輔酶A的生物合成途徑及其應(yīng)用

承朋利，吳勝，黃建忠*

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 工業(yè)微生物教育部工程中心，福建 福州 350108；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

20 世紀(jì)40年代，德裔美國生化學(xué)家Fritz Albert Lipman教授在研究胚胎細(xì)胞代謝時發(fā)現(xiàn)一種熱穩(wěn)定的分子，該分子具有乙?；渌镔|(zhì)的生物學(xué)活性，并將該分子命名為輔酶A（Coenzyme A，簡稱CoA），其中“A”代表乙?；钚浴?0年后，Lipman教授和合作者共同鑒定了CoA的分子結(jié)構(gòu)[1]。CoA的結(jié)構(gòu)如圖1所示，可以看作由一分子β-巰基乙胺，一分子泛酸以及一分子3’,5’-ADP組成，其中末端的巰基是其主要的活性基團。CoA是大多數(shù)生物體內(nèi)不可或缺的輔因子，其作為酰基載體和羰基激活基團在許多中心代謝的生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。據(jù)統(tǒng)計，在已鑒定的生化反應(yīng)中，約4 %的酶分子利用輔酶A作為特定的輔助因子，輔酶A也參與超過100種不同的中間代謝反應(yīng)[2]。

圖1 輔酶A結(jié)構(gòu)

1 輔酶A的生物合成途徑

1.1 經(jīng)典途徑

從泛酸到輔酶A的合成途徑在原核生物和真核生物體內(nèi)普遍存在。目前，公認(rèn)的CoA合成途徑[3]如圖2-A所示：⑴首先由泛酸激酶（PanK）催化泛酸的4’-OH磷酸化，形成4’-磷酸泛酸（P-Pan）；⑵經(jīng)由磷酸泛酰半胱氨酸合酶（PPCS）酶催化與半胱氨酸縮合，得到4’-磷酸泛酰半胱氨酸；⑶之后由磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶（PPCDC）進行脫羧得到4’-磷酸泛酰巰基乙胺；⑷后兩步分別由磷酸泛酰巰基乙胺腺苷?；D(zhuǎn)移酶（PPAT）催化腺苷?；霓D(zhuǎn)移形成脫磷酸-CoA和⑸去磷輔酶A激酶（DPCK）催化磷酸化得到CoA。在細(xì)菌中，這5種酶也被稱為CoaA、CoaB、CoaC、CoaD和CoaE，而在酵母中通常被稱為（CAB1-CAB5）。

圖2 輔酶A的生物合成途徑

最初，人們對于合成途徑的實際順序提出了2種不同的潛在途徑。這2種途徑的區(qū)別在于CoA泛酸部分4’-磷酸化的先后順序，即PanK的底物特異性。基于摩氏摩根菌和大鼠肝臟提取物都能只將4’-磷酸泛酸（而不是泛酸）與半胱氨酸耦合。這一研究發(fā)現(xiàn)，Brown最終制定了這一合成途徑[3]。

1.2 古生菌的生物合成途徑

在對古生菌中CoA合成途徑的研究中發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)的古生菌中磷酸泛酸生物合成途徑不同于真核生物和細(xì)菌。在大多數(shù)細(xì)菌和真核生物中，磷酸泛酸的合成是以泛解酸為底物通過泛酸合成酶（PS）和PanK酶的連續(xù)兩步催化合成[4]。在大多數(shù)的古生菌中由泛解酸激酶（PoK）和磷酸泛酸合成酶 (PPS）作為替代途徑[5]，如圖2-B。研究發(fā)現(xiàn)，該途徑在海洋共生菌中的亞群Entoporibacteria中也存在[6]，而對古生菌Picrophilus torridus的基因組的研究中也發(fā)現(xiàn)一種與細(xì)菌I型PanK同源性較遠(yuǎn)的PanK酶基因[7]。

1.3 挽救途徑

如1.1.1小節(jié)所述，輔酶A的生物合成途徑最初出現(xiàn)爭議的原因是生物體內(nèi)PanK酶也可以作用于泛酰巰基乙胺[8]，另外有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠利用泛酰巰基乙胺維持其CoA生物合成正常需求[9]。這些研究結(jié)果表明許多生物可以繞過PPCS和PPCDC兩種酶體，利用泛酰巰基乙胺為底物合成CoA，如圖2-C，這一途徑被稱其為挽救途徑，這一挽救途徑需要可以接受以泛酰巰基乙胺為底物的低底物特異性的PanK酶。

2 輔酶A的生化功能

CoA 獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使它被用來激活分解代謝和合成代謝反應(yīng)中的羧基，包括脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)、乙醇、膽汁酸和一些外源物質(zhì)的代謝，近期的研究發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)以及一些蛋白質(zhì)的修飾也需要輔酶A及其硫酯衍生物的參與[10]。

CoA 及其衍生物的異常生物合成與許多病理有關(guān)，包括糖尿病、神經(jīng)性退化、雷氏癥候群、維生素B12缺乏癥、心臟肥大和癌癥等疾病[11]。由于輔酶A的生物合成底物泛酸普遍存在于大多數(shù)食物以及腸道菌群中，因此與細(xì)胞內(nèi)CoA濃度異常相關(guān)的疾病通常與輔酶A合成酶相關(guān)基因的缺陷、CoA的降解或運輸有關(guān)[12]，如神經(jīng)退行性疾?。≒KAN）。還有一些研究表明CoA的異常會導(dǎo)致Aurora A激酶中與CoA相關(guān)的修飾失調(diào)，在感染瘧原蟲的紅細(xì)胞中，CoA的水平高于正常紅細(xì)胞，抗瘧原蟲的泛酸類似物并由此發(fā)展起來[13]。

3 輔酶A的生物合成途徑的應(yīng)用

輔酶A在生物代謝中的重要作用以及不同來源的輔酶A合成酶之間較大的差異性，使得人們對關(guān)于輔酶A合成途徑的研究產(chǎn)生了極大的興趣，加之相關(guān)研究證實一些微生物來源的PanK、PPAT和DPCK對底物衍生物具有高耐受性，使得輔酶A生物合成途徑在許多方面進行了應(yīng)用研究，從輔酶A自身的合成以及利用輔因子工程擴大CoA相關(guān)衍生物在細(xì)胞中的可用量，再到基于CoA生物合成途徑所探究的一系列相關(guān)抑制劑的研發(fā)。

3.1 CoA-輔因子工程

CoA 作為存在于生命所有領(lǐng)域不可缺少的輔因子，這一特性使得其成為一種在制藥、化妝品和臨床行業(yè)中有商業(yè)價值的化合物。不僅如此，CoA也是許多生化反應(yīng)過程中必不可少的?；d體和共底物，被應(yīng)用于許多生化反應(yīng)的研究中，但由于商用輔酶A成本較高，其規(guī)?；a(chǎn)也是一個亟待解決的問題。目前，輔酶A的合成方法中，利用全化學(xué)合成以及生物組織提取法存在著工藝復(fù)雜、收率低或者成本高、含量低等缺點，因此這兩種方法只在初期研究得較多。已報道的達(dá)到制備級的合成方法主要有兩種，一個是微生物發(fā)酵法，還有一個是化學(xué)酶法合成，表2匯總了目前已報道的不同合成方法中產(chǎn)率最高的幾種。

表2 輔酶A的不同合成方法

為避免CoA對泛酸激酶的抑制作用，研究者嘗試?yán)没瘜W(xué)方法對泛酸進行磷酸化。通過化學(xué)方法引入磷酸根基團存在著工序復(fù)雜，收率低等缺陷，本實驗室建立以泛酸為底物的體外四步酶法合成輔酶A的體系，通過引入對CoA反饋抑制不敏感的PanK酶，解決抑制問題。對反應(yīng)體系中的條件優(yōu)化后可合成輔酶A 65.8 mmol/L，即50.5 mg/mL，與現(xiàn)在已有的以泛酸為底物的合成方法相比產(chǎn)量有了很大的提高（4.6倍），與目前已報道的產(chǎn)業(yè)化方法相比提高了26倍。

CoA 生物合成途徑除了直接應(yīng)用于CoA合成的研究外，還可以通過CoA-輔因子工程可以增加細(xì)胞內(nèi)的CoA庫含量，增加輔酶A相關(guān)衍生物的可用量，以實現(xiàn)下游產(chǎn)品更高的生產(chǎn)率。輔酶A相關(guān)衍生物是多種生物合成途徑和多種生化反應(yīng)中必需的中間體，其中乙酰輔酶A是生物合成脂質(zhì)、聚酮、類異戊二烯、氨基酸和許多其他生物制品的關(guān)鍵代謝物前體，用于各種工業(yè)。丙二酰輔酶A也是脂肪酸和聚酮等物質(zhì)的生物合成相關(guān)途徑中的重要中間物。

羥基丁酸酯（3HB）是聚羥基丁酸酯（PHB）的單體，是一種多用途手性C4分子，3HB生成途徑的中心代謝物是輔酶A（CoA）的衍生物乙酰輔酶A。Younes S.和Awad D.在含有合成3HB途徑關(guān)鍵酶（乙酰乙酰輔酶A硫酶和乙酰乙酰還原酶）外源基因的大腸桿菌中分別過量表達(dá)4種不同類型的PanK酶基因（大腸桿菌 PanK1、構(gòu)巢曲霉菌 PanKII、小家鼠panK1β、枯草芽孢桿菌 panKIII）并評估其在合成3HB的影響。其中在含有小家鼠來源的PanK1β酶基因的菌株獲得最高的3HB滴度，使其滴度增加41%[19]。Kudo H和Ono S在含有PHB合成外源基因（聚羥基烷酸合成基因phaABC）的大腸桿菌中引入惡臭假單胞菌來源coaA基因（不受游離CoA和乙酰CoA抑制）。研究發(fā)現(xiàn)，在加入0.5 mmol/L的泛酸條件下，攜帶兩種基因的菌株與單獨攜帶pha基因相比積累量從18.4% 增加到29.0%。對細(xì)胞內(nèi)CoA的測定顯示，coaA基因的引入和CoA前體的加入極大地擴大了細(xì)胞內(nèi)CoA庫的大小，其中約95%的CoA被乙酰輔酶A占據(jù)，同時還觀察到從乙酰輔酶A到乙酸的過程受到抑制[20]。

可再生資源微生物發(fā)酵生產(chǎn)的生物燃料是化石燃料的重要替代品，而高級醇如丁醇被認(rèn)為是比生物乙醇更合適的燃料替代品。Schadeweg V.和Boles E在利用釀酒酵母的乙酰輔酶A衍生途徑建立正丁醇生物合成的研究中發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中的游離CoA水平明顯限制了正丁醇的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)通過過量表達(dá)來源于大腸桿菌的coaA基因（不受乙酰輔酶A的抑制）同時添加CoA前體泛酸可以增加乙酰CoA的合成，使正丁醇產(chǎn)量大幅度提高[21]。

在發(fā)酵酒精飲品中由酯類或高級醇類產(chǎn)生的風(fēng)味在感官質(zhì)量中起著關(guān)鍵作用，在釀酒酵母細(xì)胞中，酯類和高級醇類的合成受細(xì)胞內(nèi)輔酶A水平的顯著影響。Hong KQ和Fu XM通過在釀酒酵母中過表達(dá)其自身來源的CAB1、CAB3以及ATF1（乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶）使得乙酸乙酯、乙酸異戊酯等乙酸酯類物質(zhì)含量顯著升高，細(xì)胞中的正丙醇、甲基-1-丁醇、異戊醇、異丁醇和苯乙醇的含量也發(fā)生了不同的變化，因此通過CoA-輔因子工程調(diào)控乙酸酯和高級醇的合成[22]。

Olzhausen J.和Grigat M.為增加酵母中乙酰輔酶A的合成量，構(gòu)建了一株CAB1W331R（對乙酰輔酶A不敏感的突變體）基因與其他輔酶a生物合成相關(guān)基因（CAB2、CAB3、HAL3、CAB4和CAB5）聯(lián)合過表達(dá)的釀酒酵母菌株，與野生菌株相比，細(xì)胞內(nèi)CoA庫增加了15倍。在補充過量的泛酸后，CoA庫進一步提高2.3倍，這一研究可以用于改善依賴于乙酰輔酶A的生物合成途徑的有用工具[23]。

丙二酰輔酶A是脂肪酸生物合成和各種通過Claisen縮合一步延長兩個碳鏈的聚酮類物質(zhì)合成中重要的酰基供體，也是細(xì)胞中最豐富的輔酶A衍生物之一。在大多數(shù)生物體中，丙二酰輔酶A是由乙酰輔酶A羧化酶（ACC）催化的乙酰輔酶a羧化反應(yīng)合成的。Satoh S和Ozaki M在大腸桿菌中過表達(dá)惡臭假單胞菌來源的泛酸激酶（CoaA）和谷氨酸棒桿菌來源的乙酰輔酶a羧化酶（acc）促進CoA生物合成和丙二酰輔酶a供給，結(jié)果顯示脂肪酸的含量增加了7倍以上[24]。Milke L和Marienhagen J在此基礎(chǔ)上額外過表達(dá)脂肪酸合成酶（FasA），在23 ℃反應(yīng)條件下，F(xiàn)asA的泄漏表達(dá)使得油酸的積累量超過100 mg/L。這一結(jié)果表明這種方法可以有效地適用于生產(chǎn)有價值的脂肪酸，如二十碳五烯酸（C20:5 ω-3）和二十二碳六烯酸（C22:6 ω-3）等[25]。

3.2 以輔酶A酶學(xué)為靶點的藥物開發(fā)

自從證明磺酰胺類的抗菌藥物靶向與維生素B族葉酸生物合成有關(guān)的酶-二氫蛋白酶合酶（DHPS）[26]以來，輔因子生物合成途徑作為抗菌藥物發(fā)育的潛在靶標(biāo)，引起人們的注意。這種興趣取決于兩個重要因素：首先，輔酶A是維持生命的各種代謝反應(yīng)的必不可少的組成部分，其次，輔酶A的生物合成是通過B族維生素泛酸的生物轉(zhuǎn)化，在這一途徑中，人類宿主與病原體展現(xiàn)出足夠的差異性，因此可以作為選擇性靶向。

早在20世紀(jì)40年代，CoA合成途徑就被認(rèn)為是一種可能的藥物靶點[27]。盡管所有的CoA生物合成酶都可以是開發(fā)選擇性抑制劑的潛在靶標(biāo)，但因為大多數(shù)生物體（含有低底物特異性PanK酶的生物）能夠利用挽救途徑，一些酶可能會被繞過，加上細(xì)菌來源DPCK與人源雙功能輔酶A合酶（CoASy）的DPCK結(jié)構(gòu)域具有顯著的同源性[28]。因此兩種CoA生物合成酶（PanK和PPAT）得到了特別的關(guān)注，這兩種酶都在維持細(xì)胞內(nèi)CoA濃度方面起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

幾乎所有病原微生物中都存在coaA基因，而真核和原核生物的序列相似性極低，加上它們的動力學(xué)特性和調(diào)節(jié)方式存在一定的差異，因此針對PanK酶的結(jié)構(gòu)和特異性設(shè)計特異性抗病原菌的抑制劑成為了可能。1970年，Clifton等人首次報道了N-取代泛酸酰胺，泛酸的酰胺化物[29]其中多個化合物具有抗細(xì)菌、抗真菌或抗瘧原蟲活性，不過由于泛酸酰胺是在高效抗生素大量出現(xiàn)的時候被發(fā)現(xiàn)，因此并沒有得到重視。隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，與泛酸類似物的相關(guān)抗菌性的研究逐漸增多，Spry等人的一篇綜述中全面介紹了泛酸衍生物與各種PanK亞型相互作用的抑菌活性[30]。近年來，在對抗結(jié)核藥物的研究中發(fā)現(xiàn)一種由EthA單加氧酶激活的前體藥物，在對其作用靶點的研究發(fā)現(xiàn)，該藥物的活性代謝物可同時靶向CTP合成酶PyrG和PanK[31]，以這兩種酶作為雙靶點的藥物篩選也被認(rèn)為具有鑒定新抗結(jié)核藥物的潛力[32]。

在設(shè)計PPAT酶的抑制劑時，研究人員嘗試基于底物P-PanSH的結(jié)構(gòu)設(shè)計、合成并測試了針對EcPPAT的二肽庫中篩選[33]，但由于膜對分子的不滲透性，對細(xì)胞無活性。2008年的兩篇專利報道了兩種衍生物：四氫-異喹啉衍生物[34]、四氫-β-咔啉衍生物[35]被認(rèn)為可作為靶向細(xì)菌的PPAT酶的抗菌劑。隨著生物相關(guān)研究技術(shù)的不斷提高，大量基于酶結(jié)構(gòu)的虛擬對接以及大量化合物文庫的多維片段的高通量篩選抑制劑的研究發(fā)表出來[36]。針對CoA合成途徑中的其他酶的相關(guān)研究，2020年研究人員針對細(xì)菌的PPCS酶篩選CoA合成抑制劑，從脂肪素類分子中分離出新的抗生素[37]。2021年，研究者通過高通量篩選獲得一種直接靶向結(jié)核分枝桿菌PPCS酶的底物非競爭抑制劑[38]，并對該抑制劑的作用機制進行研究。在Spry和同事的另一篇綜述[39]中對CoA合成酶的序列同源性和開發(fā)瘧原蟲特異性化合物的潛力得到了詳細(xì)的介紹。2022年，Nurkanto A通過對大型化合物文庫的高通量篩選鑒定惡性瘧原蟲的去磷酸輔酶A激酶的選擇性抑制劑[40]。

除了直接靶向一種或多種Pan或CoA生物合成酶用于抑制劑開發(fā)外，另一種可能的替代方法是利用各自途徑前體的結(jié)構(gòu)類似物，它們的中間體或最終產(chǎn)物可作為抑制劑。這種抗代謝物策略通過干擾與一種或幾種CoA生物合成酶或CoA依賴性酶緊密相關(guān)的結(jié)構(gòu)，從而對其產(chǎn)生抑制作用[41]。相關(guān)化合物研究最多的泛酸類似物之一是N-戊基泛酰胺（N5-Pan），研究發(fā)現(xiàn)N5-Pan通過CoA合成途徑形成無活性CoA類似物乙基CoA，該物質(zhì)通過與PanZ結(jié)合，影響PanD對天冬氨酸的脫羧作用以及泛酸的合成[42]。最近，一類以利用輔酶A相關(guān)酶為靶點的反酰胺鍵的N取代泛酸酰胺類似物（iPanAms）MMV693183進入了抗瘧疾的臨床前開發(fā)[43]。Moolman等人最近的一篇綜述則討論了CoA生物合成酶作為開發(fā)抗微生物藥物的新靶點[28]。Strauss等人在2020年的一篇綜述中詳細(xì)介紹了靶向泛酸和輔酶A的合成途徑設(shè)計的抗結(jié)核藥物的開發(fā)及它們作為藥物靶點的適用性評估[44]。

一些研究發(fā)現(xiàn)CoA生物合成途徑也可用于特定酶抑制劑的生物激活的例子。一種前體藥物可在糞腸球菌中轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的輔酶A衍生物，該分子會抑制氨基糖苷類耐藥酶，從而使耐藥菌株對氨基糖苷類藥物重新敏感[45]。Hammerer等人報道了一種泛酸酰胺類似物，利用CoA生物合成途徑在細(xì)胞中生成衣錐酸酯降解抑制劑[46]以恢復(fù)腸道沙門氏菌對內(nèi)源抗菌活性分子衣錐酸酯的敏感性。Duncan D和Auclair K對比了不同類型的PanK對泛酸酰胺衍生物的不同敏感度以及底物廣泛性[47]。

4 總結(jié)與展望

輔酶A作為生命所有領(lǐng)域中重要的輔因子，隨著輔酶A生物合成途徑的重建以及合成途徑中關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)及功能的解析，輔酶A在細(xì)胞代謝中的重要作用以及合成途徑的應(yīng)用得到廣泛性研究。近年來，對耐藥菌株的大量出現(xiàn)以及不同物種間輔酶A合成途徑酶的差異性的深入研究使得輔酶A生物合成途徑已經(jīng)成為開發(fā)針對微生物系統(tǒng)的抗生素的潛在靶點。目前針對以輔酶A合成途徑酶為靶點的抑制劑研究以及利用輔酶A合成途徑作為抑制劑前體激活的大量相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)表出來。未來，通過建立高效且具有針對性的抗菌抑制劑的篩選方法，將開發(fā)出更多以輔酶A為導(dǎo)向的穩(wěn)定性好、可溶性高、選擇性強且高效的抗致病微生物的靶向藥物。