盧月,胡永強,夏雨弘,劉洪存,齊 晉,皮杜娟,楊立芳,,姜明國,
(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西多糖材料與改性重點實驗室,廣西南寧 530008;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室,廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心,廣西南寧 530008)
高血脂癥是常見的代謝紊亂性疾病中的一種[1],是導(dǎo)致糖尿病、高血壓發(fā)生的一個重要的因素,同時還可能引起動脈粥樣硬化、心腦血管疾病及肝硬化、脂肪肝等疾病[2?3],其主要特征是人體中的血脂水平異常,即總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)高于正常含量水平,而高密度脂蛋白(HDL-C)的含量低于正常水平[4]。
食藥用菌發(fā)酵茶是以茶葉為基質(zhì),與食藥用真菌進行共發(fā)酵加工而成的一種發(fā)酵菌茶。發(fā)酵菌茶兼具兩者的優(yōu)點,不僅沖泡方式簡單,營養(yǎng)物質(zhì)更易被人體吸收,并且其含有的活性物質(zhì)在降血脂,預(yù)防動脈硬化,改善脂質(zhì)代謝等癥狀有著顯著的效果,因此食藥用菌發(fā)酵茶廣泛被人們接受和喜愛,并且沒有副作用[5]。茯苓發(fā)酵茶的利尿效果要優(yōu)于茯苓和原茶,人工接種發(fā)酵的茯磚茶能夠降低含氟量,降低肥胖大鼠 TG、TC 水平,提高 HDL-C 水平[6]。白靶齒菌發(fā)酵茶降血脂,抗氧化和肝臟保護的作用優(yōu)于白耙齒菌和原茶[7]。香灰菌(Annulohypoxylon stygium)是一種碳團菌屬真菌,含有蛋白質(zhì)、多糖、礦物元素、氨基酸、粗纖維等物質(zhì),特別是當(dāng)菌絲生長到一定階段后,有大量真菌黑色素生成,其營養(yǎng)價值高,具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等功效[8?9]。目前對香灰菌的研究主要集中在銀耳栽培方面,其在茶葉發(fā)酵及降血脂、肝臟保護等方面的應(yīng)用未見報道。
基于課題組對于香灰菌的前期研究,發(fā)現(xiàn)其提取物在降脂方面有著顯著的效果。為了充分開發(fā)和利用香灰菌的抗氧化、改善糖脂代謝的功能,實驗首次就香灰菌與茶葉共發(fā)酵培養(yǎng)制得的香灰菌發(fā)酵茶改善高血脂小鼠脂質(zhì)代謝的影響開展研究,擬建立高血脂小鼠模型,探索香灰菌發(fā)酵茶水提物(ASTAE)對高血脂小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Scr)、尿氮素(BUN)等脂代謝相關(guān)指標(biāo)以及脂聯(lián)素(ADPN)的影響,評價香灰菌發(fā)酵茶水提物對高脂血癥小鼠肝臟和腎臟的保護作用,為香灰菌的應(yīng)用開發(fā)、茶葉深加工和茶產(chǎn)品品種的豐富提供新的思路。
SPF 級KM 雄性小鼠 80 只,體重20±2 g,廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(桂)2014-0002,實驗動物使用許可證號:201 609001;小鼠基礎(chǔ)飼料 廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心;熊果酸 北京索萊寶科技有限公司;TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT 測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠 Adiponectin ELISA 測定試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司;膽固醇(批號:C10178156)、豬膽鹽(批號:C10203440)上海麥克林生化科技有限公司;豬油 自制,市場采購豬板油進行煉制而成;蛋黃粉 自制,市場采購生雞蛋,煮熟后取蛋黃烘干,研磨后所得;綠茶 廣西梧州圣源茶業(yè)有限公司;香灰菌發(fā)酵茶葉 廣西民族大學(xué)廣西多糖材料與改性重點實驗室自主開發(fā);香灰菌(Annulohypoxylon stygium)Gxun.10030,于2021 年11 月19 日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏編號:CGMCCNO.23847。
ZHJH-C11068 型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;Olympus CKX41 型倒置熒光顯微鏡 日本 Olympus;7100 型全自動生化試劑儀 日本日立;Epoch 型全波長酶標(biāo)儀 美國 BioTek。
1.2.1 香灰菌發(fā)酵茶水提物(ASTAE)的制備 將馴化后的香灰菌接種在上述綠茶上,在溫度 28 ℃,濕度 80%的條件下發(fā)酵培養(yǎng),待茶葉裹滿菌絲后,烘干即得香灰菌發(fā)酵茶。稱取上述香灰菌發(fā)酵茶 2 g,加入200 mL 蒸餾水煮沸5 min,過濾,收集茶湯,剩余殘渣再次加入200 mL 蒸餾水,按上述操作重復(fù)提取3 次,將所有茶湯合并,濃縮至50 mL,即配成濃度為40 mg/mL 的香灰菌茶發(fā)酵茶水提物,采用倍半稀釋的方法配制20、10 mg/mL 的香灰菌茶發(fā)酵茶水提物。采用上述的方法制備濃度為40 mg/mL 的綠茶水提物[7]。
香灰菌水提物的制備:將香灰菌的菌絲體用蒸餾水洗凈,菌絲體與蒸餾水重量比為1:100,于100 ℃下萃取10 min,過濾得濾液,重復(fù)三次上述萃取過程,合并濾液,濃縮得香灰菌水提物浸膏,冷凍干燥后得粉末狀的香灰菌水提物。稱取香灰菌水提物0.4 g,溶于10 mL 蒸餾水中,配制成濃度為40 mg/mL 的香灰菌水提物。
1.2.2 高血脂模型構(gòu)建及給藥方式 雄性KM 小鼠80 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,飼養(yǎng)溫度25±1 ℃,相對濕度60%±5%,光照晝夜各12 h,隨機分為8 組,每組10 只,其中一組作為空白對照組(CK),實驗全程喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料,剩余70 只小鼠給予高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料加入1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%豬膽鹽)建模5 周后,禁食不禁水12 h,尾尖取血,3000 r/min 離心10 min,取血清,測定每只小鼠的血脂水平,與空白對照組血脂水平比較,若P<0.05或P<0.01,則示造模成功。將70 只高血脂小鼠隨機分配成7 組(每組10 只),即模型組(HF)、綠茶組(GT,400 mg/kg)、熊果酸陽性對照組(UA,200 mg/kg)、香灰菌組(AS,400 mg/kg)、香灰菌發(fā)酵茶水提物高(HA,400 mg/kg)、中(MA,200 mg/kg)、低劑量組(LA,100 mg/kg),上述動物均按照10 mg/kg 的體積灌胃??瞻讓φ战M和模型組灌胃等劑量的生理鹽水,其他組給予相應(yīng)濃度的供試物。實驗期間小鼠自由進食和飲水,每天觀察記錄各組小鼠的精神及活動狀態(tài),毛發(fā)變化情況,連續(xù)給藥5 周,每周稱一次體重[10?11]。
1.2.3 香灰菌發(fā)酵茶降血脂及保護肝腎作用的檢測末次給藥后,眼球取血,將血液置于1.5 mL 離心管內(nèi),3000 r/min 離心10 min,取血清,利用試劑盒及全自動生化分析儀檢測血清中TC、LDL-C、TG、HDL-C 及 BUN、Scr、AST、ALT、ADPN 含量水平[7]。
處死小鼠并解剖,剝離小鼠肝臟、心臟、腎臟稱重,計算臟器指數(shù)。將肝臟置于4%多聚甲醛中固定,取一部分石蠟包埋并進行切片后HE 染色,另一部分使用OTC 包埋,冷凍切片,使用油紅O 染色。顯微鏡下觀察肝臟組織病理情況以及肝臟脂肪顆粒的分布情況。臟器指數(shù)按下式計算:
采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)理統(tǒng)計,多組間使用單因素方差分析(ANOVA)進行比較,兩兩比較使用 LSD 法,組內(nèi)、組間使用t檢驗進行統(tǒng)計,實驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,差異顯著水平為P<0.05,差異極顯著水平為P<0.01。
在實驗過程中,CK 組小鼠毛發(fā)順滑有光澤,沒有出現(xiàn)互相撕咬的情況;HF 小鼠毛發(fā)稀疏,精神狀態(tài)較差,少動;香灰菌發(fā)酵茶水提物組和UA 組小鼠精神狀態(tài)有所改善,實驗全程無小鼠死亡。由表1可知,HF 組小鼠的體重最大,體重超過了CK 組體重的28%,這與錢珊珊等[12]研究結(jié)果一致;藥物治療組小鼠的體重均有所降低,其中香灰菌發(fā)酵茶水提物各劑量組的體重均低于模型組,與HF 組相比,高、中劑量組極顯著降低了高血脂小鼠的體重(P<0.01),且低于GT 組和AS 組,說明灌胃香灰菌發(fā)酵茶水提物能有效的降低高血脂小鼠的體重。
表1 ASTAE 對高血脂小鼠體重和臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of ASTAE on body weight and organ index of hyperlipidemic mice
模型組小鼠的肝臟、心臟和腎臟指數(shù)分別為CK 組的1.20、1.23 和1.22 倍,均顯著高于正常組(P<0.05)。香灰菌發(fā)酵茶水提物各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均低于模型組,相比于HF 組,各組小鼠的肝臟指數(shù)顯著下降,且具有極顯著性差異(P<0.01),腎臟指數(shù)顯著性下降(P<0.05),說明灌胃給予香灰菌發(fā)酵茶水提物能夠有效的預(yù)防高血脂小鼠心臟、肝臟、腎臟質(zhì)量的增加,改善高脂飲食引起的臟器質(zhì)量增加,一定程度上起到了保護臟器的作用。
ASTAE 對高血脂小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響結(jié)果如表2 所示,HF 組小鼠血清中的TC、TG、LDL-C 濃度最高,且顯著高于CK 組(P<0.05),而其HDL-C 濃度最低,極顯著低于CK 組(P<0.01),表明高血脂小鼠模型構(gòu)建成功。
表2 ASTAE 對高血脂小鼠 TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響Table 2 Effects of ASTAE on TC、TG、HDL-C、LDL-C in hyperlipidemic mice
血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 是檢測血脂異常中最重要的指標(biāo),膽固醇可在人體內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白,其中LDL-C 是粥樣斑塊中膽固醇的主要來源,其水平往往與心血管疾病的發(fā)病率呈正相關(guān),HDL-C 的水平與心血管疾病的患病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[13]。
與HF 組相比,HA 組能夠極顯著降低高血脂小鼠血清中TG、TC、LDL-C 的含量水平,升高HDL-C的含量(P<0.01),且效果與陽性藥相當(dāng);MA 組和LA 組極顯著降低了高血脂小鼠血清中TC、LDL-C的含量,升高HDL-C 的水平(P<0.01)。與HF 組相比,GT 組及AS 組可極顯著降低LDL-C、TC 的含量,升高HDL-C 的水平(P<0.01),但降血脂作用不及香灰菌發(fā)酵茶水提物的各劑量組,這與文獻報道相一致[6]。上述結(jié)果表明,香灰菌發(fā)酵茶水提物具有良好的降低高血脂小鼠血脂的作用,從而達到改善高血脂小鼠脂質(zhì)代謝的作用。
谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶存在于肝臟細胞的細胞核和線粒體中,當(dāng)肝臟組織受損時,肝細胞則會釋放大量AST、ALT 入血,使血清中的AST、ALT 含量升高。因此,這兩種酶的活性往往被用做衡量肝臟損傷程度的檢測指標(biāo)[14]。
由表3 可知,HF 組小鼠血清中的AST、ALT 水平極顯著升高(P<0.01),是CK 組的2.26、1.72 倍,顯示長時間高脂飲食會誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷。與HF組相比,HA 組小鼠的AST、ALT 水平極顯著降低(P<0.01),且效果優(yōu)于UA 組、GT 組和AS 組;與HF 組相比,GT 組顯著性降低了ALT 的含量(P<0.05),但效果不及香灰菌發(fā)酵茶水提物組。上述結(jié)果表明,香灰菌發(fā)酵茶水提物能顯著降低高血脂小鼠血清中的AST、ALT 含量,具有保護肝臟的功能。
表3 ASTAE 對高血脂小鼠AST、ALT 的影響Table 3 Effects of ASTAE on AST、ALT in hyperlipidemic mice
長期食用高脂肪、高熱量的食物會使機體糖脂代謝紊亂,使過多的脂肪堆積在腎臟,進而導(dǎo)致腎臟發(fā)生損傷,造成血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量升高,因此Scr 和BUN 是常用于臨床檢測腎臟損傷的生化指標(biāo)[15]。
實驗結(jié)果如表4 中數(shù)據(jù)所示,給予高脂飼料飼養(yǎng)后,與CK 組相比,HF 組小鼠血清中的BUN、Scr均有上升。與HF 組相比,香灰菌發(fā)酵茶水提物各劑量組均極顯著降低了高血脂小鼠血清中BUN 的含量水平(P<0.01),其中HA 組效果優(yōu)于UA 組;HA組極顯著降低了小鼠血清中Scr 水平(P<0.01),其效果優(yōu)于UA 組。與HF 組相比,GT 組、AS 組極顯著降低了高血脂小鼠血清中BUN(P<0.01),但效果不及香灰菌發(fā)酵茶各劑量組;GT 組極顯著降低了高血脂小鼠血清中Scr 含量(P<0.01),其效果不及HA 組。上述實驗結(jié)果表明,香灰菌發(fā)酵茶水提物能夠有效的降低BUN、Scr 含量水平,具有一定的腎臟保護作用。
表4 ASTAE 對高血脂小鼠BUN、Scr 的影響Table 4 Effects of ASTAE on BUN、Scr in hyperlipidemic mice
脂聯(lián)素(ADPN)是一種由脂肪細胞分泌的細胞因子,在對代謝紊亂的良性調(diào)控和提高胰島素敏感性方面發(fā)揮重要的作用[16?17],主要通過促進脂肪的氧化分解,抑制脂肪的生成,來實現(xiàn)對脂肪代謝的調(diào)控作用[18?19]。
香灰菌發(fā)酵茶水提物對高血脂小鼠血清中 ADPN的影響如圖1 所示,與CK 相比,高脂飼料飼養(yǎng)后小鼠體內(nèi)的脂聯(lián)素明顯下降,這與文獻報道的研究結(jié)果相一致[17]。與HF 組相比,ASTAE 的各劑量組、GT組和AS 組小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素的含量均極顯著升高(P<0.01),香灰菌發(fā)酵茶各劑量組不僅優(yōu)于UA 組還優(yōu)于GT 組和AS 組。上述結(jié)果表明,香灰菌發(fā)酵茶水提物有助于提高高血脂小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素的含量,從而調(diào)控高血脂小鼠的脂肪代謝,達到降血脂的效果。
圖1 ASTAE 對高血脂小鼠 ADPN 的影響Fig.1 Effects of ASTAE on ADPN in hyperlipidemic mice
ASTAE 對高血脂小鼠肝臟的外觀形態(tài)觀察如圖2 所示,正常組小鼠肝臟顏色呈現(xiàn)為鮮紅色,表面光滑,且具有一定彈性。模型組小鼠的肝臟偏大,顏色偏白,表面有明顯的白色斑點,肝組織彈性較差,存在出血點;香灰菌發(fā)酵茶水提物高、中、低劑量組以及GT 組和AS 組能夠一定程度上改善高血脂小鼠肝臟發(fā)白以及油膩感,表面的白色斑點減少,沒有出血點[7],其中HA 組小鼠肝臟的脂肪化程度最低,其改善效果優(yōu)于UA 組、GT 組和AS 組。
圖2 各組小鼠肝臟外觀觀察圖Fig.2 Observational view of the liver appearance of mice in each group
ASTAE 對高血脂小鼠肝臟病理學(xué)觀察結(jié)果如圖3 所示,CK 組小鼠肝臟組織細胞形態(tài)正常且排列整齊,細胞邊界清晰,細胞核沒有出現(xiàn)萎縮或者破裂的現(xiàn)象,細胞質(zhì)沒有溶解,沒有出現(xiàn)脂肪空泡。HF組肝臟組織細胞形態(tài)改變并且排列混亂,細胞邊界模糊,出現(xiàn)大量細胞核偏移及破裂,部分胞質(zhì)溶解,出現(xiàn)大量脂肪空泡。HA、MA、LA、GT 組和AS 組在一定程度上改善了高血脂小鼠肝臟組織細胞核仁的偏移,細胞邊界逐漸清晰,細胞排列分布規(guī)則,細胞核破裂現(xiàn)象得到改善,脂肪空泡減少,其中香灰菌發(fā)酵茶水提物各劑量組效果更優(yōu),說明香灰菌發(fā)酵茶水提物能夠保護肝臟組織[7]。
圖3 ASTAE 對高血脂小鼠肝臟組織 HE 染色觀察圖(400×)Fig.3 HE staining results of liver of hepatic tissue of highly fat mice by ASTAE (400×)
ASTAE 對高血脂小鼠肝臟組織的油紅O 染色觀察的結(jié)果如圖4 所示,HF 組小鼠肝組織切片紅色脂滴數(shù)量高于CK 組。與HF 組相比,UA 組小鼠肝組織的脂肪滴較少,紅色數(shù)量減少,細胞形態(tài)正常;HA、MA、LA 組均不同程度地減少了高血脂小鼠肝臟組織中的脂肪滴,從而改善其肝臟中的脂質(zhì)水平,且HA 組脂滴減少程度優(yōu)于UA 組、GT 組、AS 組。上述結(jié)果表明,各劑量組的香灰菌發(fā)酵茶水提物具有改善脂肪肝的功效[7]。
圖4 ASTAE 對高血脂小鼠肝臟組織油紅 O 染色觀察圖(400×)Fig.4 Oil red O staining of liver tissue in hyperlipidemic mice by ASTAE (400×)
血脂代謝異常是造成心腦血管疾病,動脈粥樣硬化及脂肪肝的重要危險因素[13]。市面上常見的降脂藥物在降低血脂的同時伴隨著多種不良反應(yīng)。資源豐富的食藥用菌和藥食同源的中藥在改善高血脂癥方面具有獨特的優(yōu)勢,且其副作用小,具有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。樺褐孔菌水提物[20]、靈芝屬真菌[21]、香菇多糖和麥角甾醇[22?23]都具有降血脂的作用,金花茶濃縮液[24]能夠顯著降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C 的含量,升高HDL-C 的含量,有著良好的降血脂的作用。相比服用各種具有副作用的減肥、降脂藥物,人們更傾向于通過食療的方式就可以達到減肥、降脂的功效。茶葉具有一定的降脂功能,并且是人們?nèi)粘o嬘玫娘嬈?,如何將二者完美融合,充分發(fā)揮二者的優(yōu)勢,以開發(fā)減肥、降脂功能更優(yōu)的功能菌茶是本課題組一直以來的研究方向。本課題組曾將具有降脂、抗氧化、降血糖等功能的白耙齒菌與綠茶共發(fā)酵培養(yǎng)得到白耙齒菌發(fā)酵茶,通過藥理學(xué)實驗證明白耙齒菌茶降血脂、肝臟保護功能均優(yōu)于綠茶與白耙齒菌[9],并且其沖泡飲用的方式更易被人們接受,顯示了功能菌茶的應(yīng)用與開發(fā)前景更加廣闊。香灰菌在生長過程中產(chǎn)生的真菌黑色素,具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖、降血脂等功效。本課題組前期研究也證實,香灰菌水提物具有良好的降脂功能。將香灰菌馴化,使其能夠與茶葉共生、共發(fā)酵,加工出兼?zhèn)浠騼?yōu)于茶和香灰菌活性的功能菌茶,對開發(fā)新型功能菌茶具有十分重要的意義。
實驗將具有降脂活性的香灰菌與綠茶共發(fā)酵培養(yǎng),開發(fā)一種新型的香灰菌發(fā)酵茶,采用高脂飼料誘導(dǎo)構(gòu)建高血脂小鼠模型,以探究該香灰菌發(fā)酵茶水提物在降血脂、保護肝臟及腎臟、改善脂肪肝方面的作用。本研究結(jié)果表明,香灰菌發(fā)酵茶水提物能降低高血脂小鼠血清中的TG、TC、LDL-C、AST、ALT 水平,升高HDL-C 水平,改善肝臟組織細胞病理學(xué)狀態(tài),減少肝臟組織中的脂肪含量,從而達到降血脂、改善脂肪肝、保護肝臟的作用。并且,通過檢測血清中BUN 和Scr 的含量水平,證明香灰菌發(fā)酵茶水提物不僅沒有腎毒性,而是具有一定的腎臟保護作用。通過對ADPN 水平的檢測,發(fā)現(xiàn)香灰菌發(fā)酵茶水提物能夠升高其含量水平,由此推測香灰菌發(fā)酵茶水提物降血脂、改善脂肪肝保護肝臟、腎臟的作用機制可能是通過增加高血脂小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素的含量水平,從而促進脂肪的氧化分解,抑制脂肪的生成,進而減少高血脂癥小鼠甘油三酯及膽固醇的含量,減少肝臟和腎臟中脂質(zhì)沉積,達到降血脂、改善脂肪肝和保護肝臟、腎臟的作用,這與文獻所報道的結(jié)果相一致[25?26]。
綜上所述,香灰菌茶水提物具有優(yōu)于綠茶及香灰菌的降血脂、改善脂肪肝和保護肝臟的作用,這可能是由于香灰菌與茶葉共同發(fā)酵培養(yǎng)過程中,產(chǎn)生了更加豐富、活性更優(yōu)的次生代謝產(chǎn)物,從而提高香灰菌發(fā)酵茶的降血脂功效。此研究將為開發(fā)新型保健茶及藥食同源物與茶葉的深度開發(fā)及應(yīng)用提供新資源和新研究思路,但其保肝、保腎、降脂作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制仍有待進一步深入研究。