肉豆蔻酸抑制豬鏈球菌細(xì)胞溶素活性及分子機(jī)制研究

王貴珍，劉洪濤，楊秀柏，姜雨晴，楊麗麗，邱家章,

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130052）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是一種具有莢膜的革蘭氏陽(yáng)性條件病原菌，也是一種重要的人獸共患病原菌[1?2]。根據(jù)莢膜抗原不同，豬鏈球菌被分為35 個(gè)血清型，其中2 型血清型被認(rèn)為是毒力最強(qiáng)的豬鏈球菌，可引發(fā)人和動(dòng)物產(chǎn)生多種疾病，如引發(fā)人產(chǎn)生細(xì)菌性腦膜炎、鏈球菌中毒樣休克綜合征等疾病，也可引發(fā)豬的急性敗血癥、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病[3?5]。我國(guó)在2005 年爆發(fā)了較大規(guī)模豬鏈球菌感染人案例，上百人發(fā)病并有數(shù)十人死亡[6]。近年來(lái)，由于抗生素的大量使用甚至濫用，導(dǎo)致豬鏈球菌產(chǎn)生耐藥性并呈現(xiàn)逐漸嚴(yán)重的趨勢(shì)[7]，使得針對(duì)該菌的感染防治變得非常困難。豬鏈球菌感染每年給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[8]?！跋蘅埂薄ⅰ皽p抗”政策的實(shí)施使畜禽養(yǎng)殖業(yè)面臨豬鏈球菌感染“復(fù)燃”，無(wú)藥可用等困境，因此臨床上迫切需要新的抗菌藥物應(yīng)對(duì)豬鏈球菌尤其是耐藥性豬鏈球菌感染。

豬鏈球菌的感染和致病過(guò)程依賴(lài)于其產(chǎn)生和分泌的多種毒力因子，包括分選酶、莢膜多糖等[9]。細(xì)胞溶素是豬鏈球菌感染及致病過(guò)程中非常重要的毒力因子，被譽(yù)為豬鏈球菌的“毒力標(biāo)志物”[10]。豬鏈球菌細(xì)胞溶素相對(duì)分子量54 kD，隸屬于膽固醇依賴(lài)型細(xì)胞溶素毒素家族，是典型的成孔毒素，具有裂解細(xì)胞、穿過(guò)血腦屏障和致死性等功能[11?12]。此外，豬鏈球菌細(xì)胞溶素可通過(guò)作用于TLR4 和p38-MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放[13?14]。豬鏈球菌細(xì)胞溶素對(duì)豬和人腸上皮細(xì)胞、腦微血管細(xì)胞等多種細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用[15]。研究者分別用野生株和敲除細(xì)胞溶素的豬鏈球菌感染小鼠，在相同感染時(shí)間內(nèi)敲除株不能引發(fā)小鼠死亡[16]。細(xì)胞溶素在感染過(guò)程中的重要作用使其成為篩選抗豬鏈球菌感染藥物的理想靶標(biāo)。

肉豆蔻酸又名十四烷酸，屬于飽和脂肪酸的一種，在食品行業(yè)用于各種香料的制備，同時(shí)也被用做增香劑添加到食品中。研究表明13-甲基肉豆蔻酸有多種藥理作用，如降低血糖[17]，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[18]，抗腫瘤[19]等。但是肉豆蔻酸藥理作用研究相對(duì)較少，本研究基于成孔活性試驗(yàn)和寡聚化試驗(yàn)分析了肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞溶素生物活性及寡聚體形成的影響；通過(guò)分子對(duì)接和分子模擬試驗(yàn)闡述了肉豆蔻酸與細(xì)胞溶素的作用機(jī)制，并在細(xì)胞水平上證實(shí)了肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌及細(xì)胞溶素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的緩解作用，為豬鏈球菌感染防治提供了潛在先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉豆蔻酸 純度≥98%，購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；豬鏈球菌細(xì)胞溶素蛋白 純度≥80%，來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；無(wú)菌脫纖維羊血 購(gòu)自鄭州九龍生物制品公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清 購(gòu)買(mǎi)于Thermo Fisher Scientific；小鼠巨噬細(xì)胞J774（BFN60807356）

購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；乳酸脫氫酶試劑盒

購(gòu)買(mǎi)于Roche；2 型豬鏈球菌（ZY05719）來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存。

Multiskan Spectrum 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品；CLX 雙色紅外激光成像系統(tǒng)基因有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；H2050R 離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZWY-211C 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血紅素釋放率及寡聚化試驗(yàn) 根據(jù)作者前期研究經(jīng)驗(yàn)及本次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定肉豆蔻酸濃度為4、8、16 μg/mL。0.25 μg 細(xì)胞溶素蛋白與不同濃度肉豆蔻酸于485 μL 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中在37 ℃共孵育20 min。隨后加入無(wú)菌脫纖維羊血（終濃度25%，500 μL 反應(yīng)體系），繼續(xù)在37 ℃孵育10 min，離心處理（10000 r/min，1 min），取上清置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)543 nm 處吸光值。經(jīng)無(wú)菌水或無(wú)菌磷酸鹽緩沖液處理的羊血作為陽(yáng)性或陰性對(duì)照。血紅素釋放率（%）=（A1?A0）/（A2?A0）×100，式中A0為陰性對(duì)照吸光值，A1為加肉豆蔻酸組吸光值，A2為不加肉豆蔻酸組吸光值。寡聚試驗(yàn)：細(xì)胞溶素蛋白與不同濃度肉豆蔻酸（0、4、16 μg/mL）共孵育（37 ℃，20 min）后加入羊血紅細(xì)胞誘導(dǎo)寡聚體形成，隨后加入無(wú)β-巰基乙醇的蛋白質(zhì)上樣緩沖液在55 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min。蛋白樣品用6%分離膠進(jìn)行分離后經(jīng)轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF,60 V，1.5 h）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，PBST 洗三次（80 r，5 min/次）后用鼠源細(xì)胞溶素一抗孵育2 h，PBST 洗三次后用熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗膜后于成像系統(tǒng)采集圖像，分析肉豆蔻對(duì)細(xì)胞溶素寡聚體形成的影響。

1.2.2 分子對(duì)接 細(xì)胞溶素作為受體蛋白，其結(jié)構(gòu)文件從Protein Data Bank（PDB）網(wǎng)站獲得（編號(hào)：3hvn），分子對(duì)接前受體（蛋白質(zhì)）和能量最小化后的配體小分子（肉豆蔻酸）用Autodock Tools 軟件進(jìn)行預(yù)處理。應(yīng)用Autodock Vina[20]軟件進(jìn)行對(duì)接試驗(yàn)，對(duì)接試驗(yàn)參數(shù)如下：size_x=120.0，size_y=74.0，size_z=72.0，center_x=33.558，center_y=20.947，center_z=34.705，間距1.0 ?。對(duì)接過(guò)程中蛋白質(zhì)保持剛性，小分子柔性鍵可旋轉(zhuǎn)，獲得穩(wěn)定的對(duì)接結(jié)構(gòu)，供后續(xù)分析。

1.2.3 分子模擬 經(jīng)對(duì)接分析確定最佳結(jié)合模式并獲得蛋白配體復(fù)合物后，從復(fù)合物中提取配體坐標(biāo)文件，并應(yīng)用Amber GAFF 立場(chǎng)獲得其拓?fù)湮募鞍淄負(fù)湮募?yīng)用Amber99SB 立場(chǎng)獲得。應(yīng)用Gromacs 2020.6[21]軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬試驗(yàn)，水模型采用TIP3P，模擬時(shí)長(zhǎng)130 ns。通過(guò)分析均方根偏差（RMSD）評(píng)價(jià)細(xì)胞溶素和肉豆蔻酸在模擬過(guò)程中的構(gòu)型，通過(guò)均方根波動(dòng)（RMSF）分析殘基結(jié)合肉豆蔻酸前后的柔性變化，基于殘基與配體的距離、氫鍵、結(jié)合能等指標(biāo)闡述肉豆蔻酸和細(xì)胞溶素作用的機(jī)制。

1.2.4 抗菌活性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌的抗菌活性。96 孔微量培養(yǎng)板中通過(guò)倍比稀釋法獲得含有不同濃度肉豆蔻酸（1～128 μg/mL）的豬鏈球菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基，隨后向每孔加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的豬鏈球菌并使其終濃度為5×105CFUs/mL。將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)靜置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度定義為肉豆蔻酸的最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）[22]。

1.2.5 乳酸脫氫酶活性實(shí)驗(yàn) 小鼠巨噬細(xì)胞J774 于含10%胎牛血清，100 U 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件37 ℃、5% CO2。細(xì)胞接種到96 孔板中（5×104細(xì)胞/孔）過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)至OD600=0.8 的豬鏈球菌離心（4000 r/min，5 min），無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗三次后用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并調(diào)整濃度至5×107CFUs/mL 備用；細(xì)胞溶素（1.5 μg/mL）加入細(xì)胞培養(yǎng)基混勻備用。用上述制備的菌液或細(xì)胞溶素溶液置換細(xì)胞培養(yǎng)液（100 μL/孔）并加入不同濃度肉豆蔻酸（0、4、16 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)5 h 后離心（1000 r/min，10 min）處理，取100 μL 上清加入等體積乳酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑體積細(xì)胞毒性試劑，室溫避光反應(yīng)30 min，于酶標(biāo)儀中檢測(cè)OD490。乳酸脫氫酶活性（%）=A1/A2×100[22]，式中A1為加肉豆蔻酸組吸光值，A2為不加肉豆蔻酸組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；應(yīng)用GraphPad Prism6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05 為差異顯著，P≤0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉豆蔻酸抑制豬鏈球菌細(xì)胞溶素成孔活性

血細(xì)胞被裂解后，其中的血紅素會(huì)釋放到體系中，血紅素在543 nm 處有最大吸光值，通過(guò)檢測(cè)其相對(duì)含量可定量評(píng)價(jià)細(xì)胞被裂解程度[23?25]。肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞溶素成孔活性抑制作用見(jiàn)圖1，當(dāng)反應(yīng)體系中肉豆蔻酸濃度為0 μg/mL 時(shí)，血紅素釋放率為100%，表明血細(xì)胞被細(xì)胞溶素裂解了，但是隨著肉豆蔻酸濃度的升高，體系中血紅素的比例呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)肉豆蔻酸濃度為4、8 和16 μg/mL時(shí)，血紅素釋放量分別是對(duì)照組的77.21%、22.2%和8.88%，即對(duì)細(xì)胞溶素生物活性抑制率分別為22.79%、77.8%和91.12%，表明肉豆蔻酸可劑量依賴(lài)性抑制豬鏈球菌細(xì)胞溶素的成孔活性。

圖1 不同濃度肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞溶素溶血活性的影響Fig.1 Effect of myristic acid with different concentrations on the pore-forming activity of suilysin

2.2 肉豆蔻酸抑制細(xì)胞溶素寡聚體形成

作為膽固醇依賴(lài)型細(xì)胞溶素，形成寡聚體刺入細(xì)胞膜是其發(fā)揮成孔活性的重要前提[26?27]。本研究通過(guò)體外誘導(dǎo)寡聚體形成試驗(yàn)分析了肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞溶素寡聚體形成的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有肉豆蔻酸時(shí)，形成了不同分子量大小的寡聚體，而當(dāng)體系中加入肉豆蔻酸且隨著其濃度的增加，寡聚體的形成表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢(shì)，表明肉豆蔻酸通過(guò)影響細(xì)胞溶素寡聚體的形成抑制其生物活性。

圖2 肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞溶素寡聚體形成的影響Fig.2 Effect of myristic acid on the oligomer formation of suilysin

2.3 肉豆蔻酸與細(xì)胞溶素在模擬過(guò)程中的穩(wěn)定性

以蛋白質(zhì)初始結(jié)構(gòu)為參照，模擬過(guò)程中蛋白主鏈相對(duì)初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.60 nm（紅色線(xiàn)），表明蛋白在模擬過(guò)程中保持了相對(duì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，肉豆蔻酸相對(duì)蛋白初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.64 nm（黑色線(xiàn)），表明在整個(gè)模擬過(guò)程中蛋白與配體保持了相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)合模式。以肉豆蔻酸初始結(jié)構(gòu)為參照，其重原子（非氫原子）相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.24 nm（藍(lán)色線(xiàn)），表明肉豆蔻酸在模擬過(guò)程中保持了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（圖3）。綜上所述模擬過(guò)程中蛋白和配體均保持了相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)型和結(jié)合模式，可用于后續(xù)分析。

圖3 模擬過(guò)程中蛋白和配體的動(dòng)力學(xué)Fig.3 The kinetics of protein and ligand during the molecular simulation

2.4 肉豆蔻酸與細(xì)胞溶素的結(jié)合模式

細(xì)胞溶素和肉豆蔻酸對(duì)接結(jié)果如圖4 所示，肉豆蔻酸結(jié)合到細(xì)胞溶素第1、2 和3 結(jié)構(gòu)域的交界處，分布在肉豆蔻酸周?chē)陌被釟埢c其有潛在的相互作用。

圖4 細(xì)胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合模式及結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 The binding mode and sites between suilysin and myristic acid

為了進(jìn)一步確認(rèn)與肉豆蔻酸相互作用的殘基，通過(guò)分子力學(xué)/泊松-波爾茲曼表面積（Molecular Mechanics Poisson Boltzmann Surface Area，MMPBSA）方法分析了結(jié)合過(guò)程中的總結(jié)合能，結(jié)果如表1 所示，肉豆蔻酸和細(xì)胞溶素的總結(jié)合能平均值為?112.39 kJ/mol，表明二者之間有較強(qiáng)的相互作用力，其中范德華作用力?167.68 kJ/mol，靜電相互作用?27.32 kJ/mol，非極性溶劑化能量?20.93 kJ/mol，表明范德華在肉豆蔻酸和細(xì)胞溶素的結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用，此外靜電相互作用和非極性溶劑能也促進(jìn)了二者的結(jié)合。極性溶劑化能為103.53 kJ/mol。

表1 肉豆蔻酸和細(xì)胞溶素結(jié)合過(guò)程能量值（kJ/mol）Table 1 The energy between myristic acid and suilysin (kJ/mol)

氫鍵是蛋白配體結(jié)合過(guò)程中常見(jiàn)的相互作用力，本研究基于GROMACS 軟件分析，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)氫鍵存在于細(xì)胞溶素和肉豆蔻酸的相互作用中，形成氫鍵的殘基分別是84 位和374 位的絲氨酸、372 位的異亮氨酸和82 位的天冬酰胺（表2）。84 位和372位氨基酸殘基和肉豆蔻酸形成氫鍵在模擬過(guò)程中存在率均為90%，表明這兩個(gè)氫鍵是穩(wěn)定存在的，而另外兩個(gè)氫鍵的存在率分別為10%和30%，表明這兩個(gè)氫鍵并非穩(wěn)定存在于整個(gè)模擬過(guò)程中。因此84 位和372 位殘基與配體形成氫鍵對(duì)穩(wěn)定復(fù)合物體系有較大貢獻(xiàn)。

表2 肉豆蔻酸與細(xì)胞溶素結(jié)合過(guò)程氫鍵詳情T(mén)able 2 The details of H-bond between myristic acid and suilysin

2.5 細(xì)胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合能分析

分子力學(xué)/泊松-波爾茲曼表面積方法（MMPBSA）廣泛應(yīng)用于蛋白配體相互作用能分析[28?30]，本研究為了進(jìn)一步明確細(xì)胞溶素和肉豆蔻酸的結(jié)合位點(diǎn)，基于MMPBSA 結(jié)合能分析程序包，分析了結(jié)合過(guò)程中每個(gè)氨基酸殘基的能量貢獻(xiàn)，各個(gè)氨基酸殘基分解能量見(jiàn)圖5A，其中82Asn、83Asn、84Ser、87Ile、88Ala、90Ile、193Phe、194Gly、275Phe、372Ile、373Leu、374Ser 有相對(duì)較大的總能量貢獻(xiàn)值，表明這些殘基是結(jié)合過(guò)程中的關(guān)鍵殘基。進(jìn)一步分析了殘基各個(gè)能量分項(xiàng)的貢獻(xiàn)值，結(jié)果如圖5B 所示，上述12 個(gè)殘基與肉豆蔻酸都有較強(qiáng)的范德華作用力，再次證實(shí)范德華是二者結(jié)合的重要作用方式，此外84Ser、372Ile和374Ser 與肉豆蔻酸有較大的靜電相互作用，說(shuō)明靜電作用是細(xì)胞溶素和肉豆蔻酸另一種重要的相互作用力。

圖5 細(xì)胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合能Fig.5 The binding energy between myristic acid and suilysin

2.6 結(jié)合位點(diǎn)的確證

為了進(jìn)一步確認(rèn)，分析了結(jié)合過(guò)程中各殘基與肉豆蔻酸的距離，從結(jié)合過(guò)程中細(xì)胞溶素各個(gè)殘基與肉豆蔻酸的距離（圖6A）中發(fā)現(xiàn)上述能量貢獻(xiàn)較大的殘基與肉豆蔻酸有更近的距離（圖6B）。均方根波動(dòng)數(shù)值（RMSF）可反映原子或殘基的柔性，本研究分別分析了蛋白質(zhì)在結(jié)合配體前后的RMSF 值，發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)合小分子后各殘基的RMSF 值（尤其是上述能量貢獻(xiàn)較大的殘基）較結(jié)合小分子前?。▓D6C），表明結(jié)合小分子后，這些殘基受到了束縛，變得剛性。

圖6 細(xì)胞溶素與肉豆蔻酸距離及結(jié)合前后殘基柔性變化Fig.6 The distance between suilysin and myristic acid and the flexibility of residues before and after binding with myristic acid

2.7 肉豆蔻酸的抗豬鏈球菌活性

細(xì)菌在長(zhǎng)期生存壓力下會(huì)進(jìn)化出耐藥性，本研究根據(jù)MIC 試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（肉眼觀察沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度定義為肉豆蔻酸的最低抑菌濃度）確定肉豆蔻酸對(duì)豬鏈球菌的最低抑菌濃度為128 μg/mL，表明肉豆蔻酸無(wú)抗豬鏈球菌活性，不會(huì)對(duì)該菌造成生長(zhǎng)壓力。

2.8 肉豆蔻酸緩解豬鏈球菌及細(xì)胞溶素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性

細(xì)胞溶素與細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合后形成寡聚體刺入細(xì)胞膜會(huì)引發(fā)細(xì)胞毒性作用，研究表明豬鏈球菌細(xì)胞溶素的細(xì)胞毒性作用在其致病性中發(fā)揮重要作用[31?32]，因此藥物緩解細(xì)胞溶素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有望延遲豬鏈球菌感染病程的發(fā)展。細(xì)胞受外界刺激死亡后，其中的乳酸脫氫酶（LDH）會(huì)釋放到外環(huán)境，該酶在490 nm 處有最大吸光值；本研究通過(guò)檢測(cè)乳酸脫氫酶活性分別評(píng)價(jià)了肉豆蔻酸對(duì)細(xì)胞溶素和豬鏈球菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的緩解效果。以細(xì)胞溶素或豬鏈球菌處理組釋放的乳酸脫氫酶作為參比，當(dāng)加入肉豆蔻酸處理后，LDH 釋放量顯著減少（P<0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系（圖7A、7B），表明肉豆蔻酸可在細(xì)胞水平顯著緩解細(xì)胞溶素或豬鏈球菌引發(fā)的細(xì)胞毒性作用。

圖7 肉豆蔻酸緩解細(xì)胞溶素及豬鏈球菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性Fig.7 The alleviatory effects of myristic acid on the cytotoxicity mediated by suilysin and Streptococcus sui

3 討論

細(xì)胞溶素可從多個(gè)方面促進(jìn)豬鏈球菌的致病性，是抗豬鏈球菌感染抑制劑開(kāi)發(fā)重要靶標(biāo)[27,33]。成孔活性是細(xì)胞溶素發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，本研究基于成孔活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)食源性成分肉豆蔻酸濃度在16 μg/mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞溶素成抗活性抑制率達(dá)到90%以上。作為膽固醇依賴(lài)型細(xì)胞溶素家族成員，形成寡聚體對(duì)其發(fā)揮成孔活性至關(guān)重要，于是推測(cè)肉豆蔻酸可能直接與細(xì)胞溶素結(jié)合并影響了其寡聚體的形成，體外誘導(dǎo)寡聚試驗(yàn)證實(shí)在16 μg/mL 時(shí)肉豆蔻酸顯著抑制了細(xì)胞溶素寡聚體的形成。

細(xì)胞溶素蛋白由四個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域在寡聚體的形成過(guò)程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化都會(huì)影響寡聚體的形成[34]。本研究為了深入分析肉豆蔻酸與細(xì)胞溶素的作用機(jī)制，開(kāi)展了分子對(duì)接和對(duì)子動(dòng)力學(xué)模擬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸可直接結(jié)合到豬鏈球菌細(xì)胞溶素的第一、第二和第三結(jié)構(gòu)域的交界處，并通過(guò)能量分解，殘基柔性變化及距離分析等確定87Ile、193Phe、194Gly、275Phe、372Ile 和373Leu 等氨基酸殘基是二者結(jié)合過(guò)程中的關(guān)鍵殘基。

作為豬鏈球菌的關(guān)鍵毒力因子，細(xì)胞溶素的成孔活性能導(dǎo)致細(xì)胞裂解，內(nèi)容物釋放，引發(fā)細(xì)胞毒性[11,15]，因此緩解其細(xì)胞毒性作用可在一定程度上延遲豬鏈球菌感染疾病的進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸濃度在16 μg/mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞溶素和豬鏈球菌引發(fā)的細(xì)胞毒性分別降低了32.16%和54.28%。

4 結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)食源性生物活性成分肉豆蔻酸可直接結(jié)合到豬鏈球菌細(xì)胞溶素的第一、第二和第三結(jié)構(gòu)域的交界處，并在濃度為16 μg/mL 通過(guò)抑制細(xì)胞溶素寡聚體形成，對(duì)其成孔活性抑制率達(dá)91.12%。無(wú)抗菌活性的肉豆蔻酸（MIC=128 μg/mL）在濃度為16 μg/mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞溶素和豬鏈球菌引發(fā)的細(xì)胞毒性分別降低了32.16%和54.28%。以上結(jié)果表明肉豆蔻酸有望作為先導(dǎo)化合物被開(kāi)發(fā)為抗豬鏈球菌感染的臨床藥物，作用機(jī)制的闡明為該化合物更好更快地應(yīng)用于實(shí)際提供了重要理論基礎(chǔ)。