大興安嶺南麓東北馬鹿種群遺傳多樣性分析

李 崢，郭金昊，劉鑫鑫，張明海

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040）

由于人類活動(dòng)和自然環(huán)境變化，野生動(dòng)物的生存面臨諸多威脅，如棲息地喪失、生境破碎化等嚴(yán)重威脅著野生動(dòng)物的擴(kuò)散和繁衍［1］，甚至導(dǎo)致種群近交風(fēng)險(xiǎn)上升、遺傳多樣性喪失，從而使種群對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)及適應(yīng)能力下降［2］。遺傳多樣性水平往往與種群的穩(wěn)定和健康息息相關(guān)，遺傳變異水平較高的種群對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力更強(qiáng)，即使在種群數(shù)量下降后仍具備很強(qiáng)的恢復(fù)潛力［3］。遺傳多樣性水平的高低是衡量種群健康狀況的重要依據(jù)，是進(jìn)行種群管理與保護(hù)決策的重要工具之一［4］。

東北馬鹿（Cervus elaphus xanthopygus）是我國北方森林生態(tài)系統(tǒng)中具有代表性的有蹄類動(dòng)物，在維持森林和草原生態(tài)系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，曾廣泛分布于黑龍江省大小興安嶺、完達(dá)山、老爺嶺及張廣才嶺，吉林省長白山地區(qū)，大興安嶺南麓內(nèi)蒙古和河北省森林—草原過渡帶地區(qū)［5-9］。然而由于非法盜獵、森林資源過度利用以及自然環(huán)境變化，許多生境逐漸不適合馬鹿的生存與活動(dòng)，由此導(dǎo)致野生種群數(shù)量下降，分布區(qū)退縮，部分地區(qū)馬鹿種群甚至出現(xiàn)斑塊化分布，近親繁殖、遺傳多樣性喪失的風(fēng)險(xiǎn)日益增大［10-11］。

大興安嶺南麓高格斯臺(tái)罕烏拉國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（以下簡稱“高格斯臺(tái)保護(hù)區(qū)”）是我國重要的馬鹿分布區(qū)，馬鹿平均密度為1.11只/km2，是目前野生馬鹿種群密度最高的地區(qū)［12-13］，對(duì)野生馬鹿種群的恢復(fù)和歷史分布區(qū)的重建具有重要意義。因此，本研究通過分子糞便學(xué)技術(shù)對(duì)分布在高格斯臺(tái)保護(hù)區(qū)內(nèi)的馬鹿進(jìn)行遺傳學(xué)研究，評(píng)估馬鹿種群遺傳多樣性現(xiàn)狀，為馬鹿種群保護(hù)及健康狀況監(jiān)測(cè)等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品均來自高格斯臺(tái)保護(hù)區(qū)，保護(hù)區(qū)隸屬于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗。2021年12月—2022年1月，根據(jù)馬鹿在保護(hù)區(qū)的分布現(xiàn)狀，確定采樣區(qū)域（圖1）。選擇樣線調(diào)查法跟蹤馬鹿新鮮足跡鏈，并收集馬鹿新鮮糞便，同時(shí)GPS 定位。共采集新鮮糞便樣品 246 份，肌肉對(duì)照樣品1 份（來自野外發(fā)現(xiàn)的自然死亡雌性馬鹿個(gè)體）。所有樣品放置在超低溫冰箱-80 ℃保存。

圖1 馬鹿糞便采樣點(diǎn)示意圖（內(nèi)蒙古高格斯臺(tái)保護(hù)區(qū)）Fig.1 Fecal sample collection sites of red deer（Gaogesitai Reserve in Inner Mongolia）

1.2 DNA提取及物種鑒定

糞便DNA 提取使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany），按操作說明進(jìn)行。選擇mtDNACyt b引物［14-15］，L14724：5′-CGAGATCTGAAAAACCATCGTTG-3′；H15149：5′-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3′用于糞便DNA 的PCR 擴(kuò)增（400～500 bp）。擴(kuò)增體系20 μL：2×RapidTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，25～50 ng/μL DNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存，每次擴(kuò)增均用肌肉DNA 作陽性對(duì)照。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增結(jié)果后，將含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并雙向測(cè)序。所得序列使用DNAStar 軟件進(jìn)行正反序列的拼接、比對(duì)和校正。最后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，以確定糞便的物種來源。

1.3 個(gè)體識(shí)別

根據(jù)東北馬鹿已有研究結(jié)果，選取9 對(duì)微衛(wèi)星引物（ETH225、T501、T156、BM848、T530、C143、DM45、N、T507［16］）用于東北馬鹿個(gè)體識(shí)別。所有引物合成時(shí)，上游引物5′端均進(jìn)行熒光標(biāo)記（Fam、Hex、Tamra或Rox），下游引物不標(biāo)記（表1）。擴(kuò)增體系20 μL：2×RapidTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，25～50 ng/μL DNA 6 μL，ddH2O 2.4 μL。反應(yīng)條件同物種鑒定方法。采用多管PCR 擴(kuò)增法，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行3～7 次重復(fù)的陽性PCR，得到的產(chǎn)物使用ABI 3730XL 測(cè)序儀（Applied Biosystems Inc.，America）進(jìn)行基因掃描和判讀等位基因大小。使用軟件Excel mircosatellite tool kit 尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型［17］。判斷不同樣品屬于同一個(gè)體的依據(jù)是：所有位點(diǎn)上的基因型均相同，或只有1個(gè)位點(diǎn)的1個(gè)等位基因不同［18］。

表1 用于東北馬鹿個(gè)體識(shí)別的9對(duì)微衛(wèi)星引物信息Tab.1 Details of nine microsatellite loci used for red deer individual identification

1.4 性別鑒定

性別鑒定使用SRY12 和BMC1009 兩對(duì)引物對(duì)糞便DNA 進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，其中引物SRY12 擴(kuò)增Y 染色體中的SRY 區(qū)域片段，引物BMC1009 擴(kuò)增常染色體微衛(wèi)星位點(diǎn)，作為反應(yīng)的陽性對(duì)照［19-20］。使用SRY 引物對(duì)所有樣本再次單獨(dú)擴(kuò)增，以避免因引物間互相干擾造成的擴(kuò)增失?。ū?）。根據(jù)PCR 結(jié)果中條帶的出現(xiàn)情況對(duì)東北馬鹿的性別進(jìn)行判別。

表2 東北馬鹿性別鑒定引物信息Tab.2 Gender primer sequences of red deer

1.5 遺傳數(shù)據(jù)分析

對(duì)于mtDNA 序列，使用軟件DnaSP 6.12 分別計(jì)算變異位點(diǎn)數(shù)（variable sites，S）、單倍型數(shù)量（number of haplotypes，H）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）［21］。

對(duì)于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，使用GenAlEx 6.5將等位基因數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為分析軟件所需的各種格式，并計(jì)算等位基因數(shù)（number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective allele number，Ne）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）和期望雜合度（expected heterozygosity，He）［22］。應(yīng)用Cervus 3.0 計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（polymorphism information contents，PIC）；使用GIMLET 1.3.3［23］計(jì)算9 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合PID值，即無親緣關(guān)系或同胞個(gè)體之間具有相同基因型的概率；使用Microchecker 2.2.0.3［24］檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是否存在無效等位基因（null allele）。使用GENEPOP 4.0［25］測(cè)算總體和每個(gè)位點(diǎn)是否偏離哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），同時(shí)檢驗(yàn)各位點(diǎn)間連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），LD 和HWE 檢驗(yàn)通過馬爾科夫鏈法（Markov chain method）生成p值，并使用Bonferroni法對(duì)顯著性進(jìn)行校正［26］。

2 結(jié)果

2.1 物種鑒定及個(gè)體識(shí)別

共采集糞便樣品246 份，其中成功提取DNA 樣品222 份，樣品利用率為90.24%。222 份樣品成功擴(kuò)增Cyt b基因，擴(kuò)增產(chǎn)物為424 bp。序列經(jīng)過正反拼接、校正及Blast 比對(duì)后，最終鑒定出209 份馬鹿DNA樣本。

GIMLET 分析結(jié)果顯示，9 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合Prod（unbias）為6.398×10-10，即使出現(xiàn)雙胞胎，誤判概率Prod（sibs）只有0.047 3%。當(dāng)2 個(gè)多態(tài)性最高的位點(diǎn)擴(kuò)增失敗時(shí)，Prod（sibs）增加到0.460 0%，仍小于1.000 0%（圖2）。因此，9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中至少有7 個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增成功才可用于后續(xù)分析。209 份馬鹿樣品中獲得了203 個(gè)成功擴(kuò)增的微衛(wèi)星樣本，基因分型利用率為97.13%?；? 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合線粒體和性別鑒定結(jié)果，個(gè)體識(shí)別結(jié)果顯示 203份馬鹿糞便樣本屬于182只不同的馬鹿個(gè)體。

圖2 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)按照pID順序的個(gè)體基因型相似概率曲線Fig.2 Probability of identity（pID）curve generated by nine microsatellite loci

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，最終在182 只馬鹿個(gè)體中鑒定出雌性馬鹿125 只，雄性馬鹿57 只，雌雄性比為2.19∶1。

2.2 基于mtDNA的遺傳多樣性

182 條Cytb序列（424 bp）共檢出5 個(gè)變異位點(diǎn)，包括4個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和1個(gè)顛換位點(diǎn)（C/A，350 bp處），未發(fā)現(xiàn)插入或缺失位點(diǎn)。5個(gè)變異位點(diǎn)中，單一變異位點(diǎn)2 個(gè)（128、367 bp），簡約信息位點(diǎn)3 個(gè)（250、295、350 bp）。（G+C）整體含量較低，為37.8%，存在AT偏倚性，符合脊椎動(dòng)物線粒體堿基的組成特點(diǎn)。

182 條序列共測(cè)定3 個(gè)單倍型，分布頻率分別為78.0%、21.4%和0.5%，研究地區(qū)整體單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為（0.347±0.035），核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為（0.248±0.025）%。

2.3 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性

根據(jù)多態(tài)信息含量（PIC）對(duì)9 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)進(jìn)行篩選。當(dāng)PIC＜0.250 時(shí)，認(rèn)為多態(tài)性較低，故舍去C143位點(diǎn)。最終選擇8 個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＞0.500）的擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析（表3）。各位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)無效等位基因及等位基因丟失等情況，說明基因分型結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析。

表3 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity indicators for the eight microsatellite loci

Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，研究地區(qū)整體水平顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，但固定系數(shù)為負(fù)值（Fis=-0.062），證明不存在無效等位基因或近交的影響。連鎖不平衡分析結(jié)果顯示8 個(gè)位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡，可進(jìn)行后續(xù)種群遺傳學(xué)分析。

研究區(qū)域整體種群平均等位基因數(shù)（Na）為（7.40±0.47）；平均有效等位基因數(shù)（Ne）為（4.40±0.30），有效等位基因與等位基因數(shù)二者差異顯著（p＜0.01）。等位基因豐富度（AR）為4.537；平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.691。平均期望雜合度（He）為（0.729±0.016）；平均觀測(cè)雜合度（No）為（0.768±0.029），觀測(cè)雜合度與期望雜合度之間存在差異（p＜0.05）。

3 討論

野生動(dòng)物的性比既是估計(jì)物種生存力的重要指標(biāo)，又是描述種群結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，深入了解珍稀瀕危野生動(dòng)物的性比對(duì)制定保護(hù)與管理策略具有重要指導(dǎo)意義［27］。本研究表明，大興安嶺南麓森林—草原過渡帶馬鹿種群雌雄性比為2.19∶1，與楊淼［28］和張沼等［29］對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)馬鹿的研究結(jié)果一致，均顯示雌性高于雄性，符合馬鹿一雄多雌的交配體制。

本研究選擇線粒體與核微衛(wèi)星2 種分子標(biāo)記，從不同角度對(duì)種群遺傳多樣性狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)。單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（Pi）是衡量線粒體DNA 多樣性水平的重要參數(shù)［30］。已有學(xué)者利用線粒體Cytb基因?qū)︸R鹿部分亞種進(jìn)行遺傳多樣性研究，如劉鑫鑫［31］研究表明東北地區(qū)的馬鹿野生群體單倍型多樣性較高（Hd=0.586），核苷酸多樣性相對(duì)較低（Pi=0.305%）；劉艷華等［32］研究表明西藏東南部分布的西藏馬鹿（Cervus elaphus wallichi）整體遺傳多樣性較高（Hd=0.897，Pi=2.781%）；塔依爾江·麥麥提等［33］發(fā)現(xiàn)塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）3 個(gè)地理種群的遺傳多樣性不平衡（Hd=0.845，Pi=1.500%）。本研究在182 只馬鹿個(gè)體中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)單倍型，單倍型多樣性（0.347）和核苷酸多樣性（0.248%）均低于西藏馬鹿、塔里木馬鹿及分布在黑龍江和吉林地區(qū)的馬鹿。根據(jù)對(duì)比國內(nèi)其他馬鹿亞種基于線粒體Cyt b基因的研究結(jié)果（表4），結(jié)合種群遺傳多樣性水平的判定標(biāo)準(zhǔn)（Hd≥0.500，Pi≥0.500%）［34-35］，研究地區(qū)東北馬鹿線粒體DNA 多樣性水平處于中等偏低水平。

表4 中國馬鹿種群遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Comparison of genetic diversity of red deer populations in China

微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）是衡量遺傳標(biāo)記所提供信息含量的參數(shù)，根據(jù)Botstein等［43］提出的多態(tài)信息含量標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇的9 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中僅有C143 位點(diǎn)PIC=0.180＜0.250，表明C143 位點(diǎn)提供的遺傳信息相對(duì)匱乏，故最終確定其他8 個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)用于遺傳多樣性分析。研究結(jié)果顯示整體種群平均等位基因數(shù)（Na）為7.40，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為4.40，二者差異顯著（p＜0.01），可能存在等位基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)。研究區(qū)域整體種群觀測(cè)雜合度（Ho）為0.768，期望雜合度（He）為0.729。雜合度作為有效量化遺傳多樣性水平的參數(shù)［44］，與其他地區(qū)馬鹿亞種研究結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)本研究地區(qū)馬鹿遺傳多樣性處于中等偏低水平。

線粒體表達(dá)的遺傳多樣性水平低于微衛(wèi)星標(biāo)記，這可能與標(biāo)記方法本身有關(guān)。微衛(wèi)星標(biāo)記的進(jìn)化速度高于線粒體DNA。相比之下，線粒體DNA 的整體結(jié)構(gòu)、大小及基因排列相對(duì)保守，一般不發(fā)生重組。線粒體DNA 為單倍體母系遺傳，有效種群大小僅為核DNA 的1/4，因此，對(duì)瓶頸效應(yīng)等種群變化較為敏感［45］，本研究表明大興安嶺南麓馬鹿種群歷史上可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)?；贑yt b測(cè)序結(jié)果可知，本研究檢出的單倍型數(shù)量相對(duì)較少，Hap3 僅有1 只個(gè)體構(gòu)成，稀有單倍型比例達(dá)33.33%。20世紀(jì)50年代，由于林業(yè)資源采伐、放牧和狩獵，本地區(qū)野生馬鹿種群數(shù)量急劇下降。直到本世紀(jì)初期，經(jīng)過合理的管理措施，馬鹿種群數(shù)量才逐漸恢復(fù)。因此，為了馬鹿種群的可持續(xù)發(fā)展，有必要對(duì)稀有單倍型實(shí)施監(jiān)測(cè)，并且加強(qiáng)管理和保護(hù)該地區(qū)的馬鹿種群，防止遺傳多樣性進(jìn)一步下降，甚至喪失。

致謝：感謝內(nèi)蒙古高格斯臺(tái)罕烏拉國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)錢宏遠(yuǎn)局長、石光磊副局長對(duì)本研究調(diào)查工作的大力支持，感謝保護(hù)區(qū)業(yè)務(wù)部、資源部及科研管理部以阮行舟、寶音達(dá)來等為主要代表的全體參與者的熱心幫助和大力配合。