間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體作為藥物遞送載體在癌癥治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉亭弦 葉苗苗 朱雪瓊

化療是最常見的癌癥治療方法之一，但是傳統(tǒng)化療藥物存在低靶向性、長期使用易產(chǎn)生耐藥性、隨劑量增加毒副反應(yīng)增加等不足，限制了其在癌癥治療上的應(yīng)用[1-2]。近年來，納米藥物載體系統(tǒng)在癌癥治療中的應(yīng)用得到學(xué)者們的重視，納米藥物載體系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、藥物緩釋性、高傳遞效率、生物相容性、靶向性等諸多優(yōu)勢，不僅可以提高藥物治療效果，還可以減少化療藥物對全身的毒副反應(yīng)[3]。但是納米顆粒載藥系統(tǒng)對腫瘤的靶向性尚需進(jìn)一步提高，同時需關(guān)注納米顆粒的安全性[4]。

外泌體（exosomes，EXOs）是由細(xì)胞分泌的納米囊泡，直徑約30～150 nm，具有低免疫原性、循環(huán)穩(wěn)定性、高生物相容性、低細(xì)胞毒性以及強(qiáng)血腦屏障穿透能力等特征[5]。近年來，越來越多的學(xué)者將其作為天然來源的納米材料用于傳遞藥物治療癌癥[6-9]。但是天然EXOs 的靶向性仍有不足，進(jìn)入體內(nèi)后容易被機(jī)體清除或被非靶向細(xì)胞攝取，為了使藥物更加精準(zhǔn)地遞送到靶向組織，目前多位學(xué)者對EXOs 進(jìn)行了修飾改造，使EXOs 在疾病治療中展現(xiàn)出更大潛力[10-13]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來源于人體多種組織，如骨髓、脂肪組織、胎盤、羊水、臍帶等，具有不受限制的自我更新能力[2,5]。MSCs 來源的EXOs（MSCs-EXOs）有多種提取方式，目前常用的方法包括超速離心法、等密度梯度離心技術(shù)、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀法、超濾法、免疫親和捕獲法、基于微流控的分離方法等[14]。MSCs-EXOs 可以到達(dá)大多數(shù)的腫瘤部位，在腫瘤治療方面有很好的應(yīng)用前景[15-16]。目前，有學(xué)者比較了腫瘤細(xì)胞來源的EXOs 與MSCs-EXOs 在腫瘤治療上的作用，發(fā)現(xiàn)MSC-EXOs 具有更好的腫瘤靶向性和聚集性[17]。因此，本文就MSCs-EXOs 作為藥物遞送載體在癌癥治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述，并對其發(fā)展進(jìn)行展望。

1 骨髓MSCs（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）-EXOs 裝載阿霉素（doxorubicin，DOX）在癌癥治療中的應(yīng)用

DOX 是廣泛用于癌癥治療的藥物之一，但其對心肌有嚴(yán)重的損害，故增加藥物的靶向性，減少藥物對心肌的損傷有重要的臨床意義[18]。

1.1 藥物攝取及毒性的研究 Gomari 等[19]將DOX 裝載到BMSCs-EXOs 中，構(gòu)建出BMSCs-EXOs-DOX 納米載藥體系。隨后將BMSCs-EXOs-DOX 與小鼠乳腺癌細(xì)胞TUBO 共培養(yǎng)，通過觀察595 nm 處DOX 的熒光發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs-DOX 能被小鼠乳腺癌細(xì)胞TUBO 攝取并在細(xì)胞核內(nèi)積累。Gomari 等[20]在乳腺癌細(xì)胞BT-474 上也進(jìn)行了相似的研究，將BMSCs-EXOs-DOX 與乳腺癌BT-474 細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，發(fā)現(xiàn)DOX 被乳腺癌細(xì)胞BT-474 攝取并在細(xì)胞核內(nèi)積累。以上實(shí)驗(yàn)提示BMSCs-EXOs 能被乳腺癌細(xì)胞攝取，可以作為藥物遞送載體。Gomari 等[20]分別用不同濃度的DOX、BMSCs-EXOs-DOX 及PBS（對照）培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞BT-474 和MDA-MB-231 后，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測24、48 h 的細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX 組與BMSCs-EXOs-DOX組均能顯著降低乳腺癌細(xì)胞活力，且兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示BMSCs-EXOs 作為藥物載體并沒有改變DOX 對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。以上研究結(jié)果表明BMSCs-EXOs 作為DOX 的藥物載體能被乳腺癌細(xì)胞攝取且不改變藥物本身對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

1.2 藥物釋放潛力的研究 Wei 等[21]將DOX 裝載到BMSCs-EXOs 中，分別在pH 4.5（模擬晚期腫瘤細(xì)胞酸性環(huán)境）和7.4（模擬生理環(huán)境）的PBS 中監(jiān)測BMSCs-EXOs-DOX 在36 h 內(nèi)的藥物釋放情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BM‐SCs-EXOs-DOX 在酸性環(huán)境中的藥物釋放速率、效率均高于生理環(huán)境下。提示晚期腫瘤細(xì)胞的酸性環(huán)境可以加速BMSCs-EXOs-DOX 載藥系統(tǒng)中藥物的釋放，表明了BMSCs-EXOs 作為藥物載體在惡性腫瘤治療方面具有優(yōu)勢。

1.3 腫瘤治療效果的研究 Gomari 等[19]將小鼠乳腺癌TUBO 細(xì)胞與不同濃度的BMSCs-EXOs-DOX 及DOX共孵育24、48、72 h，采用MTT 法檢測細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)TUBO 細(xì)胞活力隨著DOX 濃度的增加而逐漸降低；藥物作用24、48 h 后，BMSCs-EXOs-DOX 和DOX 處理組的TUBO 細(xì)胞活力無明顯差異，但是藥物作用72 h 后，BMSCs-EXOs-DOX 處理組的TUBO 細(xì)胞活力較DOX 組明顯降低，這提示BMSCs-EXOs 作為載體在72 h 可以提高DOX藥物對小鼠乳腺癌細(xì)胞TUBO 的殺傷作用。

Wei 等[21]將骨肉瘤細(xì)胞MG63 分別與DOX、BMSCs-EXOs-DOX 共孵育1、4、24 h，經(jīng)DAPI 染色后（BMSCs-EXOs 為綠色、DOX 為紅色）用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs-DOX 能率先進(jìn)入到細(xì)胞核；隨后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)DOX 的熒光信號，發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-DOX 組熒光強(qiáng)度高于DOX 組，提示骨肉瘤細(xì)胞對BMSCs-EXOs-DOX 的攝取效率更高。但在心肌細(xì)胞H9C2 中卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對BMSCs-EXOs-DOX 的攝取較DOX 少。將MG63 細(xì)胞與BMSCs-EXOs-DOX 及DOX共孵育24 h，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測半數(shù)抑制濃度（the half maximal inhibito‐ry concentration，IC50）值，結(jié)果顯示BMSCs-EXOs-DOX對MG63 細(xì)胞的抑制作用比DOX 強(qiáng)（DOX 和BMSCs-EXOs-DOX 的IC50值分別為10.13、6.48 μg/ml），然而在心肌細(xì)胞H9C2 上卻發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-DOX 對心肌細(xì)胞的抑制作用明顯弱于DOX 組（DOX 和BMSCs-EXOs-DOX 的IC50值分別為7.312、29 μg/ml）。以上實(shí)驗(yàn)提示BMSCs-EXOs 作為載體可以提高骨肉瘤細(xì)胞對藥物的攝取，同時降低藥物對心肌細(xì)胞的毒副反應(yīng)。

1.4 對修飾后的BMSCs-EXOs 載藥系統(tǒng)的研究

1.4.1 體外研究 Bagheri 等[22]采用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺交聯(lián)法（EDC/NHS 法）將羧酸修飾的黏蛋白1（mucin1，MUC1）適配體與BMSCs-EXOs 共價偶聯(lián)，制備出MUC1 靶向的BMSCs-EXOs（MUC1-BMSCs-EXOs）。隨后將DOX 裝載到MUC1-BMSCs-EXOs 及BMSCs-EXOs 中，采用MTT 法檢測不同濃度DOX、BMSCs-EXOs-DOX 和MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 對人乳腺癌細(xì)胞MCF7 的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-DOX 對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用弱于相同藥物濃度的MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 組（DOX 藥物濃度分別為15、7.5、3.75、1.875、0.937、0.468 μg/ml），這證明了經(jīng)過MUC1 配體修飾的BMSCs-EXOs 與BMSCs-EXOs相比有更好的抑制乳腺癌效果。研究者采用流式細(xì)胞術(shù)評估人乳腺癌細(xì)胞MCF7 對DOX、BMSCs-EXOs-DOX 及MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 的攝取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞對MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 的攝取更多，這提示MUC1 配體修飾的BMSCs-EXOs 能更精準(zhǔn)的遞送藥物至乳腺癌組織。

Gomari 等[20]的研究也同樣證實(shí)了經(jīng)過修飾的BM‐SCs-EXOs 有更強(qiáng)的靶向能力。研究者通過轉(zhuǎn)染制備出表達(dá)人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的BMSCs（HER2-BMSCs），隨后將DOX 裝載到HER2-BMSCs 來源的EXOs 中（HER2-BMSCs-EXOs-DOX），用PKH67 分別標(biāo)記BM‐SCs-EXOs-DOX 和HER2-BMSCs-EXOs-DOX，并分別將其與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（HER2-）、SKBR3（HER2+）和BT-474（HER2+）共孵育24 h。隨后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)HER2-BMSCs-EXOs-DOX 與HER2+乳腺癌細(xì)胞BT-474 的結(jié)合率為37.21%，明顯高于BMSCs-EXOs-DOX 與癌細(xì)胞的結(jié)合率（8.37%），表明HER2-BMSCs-EXOs-DOX 對HER2+乳腺癌細(xì)胞的靶向作用。

Gomari 等[19]對HER2-BMSCs-EXOs-DOX 及BM‐SCs-EXOs-DOX 兩種載藥系統(tǒng)進(jìn)行了對比研究。將小鼠乳腺癌細(xì)胞TUBO（HER2+）和4T1（HER2-）分別與被PKH67 染料標(biāo)記HER2-BMSCs-EXOs 和BMSCs-EXOs、PBS、牛血清白蛋白共孵育，隨后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明HER2-BMSCs-EXOs-DOX 與HER2+乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合率比HER2-乳腺癌細(xì)胞要高，提示，經(jīng)過修飾的BMSCs-EXOs 能更加精準(zhǔn)地遞送藥物到HER2+乳腺癌細(xì)胞。

1.4.2 體內(nèi)研究 Bagheri 等[22]構(gòu)建荷瘤結(jié)腸癌細(xì)胞C26 裸鼠模型，并選取腫瘤體積為200 mm3的荷瘤小鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射DOX、BMSCs-EXOs-DOX、MUC1-BMSCs-EXOs-DOX，6、24 h 后采集并測量各組心、肝、脾、肺、腎等重要器官以及腫瘤組織內(nèi)的熒光信號，發(fā)現(xiàn)MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 組在腫瘤部位的熒光強(qiáng)度明顯高于BMSCs-EXOs-DOX 組，且BMSCs-EXOs-DOX 組和MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 組在心臟組織中的熒光強(qiáng)度低于DOX 組，表明MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 能更多被結(jié)腸癌組織攝取，且BMSCs-EXOs 作為DOX 的載體可以減少心肌細(xì)胞攝取DOX。為了研究DOX、BMSCs-EXOs-DOX、MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 對荷瘤小鼠腫瘤生長、體重變化情況和存活率的影響，研究者在腫瘤長至100～200 mm3時，將小鼠隨機(jī)分為4 組，每組5 只，分別尾靜脈注射DOX、BMSCs-EXOs-DOX、MUC1-BMSCs-EXOs-DOX、PBS（對照）治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 組小鼠結(jié)腸癌生長抑制率為65%，明顯高于DOX 組和BM‐SCs-EXOs-DOX 組的腫瘤生長抑制率（16%、25%）；動態(tài)監(jiān)測小鼠的體重后，并未發(fā)現(xiàn)MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 與BMSCs-EXOs-DOX 組小鼠體重出現(xiàn)下降趨勢，提示MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 與BMSCs-EXOs-DOX 組有較好的生物安全性，而DOX 組（12%）和對照組（14%）小鼠的體重均有下降趨勢，考慮可能是藥物的全身毒性和對照組小鼠腫瘤惡病質(zhì)導(dǎo)致的。治療30 d 后評估小鼠生存情況，發(fā)現(xiàn)MUC1-BMSCs-EXOs-DOX 組小鼠均存活，而BMSCs-EXOs-DOX 和DOX 組有3 只死亡，對照組所有老鼠均死亡。以上結(jié)果提示MUC1 配體修飾的BMSCs-EXOs 有更強(qiáng)的結(jié)腸癌靶向能力、更好的腫瘤治療效果和生物安全性。

Gomari 等[19]通過動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HER2-BM‐SCs-EXOs 與BMSCs-EXOs 相比有更強(qiáng)的腫瘤靶向能力，研究者構(gòu)建出荷瘤HER2+乳腺癌細(xì)胞TUBO B6 裸鼠模型，當(dāng)腫瘤生長至400 mm3時，隨機(jī)選取3 只小鼠，分別尾靜脈注射HER2-BMSCs-EXOs-DOX、BMSCs-EXOs-DOX、PBS（對照），在注射后60 min 采用活體成像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)HER2-BMSCs-EXOs-DOX 和BMSCs-EXOs-DOX 組腫瘤部位的熒光強(qiáng)度均高于對照組，且HER2-BMSCs-EXOs-DOX 組熒光強(qiáng)度高于BMSCs-EXOs-DOX 組，這提示HER2-BMSCs-EXOs-DOX 能更好地靶向乳腺癌組織。為了進(jìn)一步研究修飾后的BMSCs-EXOs 的乳腺癌治療效果，研究者將腫瘤體積為100 mm3的荷瘤小鼠隨機(jī)分為4 組，每組4 只，分別尾靜脈注射HER2-BMSCs-EXOs-DOX、BMSCs-EXOs-DOX、DOX、PBS（對照），2 次/周，持續(xù)5 次，在每次注射后測量小鼠體重以及腫瘤體積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受HER2-BMSCs-EXOs-DOX 治療的小鼠的腫瘤生長速度比其余各組小鼠均慢，提示HER2-BMSCs-EXOs 裝載藥物后，對HER2+乳腺癌有更好的腫瘤治療效果。

2 BMSCs 裝載紫杉醇（paclitaxel，PTX）在癌癥治療中的應(yīng)用

PTX 是一種天然的抗癌藥物，在各種癌癥中均為最常用的化療藥物之一，但因其治療的耐藥性以及毒副反應(yīng)限制了其應(yīng)用，因此采用適當(dāng)?shù)妮d體遞送PTX到腫瘤局部后再發(fā)揮抑癌作用顯得尤為重要[23]。

2.1 體外研究 Zhou 等[24]將PTX 以及吉西他濱單磷酸鹽（gemcitabine monophosphate，GEMP）裝載到BM‐SCs-EXOs 中，構(gòu)建出BMSCs-EXOs-GEMP-PTX，隨后將人胰腺癌細(xì)胞MiaPaca-2 分別與BMSCs-EXOs、GEMP、BMSCs-EXOs-GEMP、GEMP+nab-PTX（nab-PTX 是一種商業(yè)化的靶向納米藥物）、BMSCs-EXOs-GEMP-PTX 共孵育48 h 后，采用MTT 法檢測各組對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明BMSCs-EXOs-GEMP-PTX 對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用最為顯著；隨后采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組對細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組凋亡率分別是：BMSCs-EXOs-GEMPPTX組（39.81±1.42）%、BMSCs-EXOs組（1.10±0.44）%、GEMP（10.96±1.30）%、BMSCs-EXOs-GEMP組（16.00±1.96）%、GEMP+nab-PTX 組（33.02±1.22）%。結(jié)果表明，BMSCs-EXOs-GEMP-PTX 組的胰腺癌細(xì)胞凋亡率顯著高于其他組，同時發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-GEMP-PTX組對細(xì)胞周期的抑制作用也明顯增加。

2.2 體內(nèi)研究 Zhou 等[24]在裸鼠胰腺內(nèi)注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染熒光素酶的MiaPaca-2 細(xì)胞，構(gòu)建胰腺導(dǎo)管腺癌小鼠模型，將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只，分別每隔3 d靜脈注射BMSCs-EXOs、GEMP、BMSCs-EXOs-GEMP、GEMP+nab-PTX、BMSCs-EXOs-GEMP-PTX，每隔5 d測量腫瘤體積并記錄，觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-GEMPPTX 組腫瘤生長最為緩慢，而BMSCs-EXOs-GEMP 組腫瘤生長速度慢于GEMP 組；研究者于開始治療的第27 天從每組隨機(jī)選取3 只小鼠處死，取小鼠的主要臟器（心、肝、脾等）進(jìn)行HE 染色，觀察發(fā)現(xiàn)各組臟器均未見明顯變化；取腫瘤組織進(jìn)行TUNEL 和Ki-67 染色發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs-GEMP-PTX 組胰腺癌細(xì)胞凋亡數(shù)量最多、增殖活性最低。將剩余的小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至死亡，獲得各組小鼠的生存曲線，觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs-EXOs-GEMP-PTX 組小鼠生存期最長。以上結(jié)果均表明，BMSCs-EXOs 作為PTX 載體在體內(nèi)發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤能力。

2.3 對修飾后的MSCs-EXOs 載藥系統(tǒng)的研究 目前的研究發(fā)現(xiàn)MSCs-EXOs 存在提取較困難、產(chǎn)量偏低等不足，故有研究者提出了外泌體擬態(tài)囊泡（exosome mimetics，EMs）的設(shè)想，將其作為藥物傳遞系統(tǒng)具有EXOs 的優(yōu)點(diǎn)，同時具有制備簡單、產(chǎn)量大的優(yōu)勢，臨床應(yīng)用前景廣[25]。

Kalimuthu 等[26]認(rèn)為BMSCs-EMs 裝載藥物對腫瘤也有較好的抑制作用。研究者將PTX 裝載到BMSCs-EMs 中，隨后將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 分別與不同濃度的BMSCs-EMs-PTX 和BMSCs-EMs 共培養(yǎng)24、48 h，發(fā)現(xiàn)BMSCs-EMs 并不影響乳腺癌細(xì)胞活力，而BMSCs-EMs-PTX 作用組癌細(xì)胞活力隨著PTX 藥物濃度的增加而降低。進(jìn)一步采用MTT 法評估各組對乳腺癌細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EMs 并不影響乳腺癌細(xì)胞存活狀況，而BMSCs-EMs-PTX 可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。以上實(shí)驗(yàn)表明BMSCs-EMs 作為藥物載體在乳腺癌治療中是安全的，同時可以攜帶PTX 并將其遞送到乳腺癌細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長。隨后，研究者構(gòu)建荷瘤乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 裸鼠模型，并將小鼠隨機(jī)分為3 組，分別于第1 天、第5 天瘤內(nèi)注射BMSCs-EMs、BMSCs-EMs-PTX 及PBS（對照），連續(xù)觀察腫瘤生長曲線后發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EMs-PTX 組腫瘤生長速度與其余組相比明顯減慢；在第8天處死小鼠，剝離腫瘤并稱重后發(fā)現(xiàn)BMSCs-EMs-PTX 組的腫瘤重量明顯輕于其余各組。提示BMSCs-EMs-PTX 在乳腺癌的治療中有較好的效果。

3 BMSCs 裝載去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）在癌癥治療中的應(yīng)用

3.1 藥物釋放潛力的研究 Liang 等[27]采用電穿孔法將NCTD 裝載到BMSCs-EXOs 中，隨后在模擬正常體液環(huán)境[（37±1）℃，pH 7.4）]和腫瘤環(huán)境[（42±1）℃，pH 5.8）]的條件下，比較NCTD 和BMSCs-EXOs-NCTD的體外釋放水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常體液環(huán)境中，BMSCs-EXOs-NCTD 組的藥物釋放（36 h 藥物釋放率79.84%）比NCTD 組（10 h 藥物釋放率93.02%）緩慢，這表明BMSCs-EXOs 裝載NCTD 后使藥物具有一定的緩釋性。而在模擬腫瘤環(huán)境的條件下，BMSCs-EXOs-NCTD 組的48 h 藥物釋放量（80.78%）比正常體液環(huán)境（72.14%）明顯增多，這說明腫瘤環(huán)境能促進(jìn)干細(xì)胞來源EXOs 攜帶藥物的釋放。

3.2 腫瘤治療效果的研究 Liang 等[27]將人肝癌細(xì)胞HepG2 與BMSCs-EXOs、無血清培養(yǎng)基（對照）以及不同濃度的NCTD、BMSCs-EXOs-NCTD 共孵育24 h，隨后采用CCK-8 法檢測各組對肝癌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，NCTD 組和BMSCs-EXOs-NCTD 組的肝癌細(xì)胞活力隨著藥物濃度的增加而降低，且相同濃度的BMSCs-EXOs-NCTD 與NCTD 相比對肝癌細(xì)胞活力的抑制作用更明顯，提示BMSCs-EXOs 和NCTD 對肝癌細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用；同時發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs-NCTD 組對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用比對照組（無血清培養(yǎng)基）、BMSCs-EXOs 組、NCTD 組均明顯；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs-EXOs-NCTD 組凋亡率明顯高于NCTD 組，且BMSCs-EXOs-NCTD 組G2期細(xì)胞比例與NCTD 組相比明顯增加。隨后研究者構(gòu)建荷瘤肝癌細(xì)胞HepG2 雄性裸鼠模型，30 d 后將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3 組，每組5 只，分別每3 d通過尾靜脈注射NCTD、BMSCs-EXOs-NCTD、0.9%氯化鈉溶液（對照），治療結(jié)束后取肝臟腫瘤，發(fā)現(xiàn)NCTD 組和BMSCs-EXOs-NCTD 組與對照組相比均能明顯抑制腫瘤生長，且BMSCs-EXOs-NCTD 的抑制效果最好。隨后取小鼠主要器官（心、肝、腎、脾）和腫瘤組織進(jìn)行HE 染色并觀察，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的荷瘤小鼠肝臟損傷嚴(yán)重（癌癥損傷），經(jīng)NCTD 治療的小鼠肝臟和腎臟均有一定程度的損傷（肝、腎損害是NCTD 最主要的毒副反應(yīng)），而經(jīng)BMSCs-EXOs-NCTD 治療的小鼠各主要器官組織均未見明顯損傷。表明BMSCs-EXOs作為藥物載體對肝癌有更好的治療效果，同時可以減輕NCTD 對肝腎損害等毒副反應(yīng)。

4 MSCs-EXOs 裝載和厚樸酚（Honokiol）在癌癥治療中的應(yīng)用

4.1 對藥物攝取的研究 Kanchanapally等[28]將Honoki‐ol 裝載到MSCs-EXOs 中，分別將胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa和Colo357 與MSCs-EXOs-Honokiol、Honokiol 共孵育4 h，采用質(zhì)譜法測定藥物在兩種胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的積聚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)MSCs-EXOs-Honokiol 處理的胰腺癌細(xì)胞內(nèi)藥物積累比Honokiol 組明顯增加（胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa 內(nèi)藥物濃度增加3.64 倍，而在胰腺癌細(xì)胞Colo357 內(nèi)藥物濃度增加4.68 倍），這提示MSCs-EXOs-Honokiol 能更有效地遞送藥物。

4.2 腫瘤治療效果的研究 Kanchanapally 等[28]將多種（胰腺、乳腺、卵巢、結(jié)腸和前列腺）癌細(xì)胞系與Honoki‐ol、MSCs-EXOs-Honokiol 共孵育72 h 后分別測定IC50值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs-EXOs-Honokiol 對癌細(xì)胞的殺傷力是Honokiol 的4～5 倍；隨后將胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa 和Colo357 與不同濃度的Honokiol、MSCs-EXOs-Honokiol共孵育2 周后檢測胰腺癌細(xì)胞克隆變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞的克隆性隨著藥物濃度的增加而降低，且MSCs-EXOs-Honokiol 組細(xì)胞克隆數(shù)較Honokiol 組少。將Colo357 細(xì)胞分別與MSCs-EXOs、Honokiol、MSCs-EXOs-Honokiol 及單純培養(yǎng)基（對照）共孵育24 h 后，采用流式細(xì)胞術(shù)測定各組細(xì)胞周期分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs-EXOs 組對細(xì)胞周期沒有影響，而MSCs-EXOs-Honokiol 組處于G1期的胰腺癌細(xì)胞與其他組相比積累增多，且復(fù)制S 期細(xì)胞數(shù)量減少；用細(xì)胞活死實(shí)驗(yàn)檢測各組對細(xì)胞存活的影響后發(fā)現(xiàn)，MSCs-EXOs-Honokiol 組胰腺癌細(xì)胞死亡率比Honokiol 組高，同時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2、CDK4 表達(dá)和抗凋亡蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤2 蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、特大型B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcell lymphoma-extra large，Bcl-xL）表達(dá)均明顯減少，而p21 和細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（B-cell lympho‐ma-2associated X protein，Bax）的表達(dá)明顯增加。提示MSCs-EXOs-Honokiol 可以通過改變細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

5 人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞（human endometrial stem cells，hEnSCs）來源的EXOs（hEnSCs-EXOs）裝載阿托伐他?。╝torvastatin，Ato）在癌癥治療中的應(yīng)用

Nooshabadi 等[29]將Ato 裝載到hEnSCs-EXOs 中，構(gòu)建出hEnSCs-EXOs-Ato。利用熒光標(biāo)記技術(shù)對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 攝取hEnSCs-EXOs-Ato 的情況進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)hEnSCs-EXOs-Ato 能被U87 細(xì)胞攝取并積累。隨后，研究者評估了hEnSCs-EXOs-Ato 的藥物釋放潛力，發(fā)現(xiàn)hEnSCs-EXOs-Ato 可以在長時間內(nèi)（48 h藥物釋放率約為50%，168 h 藥物釋放率約為75%）連續(xù)釋放藥物。同時，通過MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測Ato 和hEnSCs-EXOs-Ato 對U87 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明hEnSCs-EXOs-Ato 組對U87 細(xì)胞活力的抑制作用比Ato 組更強(qiáng)。

6 人臍帶華通膠MSCs（wharton jelly of umbilical cord tissue mesenchymal stem cells，WJMSCs）來源的EXOs（WJMSCs-EXOs）裝載PTX 在癌癥治療中的應(yīng)用

Abas 等[30]將PTX 裝載到WJMSCs-EXOs 中，構(gòu)建出WJMSCs-EXOs-PTX。隨后研究者分別在pH 為7.4、6.3 和5.0 的PBS 中檢測WJMSCs-EXOs-PTX 的藥物釋放情況，發(fā)現(xiàn)在pH 為5.0 的PBS 中，WJMSCs-EXOs-PTX 的藥物釋放量最高，且藥物釋放速率最快。

研究者采用MTT 法研究不同濃度WJMSCs-EXOs、WJMSCs-EXOs-PTX（濃度為0.1、1、10、100 μg/ml）對宮頸癌細(xì)胞Hela 的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)WJMSCs-EXOs-PTX 能顯著抑制Hela 細(xì)胞生長。隨后，采用流式細(xì)胞技術(shù)和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測WJMSCs-EXOs（10 μg/ml）、WJMSCs-EXOs-PTX（10 μg/ml）對Hela 細(xì)胞凋亡和增殖的影響，發(fā)現(xiàn)WJMSCs-EXOs-PTX 組Hela 細(xì)胞的凋亡率為（33.71±1.55）%，較WJMSCs-EXOs 組（0.81±0.05）% 明顯增高，且WJMSCs-EXOs-PTX 組細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少，表明WJMSCs-EXOs-PTX 對Hela 細(xì)胞生長有明顯抑制作用。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)WJMSCs-EXOs-PTX 處理24 h 后的Hela 細(xì)胞與WJMSCs-EXOs 處理相比，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化激活相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、白細(xì)胞抑制因子、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug）、Notch、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）水平下降，凋亡相關(guān)蛋白Bax、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases，cleaved-Caspase）-3、cleaved-Caspase-9 水平升高而Bcl-2 水平下降，表明WJMSCs-EXOs-PTX 可以促進(jìn)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡，并抑制宮頸癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。

7 總結(jié)與展望

MSCs-EXOs 因其天然的腫瘤靶向性、低免疫原性等諸多優(yōu)勢，被廣泛用作納米載藥顆粒來治療多種癌癥。MSCs-EXOs 裝載不同的藥物后，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的治療中均展現(xiàn)出優(yōu)勢，MSCs-EXOs 載藥系統(tǒng)有更好的藥物釋放潛力。MSCs-EXOs 載藥系統(tǒng)能被腫瘤細(xì)胞攝取，在提高化療藥物抑制腫瘤效果的同時可以降低藥物本身的毒副反應(yīng)、減輕對其他器官的生物毒性。經(jīng)過修飾的MSCs-EXOs 有更高的腫瘤靶向能力，大大提高了藥物遞送的精準(zhǔn)度，在腫瘤治療中更為安全、有效。相較于單純藥物，MSCs-EXOs 作為納米材料傳遞藥物治療癌癥有很多優(yōu)勢和發(fā)展空間。

隨著研究的深入，MSCs-EXOs 藥物遞送載體的優(yōu)勢得到了認(rèn)識，但是MSCs-EXOs 生產(chǎn)與儲存、裝載藥物的效率以及靶向運(yùn)送藥物的準(zhǔn)確性仍需引起研究者的重視。利用MSCs-EXOs 裝載藥物治療癌癥值得更深入的研究。