從而導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿[4-5]。煙堿轉(zhuǎn)化是國內(nèi)外雪茄煙葉普遍存在的問題[6],也是不同雪茄煙群體降煙堿含量、NNN含量和TSNAs總量大幅增高的重要原因[7]。不同品種和不同用途的雪茄煙葉煙堿轉(zhuǎn)化率差異較大[6-7],通過適期打頂、控制晾制濕度和晾制時間[8]、沉默煙堿去甲基基因[9]以及選用非轉(zhuǎn)化株進行育種[10-11]等手段均可緩解煙堿轉(zhuǎn)化問題,進而降低煙葉TSNAs含量。在煙堿轉(zhuǎn)化株早期鑒定的基礎(chǔ)上,史宏志等[10-13]對白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化性狀進行純化改良,結(jié)果表明,嚴(yán)格選擇非轉(zhuǎn)化株進行制種的純化改良方法能有效減少白肋煙的煙堿轉(zhuǎn)化問題,但此方法目前在雪茄煙上的應(yīng)用較少。【本研究切入點】四川地區(qū)種植晾曬煙的歷史悠久,歷史上以當(dāng)?shù)亓罆駸熥鳛檠┣言蟍14-15],近些年來,通過引種馴化已形成與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件相適應(yīng)的德雪系列雪茄品種[16-17]。關(guān)于雪茄煙葉生物堿方面的研究,一般只是片面關(guān)注煙堿含量,而對生物堿組成,特別是煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問題缺乏研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗首次對四川雪茄德雪系列品種混合樣品和單株樣品進行生物堿組成和煙堿轉(zhuǎn)化率分析,并通過煙堿轉(zhuǎn)化株早期誘導(dǎo)和鑒定對主栽雪茄品種進行品種純化,以優(yōu)化雪茄煙葉生物堿組成,有效提高雪茄煙葉質(zhì)量水平及其制品的安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗于2019—2021年在四川省什邡市進行,試驗田前茬作物為水稻,土壤有機質(zhì)含量3.01 g/kg,堿解氮含量120 mg/kg,速效磷含量38.1 mg/kg,速效鉀含量89 mg/kg,pH為5.8～7.0。供試品種分別為:德雪1號、德雪3號、德雪4號、德雪5號、德雪7號、什煙1號。并對當(dāng)?shù)夭糠种髟云贩N(德雪4號、德雪7號、什煙1號)進行純化改良。

1.2 試驗設(shè)計

2019年,將德雪1號、德雪3號、德雪4號、德雪5號、德雪7號和什煙1號各供試品種隨機排列種植,每個品種種植120株,行距125 cm,株距40.5 cm,各小區(qū)面積為62.5 m2,每個品種設(shè)置3次重復(fù)。按照雪茄煙生產(chǎn)規(guī)范進行正常田間管理,煙葉成熟采收時,每個品種隨機取30片中部葉,在當(dāng)?shù)亓婪恐辛乐?5 d后取樣,樣品凍干磨碎后作為混合樣品,用于測定生物堿含量和TSNAs含量。

2020年,將各供試品種參照上一年的種植方法隨機排列種植。煙株移栽后30 d,在每個群體隨機選擇30株生長健壯的煙株掛牌定株,并于開花前,取每個品種掛牌30株單株的中部葉,以濃度為0.3%的乙烯利噴施進行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化,使煙堿轉(zhuǎn)化性狀在早期表達。在保溫保濕的晾房中對各品種所取煙葉進行統(tǒng)一晾制,直到煙葉完全變黃后取樣,所取樣品冷凍干燥磨碎過篩(孔徑0.25 mm),用于測定單株生物堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率。同時在開花前對各品種掛牌的單株套袋進行自交留種,按前期測定的煙堿轉(zhuǎn)化率嚴(yán)格選擇非轉(zhuǎn)化株的種子留作純化改良種。

2021年,選取3個主栽品種(德雪4號、德雪7號、什煙1號)的純化改良種,另選取該品種當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種作為對照種,每個品種種植200株,行距125 cm,株距40.5 cm,各小區(qū)面積102.50 m2,每個處理重復(fù)3次,按當(dāng)?shù)匮┣褵熒a(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一進行管理,煙葉成熟時按單片采收,在鋼結(jié)構(gòu)現(xiàn)代化晾房中晾制25 d。發(fā)酵方式為堆積發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后的樣品經(jīng)冷凍干燥后磨碎,用于后續(xù)分析。

1.3 樣品測定

1.3.1 常規(guī)化學(xué)成分測定 在50 mL小白瓶中分別加入0.2500 g煙樣和25 mL 5%的醋酸溶液。將小白瓶封口后置于回旋振蕩器上震蕩30 min,震蕩結(jié)束后過濾,濾液用AA3型流動分析儀(德國BRAN&LU-EBBE公司生產(chǎn))測定常規(guī)化學(xué)成分。取0.1000 g樣品于100 mL消化管中,分別加入1.0000 g硫酸鉀、0.1000 g無水硫酸銅和5 mL濃硫酸,消化3 h后靜置到室溫,加超純水后過濾,濾液用流動分析儀測定煙葉的總氮含量。

1.3.2 生物堿成分測定 生物堿含量測定采用氣相色譜法。在試管中分別加入200 mg樣品,1.5 mL 10%的NaOH溶液,3 mL甲基叔丁基醚和100 μL內(nèi)標(biāo)溶液(7.5 μg/μL正十六烷),封口后在振蕩器上振蕩5 min。靜置24 h后,取上清液用7890A型氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(美國Agilent公司)定量分析生物堿含量,具體操作參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 559—2018[18]。煙堿轉(zhuǎn)化率由下式計算。

煙堿轉(zhuǎn)化率(PNC)=[降煙堿含量/(煙堿含量+降煙堿含量)]×100

根據(jù)煙堿轉(zhuǎn)化率將煙株分為非轉(zhuǎn)化株(煙堿轉(zhuǎn)化率低于3%)、低轉(zhuǎn)化株(煙堿轉(zhuǎn)化率3%～20%)、中轉(zhuǎn)化株(煙堿轉(zhuǎn)化率大于20%)和高轉(zhuǎn)化株(煙堿轉(zhuǎn)化率大于50%)。

1.3.4 TSNAs含量測定 TSNAs含量的檢測方法為固相萃取液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-MS/MS)法[SPE系統(tǒng):Symbiosis (Pico),荷蘭Spark Holland公司;質(zhì)譜儀:AB SCIEX Triple Quad 5500,AB Sciex公司]。在50 mL錐形瓶中加入1.0000 g煙樣,40 μL 5000 ng/mL 的4種氘代TSNAs (內(nèi)標(biāo))溶液和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液,在振蕩器(200 r/min)上萃取60 min后,萃取液用0.45 μm的水相濾膜過濾,用于檢測TSNAs含量[20]。N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)含量之和為TSNAs總量[21]。

1.3.5 感官質(zhì)量評價 將樣品切絲卷制為單料煙,由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院評吸專家進行評價,并按照評分權(quán)重(表1)計算加權(quán)總分。

表1 雪茄煙感官質(zhì)量評分權(quán)重

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0和DPS進行相關(guān)性分析和方差分析,用Excel 2010軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川雪茄系列品種生物堿組成及TSNAs含量分析

2.1.1 四川不同品種雪茄煙調(diào)制后生物堿含量比較 由表2可知,不同品種雪茄煙的生物堿含量及組成差異較大,什煙1號的生物堿總量顯著高于其他品種,其次為德雪5號。所有供試品種中,什煙1號和德雪4號的煙堿含量較高。德雪5號的煙堿含量最低而降煙堿含量最高,且其混合樣品的煙堿轉(zhuǎn)化率高達89.52%,可見該品種存在嚴(yán)重的煙堿轉(zhuǎn)化問題。什煙1號的降煙堿含量僅次于德雪5號,煙堿轉(zhuǎn)化率較高,有必要對該品種進一步純化改良。

表2 不同品種雪茄煙調(diào)制后的生物堿含量

2.1.2 四川不同品種雪茄煙調(diào)制后TSNAs含量比較 如表3所示,什煙1號的TSNAs總量最高,其次為德雪4號,分別為3045.39和2499.31 ng/g。NNN含量最高的是德雪5號,高達1686.84 ng/g,其次為什煙1號和德雪4號。什煙1號的NNK、NAT和NAB含量均顯著高于其他品種。

表3 不同品種雪茄煙調(diào)制后的TSNAs含量

2.1.3 四川不同品種雪茄煙生物堿含量和TSNAs含量間的相關(guān)性分析 由表4可知,煙堿轉(zhuǎn)化率與降煙堿含量和NNN含量之間呈極顯著和顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.916。降煙堿含量和NNN含量之間呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.925。此外,NNN含量和假木賊堿含量之間也呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)高達0.935。

表4 雪茄煙TSNAs含量與生物堿含量之間的相關(guān)系數(shù)

2.2 四川系列雪茄品種早期誘導(dǎo)后煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布

對各品種30株單株所取的中部葉進行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化,測定生物堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率,得出不同品種雪茄煙煙堿轉(zhuǎn)化率的株間分布情況(圖1～6),不同品種雪茄煙的煙堿轉(zhuǎn)化程度差異顯著。德雪1號和德雪3號各單株的煙堿轉(zhuǎn)化率較低,這兩個群體中大多為非轉(zhuǎn)化株,且所有轉(zhuǎn)化株皆為低轉(zhuǎn)化株。德雪4號和德雪7號群體中非轉(zhuǎn)化株更多,所有轉(zhuǎn)化株中低轉(zhuǎn)化株的比例更大,其余都是中轉(zhuǎn)化株。什煙1號的煙堿轉(zhuǎn)化率在不同單株之間差異較大,變異范圍為1.96%～85.45%,該群體既存在非轉(zhuǎn)化株,又存在低轉(zhuǎn)化株、中轉(zhuǎn)化株和高轉(zhuǎn)化株。德雪5號各單株煙堿轉(zhuǎn)化率極高,所選群體所有單株均為高轉(zhuǎn)化株,且該群體中煙堿轉(zhuǎn)化率在80%以上的單株占據(jù)絕對優(yōu)勢。

因部分煙株生長后期出現(xiàn)病害,故不再將其統(tǒng)計在煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布內(nèi),下同。Due to the occurrence of diseases in some tobacco plants during their later growth stages, they will no longer be included in the inter plant distribution.The same as below.圖1 德雪1號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.1 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Dexue 1

圖2 德雪3號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.2 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Dexue 3

圖3 德雪4號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.3 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Dexue 4

圖4 德雪7號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.4 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Dexue 7

由表5可知,不同品種雪茄煙的生物堿含量存在差異,其群體中煙堿轉(zhuǎn)化株的分布也存在較大差異。在所有供試品種中,德雪5號的降煙堿含量和生物堿總量高于其他品種,煙堿含量最低,平均煙堿轉(zhuǎn)化率高達90.79%,所測單株都為轉(zhuǎn)化株,且所有轉(zhuǎn)化株皆為高轉(zhuǎn)化株,嚴(yán)重的煙堿轉(zhuǎn)化問題阻礙了本試驗該品種的后續(xù)純化工作。什煙1號的生物堿含量較高,轉(zhuǎn)化株比例為58.6%,后期需對該品種進行系統(tǒng)純化。德雪1號和德雪3號的煙堿轉(zhuǎn)化問題相對較小,群體的轉(zhuǎn)化株比例分別為36%和40%,且所有轉(zhuǎn)化株皆為低轉(zhuǎn)化株,在后續(xù)純化過程中的選擇壓力較小。德雪4號和德雪7號的煙堿轉(zhuǎn)化率分別為7.98%和7.50%,群體的轉(zhuǎn)化株比例分別為48%和30%。因此本試驗最終選擇德雪7號、德雪4號和什煙1號進行系統(tǒng)純化。

表5 不同雪茄品種轉(zhuǎn)化株比例及煙堿轉(zhuǎn)化率

2.3 四川主栽雪茄煙品種煙堿轉(zhuǎn)化性狀純化改良及增質(zhì)減害效果

2.3.1 純化種和對照種的生物堿及硝酸鹽含量比較 根據(jù)早期轉(zhuǎn)化株誘導(dǎo)鑒定結(jié)果,嚴(yán)格選擇3個品種(德雪4號、德雪7號、什煙1號)非轉(zhuǎn)化株進行自交,得到相應(yīng)的純化種,另選取每個當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種作為對照種,按照當(dāng)?shù)匮┣褵熒a(chǎn)規(guī)范進行統(tǒng)一管理、調(diào)制和發(fā)酵。如表6所示,德雪7號純化種的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著降低,煙堿含量顯著高于對照種,降煙堿含量和硝酸鹽含量顯著低于對照種。德雪4號純化種的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著低于對照種,且降煙堿含量和硝酸鹽含量也顯著低于對照種。什煙1號純化種的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著低于對照種,純化種的煙堿轉(zhuǎn)化率為4.64%,而對照種的煙堿轉(zhuǎn)化率高達24.40%。

圖5 德雪5號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.5 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Dexue 5

圖6 什煙1號煙堿轉(zhuǎn)化率株間分布Fig.6 Distribution of nicotine conversion rate between plants in Shiyan1

表6 純化種和對照種的生物堿和硝酸鹽比較

總體上,德雪4號、德雪7號和什煙1號純化種的煙堿含量顯著高于對照種,降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率顯著低于對照種。

2.3.2 純化種和對照種TSNAs含量比較 由表7可知,德雪7號純化種與對照種的TSNAs含量差異顯著,純化種的NNN含量和TSNAs總量顯著低于對照種。相比對照種,德雪4號純化種的NNN含量和TSNAs總量更低。什煙1號純化種與對照種的NNN含量差異顯著,純化種的TSNAs總量顯著低于對照種?？傮w上,不同品種雪茄煙純化種的NNN含量和TSNAs總量均顯著低于對照種。

表7 純化種和對照種TSNAs含量及比例差異

2.3.3 純化種與對照種的常規(guī)成分比較 由表8可知,德雪7號純化種的總糖、煙堿、還原糖含量和糖堿比均高于對照種。德雪4號純化種與對照種的總糖和還原糖含量均無顯著差異,純化種的煙堿含量顯著高于對照種。什煙1號純化種的總糖、煙堿和還原糖含量均高于對照種,兩糖比和糖堿比均顯著高于對照種。

表8 純化種與對照種的常規(guī)成分比較

綜上所述,不同品種雪茄煙純化種的煙堿含量顯著高于對照種。德雪7號和什煙1號純化種的總糖和還原糖含量高于對照種。

2.3.4 純化種與對照種的感官質(zhì)量比較 如表9所示,德雪7號純化種的勁頭、香氣質(zhì)、香氣量、濃度、雜氣和余味的評分均高于對照種。德雪4號純化種的勁頭、香氣質(zhì)、香氣量、濃度、雜氣、刺激性和余味的評分均高于對照種。什煙1號純化種的香氣質(zhì)、香氣量、濃度、雜氣和余味評分均高于對照種。各品種純化種的感官質(zhì)量加權(quán)總分均高于對照種。

表9 純化種與對照種的感官質(zhì)量比較

綜上所述,德雪4號、德雪7號和什煙1號純化種的香氣質(zhì)、香氣量、濃度、雜氣和余味的評分及加權(quán)總分均高于對照種。

3 討 論

煙堿轉(zhuǎn)化性狀是顯性遺傳,可以在世代間不斷傳遞積累。國外通過對白肋煙品種進行純化來減少煙堿轉(zhuǎn)化性狀在不同世代間的遺傳,純化可有效降低后代群體的煙堿轉(zhuǎn)化率[22]。我國尚未把降煙堿含量作為品種選育的選擇指標(biāo),這導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化株在各群體中逐年積累,煙堿轉(zhuǎn)化問題愈加突出[23]。國內(nèi)外不同產(chǎn)區(qū)或不同用途的雪茄煙葉均普遍存在煙堿轉(zhuǎn)化問題[6-7]。群體的高轉(zhuǎn)化株比例和降煙堿含量偏高都會影響煙葉的感官品質(zhì)和安全性[23],煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿含量增加,從而使雪茄煙葉的NNN含量和TSNAs總量升高[7],這對我國優(yōu)質(zhì)低害雪茄原料的生產(chǎn)非常不利。前人研究表明,四川雪茄煙的化學(xué)成分更接近于國外雪茄,而致香成分總量較低[24],因此對四川主栽雪茄煙葉進行群體純化是當(dāng)務(wù)之急。本研究發(fā)現(xiàn),不同品種的雪茄煙煙堿轉(zhuǎn)化株和煙堿轉(zhuǎn)化程度差異顯著,其中德雪1號和德雪3號所測群體的轉(zhuǎn)化株比例較低,且所有轉(zhuǎn)化株均為低轉(zhuǎn)化株。德雪5號的煙堿轉(zhuǎn)化問題嚴(yán)重,所測群體均為高轉(zhuǎn)化株。德雪4號和德雪7號群體的轉(zhuǎn)化株比例分別為48%和30%,其中低轉(zhuǎn)化株分別占群體總數(shù)的36%和20%,中轉(zhuǎn)化株分別占12%和10%。什煙1號也存在煙堿轉(zhuǎn)化問題,轉(zhuǎn)化株比例相對較高,為58.6%,但該品種是四川什邡地區(qū)的主栽品種之一[25],因此對該品種進行品種純化是必然選擇。

近十幾年來,史宏志團隊對我國湖北、四川和云南的白肋煙進行了系統(tǒng)純化,純化效果顯著,后代群體的TSNAs含量大幅下降,轉(zhuǎn)化株比例和煙堿轉(zhuǎn)化率顯著降低[10-13]。本試驗通過早期鑒定轉(zhuǎn)化株并嚴(yán)格選擇非轉(zhuǎn)化株進行自交留種對德雪4號、德雪7號和什煙1號進行品種純化,純化后不同品種雪茄煙葉的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著降低,且煙葉的TSNAs含量顯著降低,煙葉品質(zhì)大幅提高。由此可見,通過嚴(yán)格選擇非轉(zhuǎn)化株制種對四川雪茄系列品種進行純化,可達到優(yōu)化生物堿組成和改善煙葉品質(zhì)的目的,可顯著降低雪茄煙葉的降煙堿含量和TSNAs含量,對于優(yōu)質(zhì)低害雪茄煙葉生產(chǎn)具有重要價值。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,越來越多的研究從基因水平揭示了煙堿轉(zhuǎn)化性狀的表達規(guī)律。前人研究發(fā)現(xiàn),在煙堿轉(zhuǎn)化過程中,煙堿去甲基酶活性主要是由顯性基因CYP82E4調(diào)控,沉默該基因表達可有效抑制煙堿轉(zhuǎn)化[9],但目前轉(zhuǎn)基因煙草對煙葉品質(zhì)的影響尚不明確,其在大田生產(chǎn)中的應(yīng)用受到一定限制。本試驗對四川雪茄品種進行純化,其增質(zhì)減害效果明顯,為我國優(yōu)質(zhì)低害雪茄煙葉生產(chǎn)提供了新方法,但是純化改良前期的非轉(zhuǎn)化株篩選工作具有一定的技術(shù)性,隨著煙堿轉(zhuǎn)化株鑒別技術(shù)的優(yōu)化,純化效率將有更大的提高。

4 結(jié) 論

不同品種雪茄煙葉的生物堿含量及組成差異較大,且煙堿轉(zhuǎn)化率的株間分布差異較大。經(jīng)過煙堿轉(zhuǎn)化性狀純化后,煙葉的降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率顯著降低,且NNN含量和TSNAs總量顯著降低。因此,通過剔除轉(zhuǎn)化株,嚴(yán)格選擇非轉(zhuǎn)化株制種進行品種純化,可以顯著降低雪茄煙葉有害物質(zhì)含量,提升煙葉安全性。