腎不藏志型不寐模型大鼠相關(guān)組織IL-10、IL-1β的表達(dá)差異研究

陳 旭，張星平，梁瑞寧，王凱凱，梁政亭，閆德祺，王 慧

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830099）

失眠（insomnia）屬中醫(yī)“不寐病”范疇，指患者對自身睡眠總時長或睡眠質(zhì)量不滿足并影響次日日間社會活動功能的一種主觀體驗[1]。一項10萬人的大樣本流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國人群失眠患病率約為15%[2]，中老年占比約35.9%[3]。長期慢性失眠不僅會影響患者日常生活質(zhì)量，更會增加患者罹患心腦血管疾病及精神心理疾病的風(fēng)險，因此開展失眠的研究很有意義[4]。中醫(yī)藥治療失眠具有豐富的經(jīng)驗，據(jù)文獻(xiàn)報道[5]其總有效率均在80%以上，表明中醫(yī)藥治療失眠具有良好療效。然而由于各醫(yī)家臨證角度不同、辨證分型方法各異，導(dǎo)致后人依據(jù)前人臨床辨證論治經(jīng)驗很難得到良好臨床療效的問題長期存在，故很有必要探尋既符合中醫(yī)基本理論又方便客觀的不寐病辨證分型方法。

張星平教授在《內(nèi)經(jīng)》“五神臟”理論及歷代名家論著的啟發(fā)下，結(jié)合臨床經(jīng)驗及不寐患者臨床癥狀表現(xiàn)特征，提出中醫(yī)不寐五神分型診斷法[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)基于此法確立的五種不寐分型在多導(dǎo)睡眠圖分期特征方面存在差異[7]，其中以夜寐早寤為主要臨床表現(xiàn)特征的腎不藏志型不寐患者多導(dǎo)睡眠圖結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)出非快速眼動睡眠期（non-rapid eye movement，NREM）中N1、N2期較常人延長、快速眼動睡眠期（rapid eye movement，REM）較常人縮短的特征性變化[7]。同時還發(fā)現(xiàn)中醫(yī)不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上具有一致性[8]，這均表明了中醫(yī)不寐五神分型診斷法的科學(xué)性及客觀性。

失眠與機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)存在密切聯(lián)系，研究[9-10]表明失眠患者機(jī)體炎癥因子水平較正常對照組升高。IL-10作為一種多細(xì)胞源、多功能細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥及免疫抑制過程，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用[11]；IL-1β作為關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子，參與多種炎癥反應(yīng)及細(xì)胞活動，研究發(fā)現(xiàn)[12]失眠模型小鼠血清及腦組織IL-1β水平較正常組明顯升高。以上研究證明IL-10、IL-1β與失眠密切相關(guān)。本研究采用D-半乳糖（D-gal）聯(lián)合對氯苯丙氨酸（p-chlorophenylalanine，PCPA）構(gòu)建腎不藏志不寐模型大鼠[13]，以期探尋IL-10、IL-1β在腎不藏志型不寐模型大鼠相關(guān)組織中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 16只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（新）2018-0003。將16只大鼠隨機(jī)分為模型組與對照組，每組8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由進(jìn)食、飲水。SPF級飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，空氣潔凈度7級，晝夜明暗交替12 h/12 h，最小換氣次數(shù)≥15次/h。本項動物實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批后進(jìn)行，審批編號：IACUC20190116-01。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：Anti-IL-10 Antibody（DF6894，Affinity Biosciences）、Anti-IL-1Beta Antibody（AI08133511，Bioss）、中性樹膠（G8590，Solarbio）、免疫組織化學(xué)染色兔二步法試劑盒（2241D0401，中杉金橋）、DAB 試劑盒（218191011，中杉金橋）、EDTA 抗原修復(fù)液（C1034，Solarbio）、無水乙醇（20210901，天津致遠(yuǎn)）、二甲苯（20200920，天津致遠(yuǎn)）、多聚甲醛（50116，天津光復(fù)）。

儀器及軟件：真空干燥箱（DZF-6090，上海一恒）、電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-4，北京永光明）、輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（RM2235，Leica）、正置熒光生物顯微鏡（Eclipse Ni-U，Nikon）、NIS-Elements D 圖像采集 軟 件 （V5.01，Nikon）、Image J 圖 像 分 析 軟 件（V1.53，National Institutes of Health）。

1.3 制備腎不藏志型不寐大鼠模型及腦肌電檢測、戊巴比妥鈉翻正實驗 參考課題組前期研究[13]制備腎不藏志不寐模型大鼠：模型組大鼠先予D-gal 120 mg·kg-1·d-1行頸背部皮下注射，連續(xù) 42 d，后予 PCPA 300 mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續(xù) 3 d，共 45 d；模型組大鼠腦肌電圖特征呈現(xiàn)出與腎不藏志型不寐患者NREM期中N1、N2期較常人延長、REM期縮短的多導(dǎo)睡眠圖結(jié)構(gòu)參數(shù)變化特征[7]一致，且戊巴比妥鈉翻正實驗顯示睡眠潛伏期延長、總睡眠時間縮短時，則表明腎不藏志型不寐大鼠模型制備成功。正常組大鼠同期同等飼養(yǎng)環(huán)境下給予等體積0.9% NaCl溶液行相應(yīng)部位注射。

1.4 取材與組織包埋切片 模型組與正常組均使用7%水合氯醛溶液，以0.5 mL/100 g的劑量行腹腔注射麻醉，迅速取肝、心、脾、肺、腎、膀胱、大腸、腦組織，并先后行4%多聚甲醛沖洗固定、石蠟包埋及切片（厚度 4 μm）。

1.5 免疫組織化學(xué)染色與觀察 石蠟切片經(jīng)真空干燥箱65℃、120 min烤片后依次行二甲苯脫蠟、酒精復(fù)水、恒溫水浴鍋抗原修復(fù)、滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、滴加一抗（IL-10、IL-1β）孵育過夜、滴加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物、滴加DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、氨水返藍(lán)、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察臟器組織切片，2組各個組織均隨機(jī)觀察5張切片，每張切片隨機(jī)取3個視野，應(yīng)用Image J圖像分析軟件V1.53計算平均灰度值（IntDen/Area）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料平均灰度值行兩獨立樣本t檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠睡眠檢測各期差異 腦肌電圖分析結(jié)果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠覺醒時間增加（P＜0.05），NREM（1，2）期、REM 期縮短（P＜0.05），NREM（3，4）期無明顯差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明腎不藏志不寐大鼠模型構(gòu)建成功。見圖1和圖2。

圖1 2組大鼠各期睡眠時間比較

圖2 2組大鼠白天睡眠各期比較

2.2 2組大鼠戊巴比妥鈉翻正實驗結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠睡眠潛伏期延長、睡眠時間縮短（P＜0.05）。見圖3。

圖3 2組大鼠戊巴比妥鈉翻正實驗結(jié)果比較

2.3 2組大鼠臟器組織中IL-10的表達(dá)差異 成功構(gòu)建腎不藏志型不寐模型大鼠后使用免疫組織化學(xué)法測定（陰性細(xì)胞染色為藍(lán)色，陽性細(xì)胞染色為棕褐色），與正常組比較，模型組腎、腦、肺、大腸IL-10表達(dá)水平降低（P＜0.05），其中腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），肝、心、脾、膀胱IL-10表達(dá)水平2組未見明顯差異（P＞0.05）。見圖4和表1。

圖4 2組大鼠相關(guān)臟器組織中IL-10的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色）

表1 2組大鼠相關(guān)臟器組織中IL-10的表達(dá)水平差異（±s，n=8）

表1 2組大鼠相關(guān)臟器組織中IL-10的表達(dá)水平差異（±s，n=8）

組別 肝 心 脾 肺 腎 膀胱 大腸 腦正常組 0.37±0.04 0.33±0.03 0.48±0.03 0.60±0.05 0.50±0.05 0.44±0.06 0.55±0.03 0.38±0.03模型組 0.40±0.03 0.35±0.04 0.52±0.06 0.55±0.05 0.45±0.05 0.45±0.03 0.51±0.03 0.28±0.03 t值 1.703 1.042 1.677 2.165 -2.244 1.913 2.583 7.404 P值 0.108 0.313 0.113 0.046 0.039 0.074 0.02 <0.0001

2.4 2組大鼠臟器組織中IL-1β的表達(dá)差異 成功構(gòu)建腎不藏志型不寐模型大鼠后使用免疫組織化學(xué)法測定（陰性細(xì)胞染色為藍(lán)色，陽性細(xì)胞染色為棕褐色），模型組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-1β表達(dá)水平較正常組顯著升高（P＜0.05），其中以腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），2組大鼠肝、心、脾、膀胱組織中 IL-1β 表達(dá)水平未見明顯差異（P＞0.05）。見圖5和表2。

表2 2組大鼠相關(guān)臟器組織中IL-1β的表達(dá)水平差異（±s，n=8）

表2 2組大鼠相關(guān)臟器組織中IL-1β的表達(dá)水平差異（±s，n=8）

組別 肝 心 脾 肺 腎 膀胱 大腸 腦正常組 0.29±0.07 0.29±0.03 0.18±0.05 0.35±0.04 0.26±0.02 0.38±0.07 0.32±0.02 0.27±0.03模型組 0.31±0.10 0.29±0.01 0.21±0.03 0.42±0.10 0.31±0.04 0.38±0.10 0.34±0.02 0.45±0.03 t值 0.532 0.866 1.39 2.252 3.531 -0.051 2.769 12.859 P值 0.602 0.399 0.183 0.039 0.003 0.096 0.014 <0.0001

3 討論

中醫(yī)不寐五神分型診斷法是張氏在《內(nèi)經(jīng)》“五神臟”理論及歷代名家論著啟發(fā)下，結(jié)合不寐患者臨床癥狀表現(xiàn)特征及自身臨床經(jīng)驗所提出的，依據(jù)不寐患者臨床單一癥狀主訴確定不寐病五臟病位診斷的分型方法，該分型方法將不寐病分為5型[6]：以夢繞紛紜為主訴的肝不藏魂型；以入寐維艱為主訴的心不藏神型；以睡前思慮紛紜為主訴的脾不藏意型；以夜寐輕淺易寤或頻寤為主訴的肺不藏魄型；以夜寐早寤為主訴的腎不藏志型。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)基于此種分型方法確立的5種不寐分型不僅在多導(dǎo)睡眠圖分期特征方面存在差異[7]，同時中醫(yī)不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上亦具有一致性[8]，表明中醫(yī)不寐五神分型診斷法具有科學(xué)性及客觀性。此外，前期研究[7]表明腎不藏志型不寐患者的多導(dǎo)睡眠圖結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)出NREM期中N1、N2期較正常對照組延長、REM期較正常對照組縮短的特征性變化，在本次研究中作為評判腎不藏志型不寐模型大鼠構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)，此種模型評價標(biāo)準(zhǔn)已于課題組前期研究中得以驗證[13]。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》云：“人年四十，而陰氣自半也，起居衰矣?！薄端貑枴ど瞎盘煺嬲摗酚醒?，“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，腎精為人體先天之本，腎精充足，則腎之陰陽調(diào)和，五臟得以溫煦濡養(yǎng)，臟腑調(diào)和，五臟各安其位而睡眠得安，然人年過四十，腎臟精氣虛損，腎志不安則不寐[14-16]。故在本次研究中，課題組使用D-gal誘導(dǎo)大鼠快速衰老以造成“腎虛”，進(jìn)而使用PCPA誘導(dǎo)大鼠失眠，用此復(fù)合模型以構(gòu)建腎不藏志型不寐?！澳X腎相濟(jì)”，腦為髓海，精生髓，腎藏精，腎精充盛則腦髓充盈，腎精虧虛則髓海不充而變生諸癥。且腎為水臟，膀胱為水腑，兩者五行中同屬水，經(jīng)絡(luò)相互絡(luò)屬，構(gòu)成臟腑表里相合關(guān)系，因此本研究選取腎、心、腦、肝、脾、肺、膀胱作為腎不藏志型不寐研究的相關(guān)臟器組織。此外，研究[17]表明“微生物-腸-腦軸”與失眠存在密切聯(lián)系，腸道菌群可通過調(diào)節(jié)5-羥色胺、褪黑素等神經(jīng)遞質(zhì)水平影響下丘腦-垂體-腎上腺軸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能改變睡眠結(jié)構(gòu)參數(shù)，在這一過程中，腸道菌群易受腸道微小炎癥反應(yīng)影響[18]，故同時選擇大腸行腎不藏志型不寐基礎(chǔ)研究。

失眠是一種慢性應(yīng)激過程，可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸增加皮質(zhì)醇分泌，使患者免疫功能發(fā)生紊亂，加劇體內(nèi)微小炎癥反應(yīng)，其中以神經(jīng)炎癥反應(yīng)為著[17]。炎癥反應(yīng)對睡眠-覺醒周期調(diào)節(jié)具有重要作用，炎癥因子可改變神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生及重新攝取，影響下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，進(jìn)而改變睡眠-覺醒周期[19]。炎癥因子可分為促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6）與抗炎細(xì)胞因子（如 IL-10、IL-1Ra）兩類[9]，促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子動態(tài)平衡以維持正常免疫功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，其中一者發(fā)生異常變化皆會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理性改變。失眠與機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)具有直接聯(lián)系，IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，能反映慢性全身性炎癥反應(yīng)狀況，在炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用，其通過調(diào)節(jié)Th1類細(xì)胞因子來抑制炎癥反應(yīng)[11]。Hirotsu等[20]發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪小鼠較正常組小鼠體內(nèi)IL-10表達(dá)降低、IL-1β表達(dá)升高，亦有研究表明失眠患者血清促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)上調(diào)[21]?；谏鲜鑫墨I(xiàn)研究結(jié)果，課題組推測腎不藏志型不寐模型大鼠因相關(guān)臟器抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平降低、促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)水平升高而致機(jī)體炎癥因子釋放增多，進(jìn)而對睡眠-覺醒周期產(chǎn)生影響。課題組此次研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10表達(dá)水平較正常組降低（P＜0.05），IL-1β表達(dá)水平較正常組升高（P＜0.05），且均以腦組織變化最為顯著（P＜0.0001），此研究結(jié)果與文獻(xiàn)[20][22]發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪小鼠腦組織中IL-10表達(dá)降低、IL-1β表達(dá)升高一致。

總之，本項研究發(fā)現(xiàn)了腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10表達(dá)水平降低，而IL-1β表達(dá)水平升高，且均以腦組織變化最為顯著，表明腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10與IL-1β表達(dá)水平的變化主要與腦存在關(guān)聯(lián)，其次與腎、肺、大腸相關(guān)。腎不藏志型不寐模型大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-10與IL-1β表達(dá)水平的差異特點可能是腎不藏志型不寐炎癥因子的特征性變化之一。