穴位埋線對(duì)心肌梗死大鼠巨噬細(xì)胞MerTK胞葬作用的影響

張 薇，黃小樓，2，韋雪蘭，楊 珣，2，平蘭芝，吳高鑫，2*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是因冠狀動(dòng)脈阻塞血供中斷，局部心肌持續(xù)性缺血而引發(fā)的心肌壞死性疾病，其發(fā)病率逐年升高，威脅著全世界人民的健康[1]。在MI的發(fā)生發(fā)展中，炎癥反應(yīng)的重要性已被證實(shí)[2]。MI后局部心肌組織持續(xù)的缺血缺氧及心肌能量供應(yīng)障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)病理性凋亡同時(shí)出現(xiàn)修復(fù)性的急性炎癥反應(yīng)。適當(dāng)炎癥因子的分泌可吞噬凋亡的細(xì)胞及碎片，促進(jìn)組織的修復(fù)，炎癥過度表達(dá)則引發(fā)不良的心室重塑[3]。巨噬細(xì)胞表面受體MerTK的胞葬作用可通過對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬來避免炎癥過度的發(fā)生，進(jìn)而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)[4]。穴位埋線療法是通過現(xiàn)代針具結(jié)合《靈樞·終始》“久病者……深內(nèi)而久留之”的理論而衍生的一種長(zhǎng)效針感效應(yīng)的治療方法。有研究顯示[5]，穴位埋線療法對(duì)心絞痛患者有一定的治療作用。能明顯改善其缺血發(fā)作的時(shí)間和發(fā)作的次數(shù)。課題組前期研究表明[6]，內(nèi)關(guān)穴位埋線能通過抑制雷帕霉素靶蛋白質(zhì)合成改善心肌梗死大鼠心肌肥大程度，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。但炎癥反應(yīng)機(jī)制研究尚未開展，其機(jī)制尚未闡明。本研究通過“內(nèi)關(guān)”和“心俞”穴位埋線對(duì)心梗大鼠心肌細(xì)胞大小形態(tài)改變的影響，進(jìn)一步探究論證“內(nèi)關(guān)”和“心俞”穴位埋線在巨噬細(xì)胞MerTK胞葬作用下對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用機(jī)理，為穴位埋線在防治心肌梗死提供多靶點(diǎn)的分子實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，為該理論在臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性SD大鼠，8～10周齡，50只，SPF級(jí)。體質(zhì)量180～220 g，均由天勤（長(zhǎng)沙）生物技術(shù)有限公司提供，合格證編號(hào)：SCXK（湘）2019-0017，室溫20～25℃、濕度50%～70%，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)而造模使用。本實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)使用規(guī)定，倫理委員會(huì)編號(hào)：20220081。

1.2 主要試藥與儀器 培哚普利叔丁胺片（上海東英藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093504），戊巴比妥鈉（進(jìn)口分裝西格瑪，批號(hào)20170510），HE染色試劑盒（珠海貝索生物科技有限公司），IL-1β（ZC-36391）、IL-6（ZC-36404）、TNF-α（ZC-37624）96Test ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），MerTK（abs146712），P-MerTK（abs140272）兔克隆抗體（愛必信上海生物科技有限公司）。一次性輔助埋線包（揚(yáng)州伊貝康醫(yī)療科技有限公司），高精度電子天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司），小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（上海普辛儀器科技有限公司），BL-420N生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），酶標(biāo)儀（上海卓的儀器設(shè)備有限公司），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）等。

2 方法

2.1 造模 SD雄性大鼠采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法（LAD）構(gòu)建急性心梗大鼠模型[7]，麻醉以1%的濃度（50 mg/kg）的計(jì)量給予大鼠腹腔注入戊巴比妥鈉，接著仰臥固定大鼠、備皮、氣管插管、依據(jù)相關(guān)參數(shù)設(shè)定小動(dòng)物人工呼吸機(jī)并將與大鼠連接，術(shù)區(qū)消毒后沿著大鼠左側(cè)第三、四肋間鈍性分離肌肉直至打開胸腔，眼科鑷撕開心包膜，將心臟暴露視野，用5/0帶線縫合針將位于左心耳下緣2 mm處的左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎。0.1 mL利多卡因注射液滴入胸腔并在縫合傷口上撒少許青霉素粉末，其作用分別是預(yù)防心律失常和傷口感染。模型構(gòu)建術(shù)后，將大鼠肢體鏈接上Ⅱ?qū)?lián)，觀測(cè)術(shù)后大鼠心電圖，如出現(xiàn)ST段抬高則構(gòu)建模型成功。手術(shù)全程嚴(yán)格無(wú)菌，偽手術(shù)組過程同模型組，但僅開胸后撕開心包膜。實(shí)驗(yàn)中，模型構(gòu)建前心電圖異?；蛟炷２怀晒Φ挠杼蕹Ｔ炷Ｇ昂笮碾妶D見圖1。

圖1 大鼠模型構(gòu)建前后心電圖

2.2 分組與給藥 將構(gòu)建成功的模型大鼠以隨機(jī)方式分為模型組、“內(nèi)關(guān)”和“心俞”穴位埋線組、培哚普利組，同時(shí)單設(shè)偽手術(shù)組。并以術(shù)后7、28 d作為觀察點(diǎn)，每組5只，共40只。各時(shí)間點(diǎn)大鼠在造模后的第2天開始干預(yù)治療，培哚普利組藥物計(jì)量按照40 mg/kg灌胃，余下3組給予相當(dāng)容積蒸餾水灌胃，每天1次?！皟?nèi)關(guān)”和“心俞”穴位參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位標(biāo)準(zhǔn)第2版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位，將羊腸線（3-0）剪成2～5 mm長(zhǎng)段置于75%酒精中，7號(hào)埋線針推入以上穴位。埋線出針后檢查有無(wú)線頭外露并用醫(yī)用藥棉按壓針孔1 min，心俞、內(nèi)關(guān)均斜刺，埋線干預(yù)7 d/次，第7、28天行相關(guān)檢查。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度各組大鼠最后一次治療后，禁食不禁水12 h，麻醉后的大鼠行腹主動(dòng)脈取血，全血靜置15 min，3 500 rpm離心10 min，移液槍將血清移入離心管，ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作按照說明書對(duì)各組別大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β 濃度進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 HE染色 嚴(yán)格無(wú)菌操作下，取出心臟組織，沿心臟最大橫徑將心臟分為上下部分，4%多聚甲醛將心臟上半部分固定，石蠟包埋心臟上半部組織，切片厚度5 μm，不同濃度酒精脫水，用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，HE染色，切片封固，高清全景掃描儀采集切片圖像，應(yīng)用Image-J軟件對(duì)心肌細(xì)胞橫切面積進(jìn)行測(cè)量。

2.3.3 Western blotting檢測(cè)心肌組織 MerTK、p-MerTK的蛋白表達(dá) 將梗死心肌周圍組織放入研磨管中，組織研磨管中加入強(qiáng)RIPA裂解液，裂解后提取各時(shí)間組大鼠心肌組織中的蛋白含量，BCA法測(cè)定蛋白濃度。待100 V電壓穩(wěn)定15 min后開始電泳，PVDF膜放200 mA電流中轉(zhuǎn)膜1～2 h，并放入孵育盒。一抗 MerTK、p-MerTK孵育，濃度 1：1 000，βactin濃度1：50 000，二抗孵育，均勻滴入發(fā)光液，曝光顯影成像，Image-J軟件分析處理蛋白灰度，各時(shí)間組蛋白灰度值相比β-action灰度值，得到目的蛋白灰度表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量單位以（±s）表示。選用單因素方差分析，其計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性選擇“LSD”。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織HE染色情況和心肌細(xì)胞橫截面積比較 術(shù)后7、28 d不同時(shí)間點(diǎn)的偽手術(shù)組心肌細(xì)胞的大小、形態(tài)均未發(fā)生明顯改變、細(xì)胞間平行排列且有序，細(xì)胞核呈現(xiàn)出卵圓形，位居細(xì)胞中央。模型組心肌細(xì)胞大小形態(tài)異常、呈肥大改變且錯(cuò)亂排列，游離細(xì)胞核增多，見明顯的細(xì)胞間質(zhì)，兩治療組心肌細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，排列相較平行有序，心肌細(xì)胞核游離及肥大的情況不同程度改善。見圖2。

圖2 各時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌細(xì)胞HE切片結(jié)果（×400）

術(shù)后7 d，模型組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積明顯大于偽手術(shù)組（P＜0.05），兩治療組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積均小于模型組（P＜0.05）。術(shù)后28 d，模型組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積明顯大于偽手術(shù)組（P＜0.05），兩治療組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積均小于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌細(xì)胞橫截面積結(jié)果相比較（±s）

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌細(xì)胞橫截面積結(jié)果相比較（±s）

注：與偽手術(shù)組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n 治療后7 d（μm2）治療后28 d（μm2）偽手術(shù)組 5 203.78±15.31 244.4±16.01模型組 5 372.54±7.74＃ 676.8±41.45＃埋線組 5 347.98±14.48* 533.6±32.44*培哚普利組 5 280.48±9.81* 459.6±35.10*

3.2 各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平相比較 術(shù)后7、28 d，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度水平明顯高于偽手術(shù)組（P<0.05）。治療后 7 d，大鼠血清 IL-6、TNF-α、IL-1β 兩治療組大鼠均低于模型組（P<0.05）。治療后28 d，相較于模型組，兩治療組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β均不同程度降低（P<0.05）。見表2、表3。

表2 7 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

表2 7 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

注：與偽手術(shù)組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n IL-1β（pg/mL）偽手術(shù)組 5 2.23±0.19模型組 5 4.88±0.48＃埋線組 5 4.15±0.25*培哚普利組 5 3.22±0.17*IL-6（pg/mL）11.98±0.42 20.84±0.82＃17.57±1.44*15.47±0.83*TNF-α（pg/mL）12.69±0.84 27.05±1.10＃24.01±1.61*19.34±1.84*

表3 28 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

表3 28 d各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β濃度的變化（±s）

注：與偽手術(shù)組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

組別 n IL-1β（pg/mL）偽手術(shù)組 5 1.84±0.13模型組 5 5.91±0.56＃埋線組 5 3.21±0.28*培哚普利組 5 2.64±0.23*IL-6（pg/mL）10.58±0.65 22.65±1.10＃15.40±0.63*13.36±0.58*TNF-α（pg/mL）12.42±0.71 30.75±1.16＃20.38±1.85*15.16±0.60*

3.3 各時(shí)間點(diǎn)大鼠蛋白MerTK、p-MerTK表達(dá)水平比較 術(shù)后7、28 d，模型組大鼠MerTK蛋白表達(dá)明顯低于偽手術(shù)組（P<0.05），而p-MerTK蛋白表達(dá)高于偽手術(shù)組（P<0.05）。治療后7、28d兩治療組MerTK蛋白水平均高于模型組（P<0.05），而p-MerTK蛋白低于模型組（P<0.05）。MerTK、p-MerTK呈反比。見表4、圖3。

表4 7、28 d各組大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 7、28 d各組大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與偽手術(shù)組大鼠相比較，＃P＜0.05；與模型組大鼠比較，*P＜0.05。

7 d 28 d組別 n MerTK p-MerTK偽手術(shù)組 5 1.250±0.024 0.566±0.012 1.227±0.011 0.478±0.005 MerTK p-MerTK 1.154±0.014#埋線組 5 1.033±0.027*培哚普利組 5 0.898±0.013*模型組 5 0.894±0.016#0.926±0.018*1.111±0.009*1.247±0.004#0.664±0.007*0.687±0.274*0.736±0.013#0.826±0.010*1.049±0.198*

圖3 各組大鼠MerTK和p-MerTK表達(dá)

4 討論

在中醫(yī)學(xué)中心肌梗死屬“胸痹、真心痛”等范疇，本虛標(biāo)實(shí)乃該病病機(jī)[8]，在治療選穴中選用既是手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，又為八脈交會(huì)穴中通陰維脈的“內(nèi)關(guān)”，加上即可調(diào)節(jié)臟腑氣機(jī)又可扶正補(bǔ)虛的屬足膀胱經(jīng)之穴的背俞穴“心俞”[9]，兩穴合用可補(bǔ)心養(yǎng)氣、通脈止痛。本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)結(jié)扎大鼠LAD，術(shù)中被結(jié)扎處心肌組織變白、術(shù)后大鼠心電圖ST段抬高，提示心肌缺血受損，造模構(gòu)建成功，經(jīng)穴位埋線干預(yù)治療后7、28 d心肌細(xì)胞的排列、形態(tài)、大小、細(xì)胞核游離情況均有所改善，揭示穴位埋線對(duì)MI后的心肌細(xì)胞有一定的治療和保護(hù)效果，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課題前期研究結(jié)果大體相同[6]。

巨噬細(xì)胞是心臟中固有免疫細(xì)胞群的一種，在MI情況下被激活，巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞，其主要作用分別是促炎和抗炎。兩種分型的巨噬細(xì)胞參與了心肌梗死后的急性炎癥期、纖維增殖期和穩(wěn)定恢復(fù)期的全過程[10]。MI后的細(xì)胞和受損基質(zhì)釋放危險(xiǎn)信號(hào)激活先天免疫補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和促炎單核/巨噬細(xì)胞快速浸潤(rùn)在梗死區(qū)[11]，從而M1型巨噬細(xì)胞分泌大量IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子以促進(jìn)梗死的細(xì)胞清除，但心梗后炎癥的過度表達(dá)與不良心室重塑中的心肌肥大關(guān)系密切，心肌肥大增加了復(fù)發(fā)性心梗、心律失常、猝死等不良心肌事件的風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此，炎癥的精準(zhǔn)調(diào)控與巨噬細(xì)胞的平衡有望成為干預(yù)梗死后不良心室重構(gòu)的一種新方法和策略。MerTK是受體酪氨酸激酶Tyro-Axl-MerTK（TAM）家族成員之一，存在于巨噬細(xì)胞的表面[13]，其胞葬作用通過“識(shí)別我”“找到我”“吞噬我”發(fā)揮對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬和其代謝產(chǎn)物之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)炎癥的負(fù)向調(diào)控發(fā)揮抗炎效應(yīng)。有研究表明[14]MerTK基因缺乏的小鼠在敗血癥中，小鼠的TNF-α表達(dá)異常升高，Mer受體酪氨酸激酶信號(hào)能調(diào)節(jié)TNF-α等促炎因子的分泌，減輕因內(nèi)毒素引起的休克。Wan等[15]在心肌梗死小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)MerTK基因缺乏，凋亡心肌細(xì)胞會(huì)過多積累，心臟收縮功能受損，缺血壞死組織持續(xù)擴(kuò)大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中造模后7、28 d與偽手術(shù)組相比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著上升，MerTK蛋白水平著降低，p-MerTK蛋白水平明顯升高，經(jīng)穴位埋線和培哚普利7、28 d的治療后大鼠血清中 IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)下降，MerTK蛋白表達(dá)不同程度上升，p-MerTK蛋白水平不同程度下降。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們推測(cè)由于MerTK的減少，心梗后的大鼠巨噬細(xì)胞胞葬和橋接作用減弱，凋亡細(xì)胞不能迅速被識(shí)別，吞噬作用減慢，梗死心肌周圍被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致炎癥過度的表達(dá)。穴位埋線對(duì)心肌的保護(hù)作用可能與維持心肌組織內(nèi)巨噬細(xì)胞表面受體MerTK的水平，從而降低IL-6、TNF-α、IL-1β炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生介導(dǎo)炎癥消退相關(guān)。

綜上，“內(nèi)關(guān)”和“心俞”穴位埋線療法對(duì)MI治療效果優(yōu)良，可改善大鼠MI后心肌肥大橫截面積、減輕不良心室重塑，且有就診次數(shù)少、穴位刺激長(zhǎng)效、創(chuàng)傷疼痛相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì)，值得推廣。但目前我們只從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分分子機(jī)制出發(fā)，探討了其中的可能性，下一步我們將多維度出發(fā)，更長(zhǎng)期的有效性、針?biāo)幗Y(jié)合等優(yōu)效性觀察以及增加明確的信號(hào)通路和增加臨床試驗(yàn)將是我們后續(xù)重點(diǎn)。