羅氏和浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)的性能比較

盛 丹

南通市中心血站檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226014

我國(guó)常見的經(jīng)血傳播病毒有人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等，這些病毒不但嚴(yán)重危害感染者的生命安全、降低生活質(zhì)量，還會(huì)在社會(huì)上引起恐慌和紊亂的情緒［1-3］。我國(guó)大多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)傳統(tǒng)的血液檢測(cè)策略都是采用兩種不同廠家的試劑進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），剔除人類免疫缺陷病毒抗原/抗體（HIV-Ag/Ab）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗體（HCV-Ab）、梅毒螺旋體抗體（TP-Ab）陽(yáng)性的血液標(biāo)本。但由于ELISA 存在病毒檢測(cè)“窗口期”長(zhǎng)、免疫靜默感染及病毒株變異等問題，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)在原有血液檢測(cè)策略的基礎(chǔ)上，增加了一遍病毒核酸檢測(cè)（NAT）。NAT直接對(duì)病原體核酸進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)項(xiàng)目為HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA，不受個(gè)體免疫反應(yīng)差異的影響，并且由于其擴(kuò)增放大技術(shù)，使得NAT 可以明顯縮短HBV、HCV、HIV 檢測(cè)的“窗口期”，具有高度的敏感性和特異性，進(jìn)一步降低病毒經(jīng)血傳播的風(fēng)險(xiǎn)，保障了血液及血液制品的安全［4-6］。南通市中心血站在2015年引入浩源多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)，2017年又引入羅氏Cobas S201多重NAT系統(tǒng)。本研究通過收集兩套NAT系統(tǒng)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析兩套系統(tǒng)的檢測(cè)性能差異及原因，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

穿越系統(tǒng)中查詢匯總2020 年1—12 月南通市中心血站血液標(biāo)本病毒NAT的結(jié)果。所有血液標(biāo)本從采集到檢測(cè)報(bào)告最終發(fā)放全過程均符合我國(guó)《獻(xiàn)血者健康檢查要求》及《血站操作技術(shù)規(guī)程（2019 版）》中的相關(guān)規(guī)定，核酸標(biāo)本管為含分離膠的EDTA-K2 抗凝真空采血管，所有檢測(cè)均在72 h內(nèi)完成。

1.2 主要儀器與試劑

Hamilton Star 匯集設(shè)備（瑞士Hamilton）、Cobas Am?pliPrep 全自動(dòng)核酸分離純化分析系統(tǒng)、Cobas TaqMan 全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)、浩源ChiTaS BSS1200匯集和核酸提取設(shè)備（上海浩源），ABI 7500 熒光PCR 儀（美國(guó)ABI），TECAN EVO 加樣器（法國(guó)Tecan），全自動(dòng)酶標(biāo)儀FAME24/20（法國(guó)Hamilton），全自動(dòng)酶標(biāo)儀BEP-Ⅲ（德國(guó)Siemens）。羅氏乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法）（Version 2）（批號(hào)：E31914、F07571、F19971、F31699），上海浩源科技有限公司乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1 型）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒 光 法）（批 號(hào)：MF20190505、MF20190606、MF20190607、BB20200402、BB20200603），HBsAg 診斷試劑盒（北京萬泰、廈門新創(chuàng)），HCV-Ab 診斷試劑盒（上?？迫A、廈門新創(chuàng)），HIV-Ab 診斷試劑盒（北京萬泰），HIV-Ag/Ab 診斷試劑盒（廈門新創(chuàng)），TP-Ab 診斷試劑盒（廈門新創(chuàng)，北京萬泰）。

1.3 檢測(cè)方法

無償獻(xiàn)血志愿者捐獻(xiàn)的血液標(biāo)本，首先采用兩種不同廠家酶免診斷試劑盒進(jìn)行HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab 的檢測(cè)，以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的檢測(cè)，然后將酶免雙陽(yáng)性和ALT 陽(yáng)性的標(biāo)本剔除，最后余下的標(biāo)本進(jìn)行多重核酸混樣檢測(cè)。羅氏檢測(cè)系統(tǒng)每批試驗(yàn)都有試劑盒自帶的陰性對(duì)照1個(gè)pool，陽(yáng)性對(duì)照3個(gè)pool和康徹思坦外部陽(yáng)性質(zhì)控1 個(gè)pool，每6 份標(biāo)本混樣成1 個(gè)pool 進(jìn)行檢測(cè)。浩源檢測(cè)系統(tǒng)每批試驗(yàn)都有試劑盒自帶的陰性對(duì)照1 個(gè)pool，陽(yáng)性對(duì)照1 個(gè)pool 和康徹思坦外部陽(yáng)性質(zhì)控1 個(gè)pool，每8份標(biāo)本混樣成1個(gè)pool進(jìn)行檢測(cè)?；鞕z無反應(yīng)性的標(biāo)本直接判定為陰性；混檢有反應(yīng)性標(biāo)本需繼續(xù)采用原混樣檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行下一步的拆分單項(xiàng)檢測(cè)，若拆分單項(xiàng)檢測(cè)無反應(yīng)性則標(biāo)本判定為陰性，若拆分單項(xiàng)檢測(cè)有反應(yīng)性則標(biāo)本判定為陽(yáng)性。所有ELISA 檢測(cè)和NAT 檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑和儀器使用說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2020 年1—12 月南通市中心血站共有無償獻(xiàn)血志愿者血液標(biāo)本97 628例，剔除酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙試劑陽(yáng)性和轉(zhuǎn)氨酶不合格標(biāo)本638 例，余下96 990 例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，混檢反應(yīng)性pool 數(shù)為136 例，拆分單檢陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)為78 例，總的拆分陽(yáng)性率為57.35%，總的陽(yáng)性檢出率為0.80‰。羅氏和浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)分別檢測(cè)標(biāo)本84 798 例和11 512 例標(biāo)本，兩套核酸檢測(cè)系統(tǒng)拆分陽(yáng)性率的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.801，P＞0.05），陽(yáng)性檢出率的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.167，P＞0.05）。

3 討論

輸血是臨床工作中挽救患者生命和治療疾病的一種常用有效手段，臨床所用血液全部來自于無償獻(xiàn)血志愿者的捐獻(xiàn)，血液是一種不可以制造，也不能用其他制品替代的寶貴資源。但血液中也會(huì)存在多種病毒，在我國(guó)最常見的主要有HIV、HBV 和HCV 等，可通過輸血造成病毒的感染［7-9］。采供血機(jī)構(gòu)傳統(tǒng)的血液檢測(cè)策略是采用兩遍不同廠 家 的ELISA 試 劑 對(duì)HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab 和TP-Ab 進(jìn)行檢測(cè)，但ELISA 法檢測(cè)病毒的“窗口期”較長(zhǎng)，且易受病毒隱匿性感染、病毒變異株等因素干擾而造成漏檢，使臨床用血存在安全隱患。為了進(jìn)一步提高我國(guó)臨床用血和血液制品的安全性，降低經(jīng)血傳播疾病風(fēng)險(xiǎn)，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)要求全國(guó)采供血機(jī)構(gòu)在原有的血液檢測(cè)策略基礎(chǔ)上增加一遍病毒NAT。NAT 可以將HBV、HCV 和HIV 感染檢測(cè)的“窗口期”由原來的56 d、70 d、22 d分別縮短至33 d、12 d、11 d；還可以減少病毒株變異、急性感染恢復(fù)期及慢性隱匿性感染等原因造成的漏檢［10］。

本研究經(jīng)ELISA 和ALT 檢測(cè)剔除陽(yáng)性標(biāo)本后，采用羅氏和浩源兩套NAT 系統(tǒng)進(jìn)行病毒NAT 標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得知本實(shí)驗(yàn)室總的NAT 陽(yáng)性檢出率為0.80‰，這一結(jié)果低于鹽城的1.56‰［11］、徐州的1.04‰［12］，高于上海的0.63‰［13］、鄭州的0.66‰［14］、濟(jì)南的0.37‰［15］。羅氏和浩源兩套NAT 系統(tǒng)均可從ELISA 陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出HBV-DNA 陽(yáng)性標(biāo)本，分別為66例和11例，羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)還檢出HCV-RNA 陽(yáng)性標(biāo)本1 例，這些數(shù)據(jù)表明增加NAT可明顯降低肝炎病毒經(jīng)血傳播的風(fēng)險(xiǎn)。兩套NAT系統(tǒng)雖然所檢測(cè)的標(biāo)本并不盡相同，標(biāo)本數(shù)量也存在明顯差異，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)分析所收集的數(shù)據(jù)可能會(huì)有一定偏差。但是，它們所檢測(cè)的標(biāo)本均采集于同一地區(qū)、同一時(shí)間段的無償獻(xiàn)血志愿者，從血液的采集到檢驗(yàn)均嚴(yán)格按照血站操作技術(shù)規(guī)程執(zhí)行，因此降低了其影響，具有一定的參考意義和價(jià)值。羅氏和浩源兩套NAT 系統(tǒng)拆分陽(yáng)性率分別為57.26%、57.89%，表明兩套系統(tǒng)檢測(cè)的重復(fù)性接近。兩套系統(tǒng)標(biāo)本陽(yáng)性檢出率分別為0.79‰、0.90‰，符合同一地區(qū)、同一時(shí)間段人群感染概率應(yīng)接近。兩系統(tǒng)與其他研究者統(tǒng)計(jì)的羅氏陽(yáng)性檢出率0.60‰［16］、0.64‰［17］，浩源陽(yáng)性檢出率0.90‰［16］、0.74‰［18］相比，結(jié)果也均相近。兩套系統(tǒng)可以互為備用設(shè)備，滿足應(yīng)急要求，同時(shí)可用于日常無償獻(xiàn)血志愿者的血液篩查工作。

羅氏和浩源均為多重NAT系統(tǒng)，即同一反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 多個(gè)核酸靶標(biāo)擴(kuò)增與檢測(cè)的技術(shù)，并能根據(jù)熒光標(biāo)記區(qū)分具體的檢測(cè)項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)過程具有簡(jiǎn)便、快速、高通量的優(yōu)勢(shì)，能滿足采供血機(jī)構(gòu)大規(guī)模血液篩查的需求。兩套系統(tǒng)相比較，羅氏NAT 系統(tǒng)全自動(dòng)化程度更高，提取與擴(kuò)增體系的全封閉性也更好，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定有計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的二次判讀，人為影響因素更少，結(jié)果更穩(wěn)定。浩源NAT系統(tǒng)部分試劑需檢驗(yàn)人員進(jìn)行配置，標(biāo)本提取完畢后需人工轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增條至擴(kuò)增區(qū)，最終檢測(cè)結(jié)果的判定也需檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)規(guī)則進(jìn)行判讀，人工參與度相對(duì)較高。在核酸檢測(cè)靶標(biāo)方面，羅氏系統(tǒng)除檢測(cè)HIV-RNA1 型還進(jìn)行HIV-RNA2 型的檢測(cè)，對(duì)HIV 病毒的檢測(cè)比浩源系統(tǒng)更加全面。在成本上，浩源系統(tǒng)低于羅氏系統(tǒng)。浩源系統(tǒng)檢測(cè)通量也略大于羅氏系統(tǒng)，更適合大規(guī)模血液標(biāo)本的篩查。本實(shí)驗(yàn)室為兩套NAT系統(tǒng)交替使用，間隔期間備用實(shí)驗(yàn)室仍應(yīng)加強(qiáng)定期的清潔消毒及室內(nèi)污染監(jiān)測(cè)；儀器需定期開機(jī)運(yùn)行、維護(hù)及校準(zhǔn)；試劑需存放在合適溫度的醫(yī)用冰箱內(nèi)；工作人員需定期巡視查看實(shí)驗(yàn)室及冰箱溫度、濕度，并做好相應(yīng)記錄。工作人員還需每月對(duì)各套NAT系統(tǒng)的性能指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，既可以進(jìn)行同一系統(tǒng)內(nèi)的同期比較，也可以進(jìn)行不同系統(tǒng)間的平行比較，對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)中可能出現(xiàn)的誤差及早發(fā)現(xiàn)，并組織工作人員進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)和知識(shí)的培訓(xùn)學(xué)習(xí)、經(jīng)驗(yàn)交流，對(duì)工作中出現(xiàn)的不規(guī)范操作及時(shí)進(jìn)行糾正，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的是病毒的抗原、抗體，病毒從進(jìn)入人體到產(chǎn)生一定濃度的抗體需要一段時(shí)間，所以會(huì)有檢測(cè)的“窗口期”。而病毒核酸檢測(cè)的是病毒的DNA或RNA，并且有擴(kuò)增放大效應(yīng)，即使微量的病毒核酸也能被檢測(cè)到，可以縮短病毒檢測(cè)的“窗口期”；靜默感染會(huì)造成酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的漏檢，但對(duì)病毒核酸的檢測(cè)沒有影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)也有優(yōu)勢(shì)，就是抗原、抗體存在時(shí)間長(zhǎng)，而病毒核酸的存在有間歇現(xiàn)象，所以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可檢測(cè)的時(shí)效性更長(zhǎng)。病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和NAT 法是無法相互替代的，而兩者聯(lián)合應(yīng)用相互補(bǔ)充，對(duì)病毒的漏檢率有明顯的降低作用[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)室在日常血液篩查工作中注重檢測(cè)儀器與試劑的不斷升級(jí)更新，工作人員也定期進(jìn)行最新專業(yè)技術(shù)與知識(shí)的培訓(xùn)、工作經(jīng)驗(yàn)的交流分享，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。