基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討辣木葉抗肥胖的作用機(jī)制

李婷婷，管 亞，弘子姍，解 靜,3,4, ，田 洋,3,4,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.國(guó)家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201；3.教育部食藥同源資源開發(fā)與利用工程中心，云南昆明 650201；4.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南昆明 650201）

隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等的改變，全球肥胖患病群體日益龐大，隨之誘發(fā)的糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、癌癥等多種疾病嚴(yán)重威脅人類健康，因此，肥胖已成為棘手的公共衛(wèi)生問題。目前，歐盟批準(zhǔn)的肥胖癥治療藥物——奧利司他[1]，可通過阻止脂肪攝入和卡路里吸收發(fā)揮減肥作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)引發(fā)胃腸及肝臟損傷等副作用。天然產(chǎn)物由于具有低毒、低副作用等特點(diǎn)，備受人們關(guān)注，因此，探究天然產(chǎn)物抗肥胖作用及機(jī)制是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

辣木（Moringa oleiferaLam.）又名辣根樹、鼓槌樹，為辣木科辣木屬植物，廣泛種植于熱帶、亞熱帶國(guó)家和地區(qū)[2]。辣木葉除了富含多種營(yíng)養(yǎng)素外，還被作為一種傳統(tǒng)藥用植物被廣泛使用。印度阿育吠陀藥典記載，辣木葉具有消炎止痛、保肝利尿、降脂降壓、明目醒腦等多種功效[3]。此外，隨著對(duì)辣木研究的深入，大量研究發(fā)現(xiàn)辣木葉中富含多酚、黃酮、生物堿、糖苷及有機(jī)酸酯等多種生物活性物質(zhì)，并且這些活性成分發(fā)揮著抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、降低血糖和血脂等作用[4]。2012 年，我國(guó)衛(wèi)生部第19 號(hào)文件公布辣木葉為新資源食品，自此，辣木葉在食品、藥物及功能性原料等方面的開發(fā)和應(yīng)用深受人們重視。

目前已有大量研究報(bào)道了辣木葉抑制脂質(zhì)積累的作用。例如，Ahmed 等[5]發(fā)現(xiàn)，辣木葉中的酚類化合物（阿魏酸、山奈酚、肉桂酸、鞣花酸等）可以逆轉(zhuǎn)高脂飲食大鼠肝臟脂質(zhì)積累，通過抑制脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)發(fā)揮抗肥胖活性。楊學(xué)芳等[6]證實(shí)，辣木葉水提物具有改善代謝紊亂小鼠暴飲暴食癥狀，調(diào)節(jié)瘦素和胃饑餓素表達(dá)水平，降低小鼠食物攝入及血脂水平的作用。此外，辣木葉提取物抑制了代謝綜合征大鼠肥胖，改善了血清血脂四項(xiàng)水平，減少了大鼠脂肪堆積[7]；辣木葉提取物還顯著降低了高脂飲食大鼠血清、肝臟和腎臟中總膽固醇水平[8]；辣木葉提取物可通過AMPK 信號(hào)通路促進(jìn)3T3-L1 細(xì)胞凋亡而降低脂肪生成[9]。但是，盡管目前已有大量研究報(bào)道辣木葉具有抑制脂質(zhì)積累的作用，但其研究多停留在提取物層面，關(guān)于其抗肥胖的主要活性成分及其作用機(jī)制仍不清楚。

近年來，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析為傳統(tǒng)天然藥物的現(xiàn)代研究提供了新的思路、理論和方法，其可全面闡釋多成分天然植物的藥用潛在活性與其疾病靶點(diǎn)的相互作用機(jī)制[10]。分子對(duì)接是一種流行且有效的計(jì)算機(jī)輔助藥物開發(fā)技術(shù)，是基于靶蛋白（受體）的活性位點(diǎn)，利用空間和能量的作用模式通過藥效團(tuán)匹配小分子（配體）的研究策略。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，深入探究了辣木葉抗肥胖的活性成分及其作用機(jī)制，為辣木葉防治肥胖功能食品的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 辣木葉成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及肥胖靶點(diǎn)篩選

通過查閱文獻(xiàn)，建立辣木葉活性成分虛擬文庫(kù)（共111 個(gè)化合物）。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載辣木葉活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)并保存為SMILES 號(hào)。通過SwissADME平臺(tái)（http://www.swissadme.ch）和Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）線上靶點(diǎn)篩選平臺(tái)，設(shè)置靶點(diǎn)屬性為“homo sapiens”，預(yù)測(cè)辣木葉活性成分的潛在靶點(diǎn)，剔除無法查詢SMILES 號(hào)的化合物及重復(fù)靶點(diǎn)，選取Probability*≥0.1 的活性靶點(diǎn)，采用Excel 整合進(jìn)行下一步分析。

以“obesity”為檢索詞，基因ID 為“C0028754”，在 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/Score gda），以“summary of Gene-Disease Associations”為條件檢索基因疾病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，去除無Uniprot ID 的靶點(diǎn)及重復(fù)靶點(diǎn)，取Score_gda 值大于0.1 的肥胖相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny 2.0.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）平臺(tái)將收集得到的辣木葉成分靶點(diǎn)與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)，以Uniprot ID 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)取交集，即得到辣木葉活性成分治療肥胖的潛在作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)和潛在活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件，利用Network Analyzer 分析節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)并以Degree（自由度）為依據(jù)，繪制成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出辣木葉防治肥胖的核心活性成分。

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)置生物屬性為“homo sapiens”，“highest confidence”為0.4，刪除無相互作用節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用Cytoscape3.8.2 軟件以不同顏色、大小、Degree（自由度）進(jìn)行可視化，篩選出辣木葉活性成分作用的潛在核心肥胖靶點(diǎn)。

1.3 GO 和KEGG 功能富集分析

通過David 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.abcc.ncifcrf.gov）對(duì)辣木葉活性成分抗肥胖潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene ontology）功能分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。根據(jù)靶點(diǎn)數(shù)（Count）降序排列，分別選取GO 分析中生物過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）和細(xì)胞成分（Cellular component）三大生物進(jìn)程參數(shù)的前10 條繪制柱狀圖，進(jìn)行下一步分析。根據(jù)P-value 值升序排列，選取P值前20 條通路繪制KEGG 通路富集分析氣泡圖并評(píng)估其相關(guān)性。

1.4 辣木葉成分-肥胖靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了進(jìn)一步分析成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路之間的多層生物信息網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“辣木葉活性成分-肥胖靶點(diǎn)-信號(hào)通路”互作網(wǎng)絡(luò)圖，利用拓?fù)浞治龊Y選出生物學(xué)重要性最強(qiáng)的節(jié)點(diǎn)作為核心成分和靶點(diǎn)。

1.5 辣木葉活性成分與關(guān)鍵靶基因的分子對(duì)接驗(yàn)證

將辣木葉防治肥胖的相關(guān)核心活性成分作為L(zhǎng)igands（配體），通路富集的重要核心靶點(diǎn)作為受體分子，通過RCSB（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.Php）下載受體分子的晶體結(jié)構(gòu)和核心活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Auto Dock4.2 軟件將活性成分的3D 結(jié)構(gòu)加氫，檢測(cè)扭轉(zhuǎn)鍵，設(shè)置扭轉(zhuǎn)鍵，設(shè)置為對(duì)接配體；將靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)去水、加氫，設(shè)置包裹整個(gè)蛋白的對(duì)接Gridbox，以及將處理好的成分和靶點(diǎn)進(jìn)行Auto Dock vina 分子對(duì)接，采用PyMOL2.Ink 軟件進(jìn)行可視化繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉活性成分及肥胖相關(guān)靶點(diǎn)篩選

經(jīng)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)篩選獲得60 個(gè)水溶性的辣木葉活性成分（表1）。其中，滿足辣木葉目標(biāo)成分條件的有效活性成分50 個(gè)，潛在靶點(diǎn)2359 個(gè)，剔除重復(fù)值后共有靶點(diǎn)563 個(gè)。

表1 辣木葉活性成分信息及其參數(shù)Table 1 The main active ingredients and parameters of Moringa oleifera Lam.leaves

從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)得到2821 個(gè)肥胖相關(guān)靶點(diǎn)，去除無Uniprot ID，Score_gda 值大于0.1 及重復(fù)項(xiàng)后共獲得761 個(gè)滿足條件的肥胖相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2 辣木葉活性成分防治肥胖的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述篩選的辣木葉活性成分-肥胖靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)一步繪制了辣木葉活性成分和疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），該網(wǎng)絡(luò)包含181 個(gè)作用節(jié)點(diǎn)，640 條相互作用邊，圖中矩形表示成分作用于疾病的共同靶點(diǎn)，圓形表示辣木葉活性成分。此外，形狀面積越大表示涉及Degree 值越大，參與直接作用節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，同樣說明高Degree 值的靶點(diǎn)參與生物學(xué)功能越多，涉及的生物學(xué)重要性越強(qiáng)。

圖1 辣木葉活性成分抗肥胖靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves of the anti-obesity target interaction network

由圖1 可知，依據(jù)Degree 值篩選到相互作用靶點(diǎn)最多的前十一個(gè)活性成分分別為亞油酸（Linoleic acid）、亞麻酸（Linolenic acid）、泡桐酸（Paullinic acid）、芹菜素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）、山柰素（Kaempferide）、金雀異黃素（Genistein）、鼠李黃素（Rhamnetin）、楊梅素（Myricetin）和膽甾-5 烯-3 醇（Cholest-5-en-3-ol），其Degree 關(guān)聯(lián)度值為35、33、31、27、26、25、25、25、24、24、24（表2），以上成分中亞油酸表現(xiàn)出最高關(guān)聯(lián)度，涉及102 個(gè)作用節(jié)點(diǎn)，表明亞油酸及以上辣木葉活性成分可能具有較強(qiáng)的抗肥胖潛力。

表2 辣木葉核心活性成分對(duì)應(yīng)防治肥胖關(guān)鍵靶點(diǎn)基因Table 2 Core active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves correspond to key target genes in the fight against obesity

2.3 辣木葉防治肥胖潛在交集靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的辣木葉活性成分靶點(diǎn)與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件和Venny 2.1.0 平臺(tái)構(gòu)建交集靶點(diǎn)韋恩圖（圖2），將得到的126 個(gè)交集靶點(diǎn)移交至STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行辣木葉活性成分靶點(diǎn)-肥胖靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化（圖2），得到123 個(gè)作用節(jié)點(diǎn)，1124 條相互作用邊，平均自由度為18.28。由圖可知，辣木葉活性成分治療肥胖的絕大多數(shù)靶點(diǎn)具有一至多條的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，其中靶點(diǎn)顏色和形狀可直觀體現(xiàn)出辣木葉防治肥胖過程中可能通過這些靶點(diǎn)起到降脂作用。

圖2 辣木葉活性成分靶點(diǎn)和肥胖靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)和PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Active ingredient related targets of Moringa oleifera Lam.leaves and obesity target intersection targets and PPI network

2.4 GO 功能富集

將126 個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入David 在線平臺(tái)，以通路中的基因數(shù)（Count）和P值為條件進(jìn)行生物過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）和細(xì)胞組分（Cellular component）三方面GO 功能富集分析（圖3）。結(jié)果顯示，辣木葉防治肥胖的作用靶點(diǎn)在GO 生物進(jìn)程中注釋到細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控、藥物應(yīng)答等496 個(gè)條目，包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、信號(hào)傳導(dǎo)（Signal transduction）、基因表達(dá)的正正向調(diào)控（Positive regulation of gene expression）、蛋白質(zhì)磷酸化（Protein phosphorylation）、DNA 為模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（Positive regulation of transcription，DNA-templated）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Regulation of transcription from RNA polymerase IIpromoter）、藥物反應(yīng)（Response to drug）、凋亡表達(dá)的正調(diào)控（Positive regulation of apoptotic expression）及凋亡表達(dá)的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic expression）等。

圖3 辣木葉活性成分治療肥胖基因GO 富集分析結(jié)果Fig.3 The results of Moringa oleifera Lam.leaves active ingredient prevention and treatment of obesity gene GO enrichment analysis

在GO 細(xì)胞組分中主要被注釋到細(xì)胞膜、質(zhì)、核及其表面外環(huán)境等，包括質(zhì)膜（Plasma membrane）、胞質(zhì)溶膠（Cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、核（Nucleus）、膜（Membrane）、膜的組成部分（Integral component of membrane）、核質(zhì)（Nucleoplasm）、細(xì)胞外泌體（Extracellular exosome）、胞外區(qū)（Extracellular region）、細(xì)胞外空間（Extracellular space）等71 個(gè)條目。在GO 分子功能中被注釋到分子間相互結(jié)合上，包括蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、相同的蛋白結(jié)合（Identical protein binding）、ATP 結(jié)合（ATP binding）、鋅離子結(jié)合（Zinc ion binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）、序列特異性DNA 結(jié)合（Sequence-specific DNA binding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、RNA 聚合酶II 核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA 結(jié)合（RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding）、RRNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性的序列特異性DNA 結(jié)合（RNA polymerase II transcription factor activity,sequence-specific DNA binding）、DNA 結(jié)合（DNA binding）等118 個(gè)條目。結(jié)果表明辣木葉活性成分通過參與眾多生命進(jìn)程抑制肥胖。

2.5 KEGG 信號(hào)通路富集

為闡明辣木葉防治肥胖的作用機(jī)制，將126 個(gè)潛在核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路注釋分析，共富集到146 條相關(guān)信號(hào)通路，具有顯著意義共117 條（P<0.01）。前20 條信號(hào)通路被認(rèn)為在辣木葉防治肥胖的過程中發(fā)揮重要作用（圖4a），由表3 可觀察到辣木葉防治肥胖的信號(hào)通路顯著富集在HIF-1 信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路、癌癥及炎癥信號(hào)通路等，并且這些通路大量富集PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、AKT1、MAKP1、MTOR 等多個(gè)關(guān)鍵靶基因（圖4b），間接表明機(jī)體的肥胖狀態(tài)由多通路、多靶點(diǎn)調(diào)控，是一種復(fù)雜機(jī)制的代謝性疾病。

圖4 辣木葉活性成分治療肥胖的KEGG 通路富集圖（a）和前20 條通路富集關(guān)鍵基因（b）Fig.4 KEGG pathway enrichment map of the active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves preventing and treating obesity (a)and the proportion of key target genes in the top 20 pathways (b)

表3 辣木葉活性成分防治肥胖的KEGG 通路排名前15 位富集分析Table 3 Enrichment analysis of the top 15 KEGG pathways ranking of active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves for obesity control

2.6 辣木葉活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進(jìn)一步探究辣木葉防治肥胖作用機(jī)制中活性成分、作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，將關(guān)鍵降脂藥效成分、肥胖靶點(diǎn)和信號(hào)通路運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“成分-疾病-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），圖中黃色菱形表示藥效成分，藍(lán)色矩形表示作用靶點(diǎn)，橙色三角形表示信號(hào)通路，利用圖中連線表示各節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系和強(qiáng)度。結(jié)果顯示，15 條信號(hào)通路富集到55 個(gè)靶基因，其中PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、AKT1、MAKP1、MTOR等關(guān)鍵靶點(diǎn)與成分之間存在重復(fù)多次作用于多條信號(hào)通路的情況，因此，辣木葉活性成分可能通過多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化、代謝及特異性結(jié)合等信號(hào)表達(dá)對(duì)防治肥胖發(fā)揮重要作用。研究表明辣木葉活性成分防治肥胖通過多個(gè)成分作用于同一靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同治療作用。

圖5 辣木葉活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Active ingredient of Moringa oleifera Lam.leaves-target-signaling pathway network diagram

2.7 辣木葉活性成分與關(guān)鍵靶基因的分子對(duì)接驗(yàn)證

應(yīng)用AutoDock 4.2 軟件對(duì)辣木葉11 種活性成分與通路富集前六的核心基因（PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、AKT1、MAPK1、MTOR）進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證（圖6）。在該軟件的分子對(duì)接評(píng)分中，對(duì)接分?jǐn)?shù)越低、構(gòu)象越穩(wěn)定，則結(jié)合活性越好，對(duì)接結(jié)果見表4，根據(jù)對(duì)接評(píng)分篩選最佳結(jié)合模式進(jìn)行可視化分析（圖7）。結(jié)果顯示，靶點(diǎn)蛋白PIK3R1 與鼠李黃素呈現(xiàn)出最低的對(duì)接評(píng)分，為?9.2 kcal/mol；其次是PIK3CA 與膽甾-5 烯-3 醇，為?9.1 kcal/mol；PIK3R1與楊梅素，為?8.8 kcal/mol；AKT1 與木犀草素，為?8.7 kcal/mol。

圖6 辣木葉活性成分與對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能熱圖（kcal/mol）Fig.6 Heat map of molecular docking binding energy between the active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves and the corresponding core targets (kcal/mol)

圖7 前四個(gè)辣木葉活性成分與對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接可視化圖Fig.7 Molecular docking patterns of the first four Moringa oleifera Lam.leaves active ingredients to their corresponding core targets

表4 辣木葉活性成分與對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）Table 4 Molecular docking binding energy of active ingredients of Moringa oleifera Lam.leaves with corresponding core targets(kcal/mol)

3 討論

據(jù)報(bào)道，中國(guó)等亞洲國(guó)家近乎一半的成年人患有肥胖癥[11]，且全球每年至少280 萬人死于代謝性疾病，超重和肥胖被認(rèn)為是一場(chǎng)健康危機(jī)，給人類健康帶來巨大挑戰(zhàn)[12]。近年來，辣木葉的多種藥理功效逐漸被挖掘和證實(shí)，是治療肥胖的天然候選者。中藥本身是一種“多成分-多靶點(diǎn)-多療效”的復(fù)雜體系，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可借助虛擬篩選和網(wǎng)絡(luò)分析來預(yù)測(cè)新的藥效成分，因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“成分-疾病-靶標(biāo)”的研究策略，并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，全面探究了辣木葉抗肥胖的活性成分及其作用機(jī)制。

本文通過數(shù)據(jù)庫(kù)信息檢索和相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，獲得辣木葉活性成分防治肥胖的126 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。并且基于辣木葉活性成分和肥胖靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖篩選，發(fā)現(xiàn)辣木葉中發(fā)揮抗肥胖作用的主要活性成分為亞油酸、亞麻酸、泡桐酸、芹菜素、木犀草素、山奈酚、山柰素、金雀異黃素、鼠李黃素、楊梅素、膽甾-5 烯-3 醇等。由其相互作用網(wǎng)絡(luò)圖可知，辣木葉活性成分防治肥胖的絕大多數(shù)成分和靶點(diǎn)具有一至多條的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，表明辣木葉抗肥胖可能由多活性成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同作用，可為辣木葉防治肥胖的進(jìn)一步研究提供方向。

將126 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 富集，發(fā)現(xiàn)辣木葉活性成分抗肥胖的核心靶點(diǎn)參與眾多生命進(jìn)程，主要涉及細(xì)胞組成、細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控和分子間蛋白結(jié)合等。KEGG 信號(hào)通路主要注釋到HIF-1 信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路及癌癥信號(hào)通路等。HIF-1α是細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，在低氧條件下，HIF 通過激活線粒體氧化磷酸化向無氧糖酵解的轉(zhuǎn)換，還可通過丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，降低線粒體功能，防止肝脂質(zhì)沉積[13]，對(duì)維持細(xì)胞糖脂代謝起著關(guān)鍵作用。肥胖和2 型糖尿病是胰島素抵抗（IR）的典型代謝綜合征，IR 主要是胰島素受體對(duì)胰島素失去敏感性，使負(fù)反饋機(jī)制受損導(dǎo)致高血糖和高胰島素發(fā)生[14]，是誘發(fā)代謝性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的經(jīng)典信號(hào)通路，IRS/PI3K/AKT 是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的主要通路。胰島素受體與胰島素結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)反應(yīng)，使磷酸化的胰島素受體底物IRS 激活下游PI3K-AKT 信號(hào)聯(lián)動(dòng)抑制糖異生，促進(jìn)糖原合成并改善胰島素抵抗[15]。而在癌癥的發(fā)展過程中，機(jī)體內(nèi)病變細(xì)胞同樣發(fā)生過度增殖，激活生長(zhǎng)因子和癌癥調(diào)控受體，致使病變細(xì)胞不受控制的無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的另一條重要通路（Ras-MAPK 信號(hào)通路）調(diào)控著細(xì)胞的增殖與分化，其下游ERK1/2 失調(diào)是導(dǎo)致癌癥的重要級(jí)聯(lián)蛋白之一。然而EGFR 激活的EGFR-PI3K/AKT信號(hào)通路同樣控制著細(xì)胞增殖、遷移及血管生成，是引發(fā)腫瘤的經(jīng)典途徑[16]。并且PI3K/AKT 途徑下游的mTOR 靶基因也被證明通過改變癌癥代謝控制著絕大多數(shù)癌癥細(xì)胞生命活動(dòng)[17]。由此可知，PI3K/AKT 這條經(jīng)典的信號(hào)通路與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、癌癥的發(fā)生密不可分，同樣直接或間接地證明肥胖的發(fā)生與該信號(hào)通路有著重要聯(lián)系。

值得注意的是，由信號(hào)通路富集得到的關(guān)鍵基因主要包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、AKT1、MAPK1、MTOR 等，其中PIK3CA、PIK3CB 和PIK3R1均屬磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的p110 催化亞基[18]，PI3K 作為PI3K/AKT 信號(hào)通路的核心分子控制著重要的細(xì)胞生命活動(dòng)。而AKT1[15]作為促進(jìn)細(xì)胞存活的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，受胰島素和生長(zhǎng)因子等多種激素的調(diào)節(jié)，增加AKT 磷酸化周期蛋白依賴性激酶的活性可影響3T3-L1 細(xì)胞的增殖分化[19]。AKT 作為通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，磷酸化后可激活下游蛋白發(fā)揮級(jí)聯(lián)效應(yīng)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖，但重要的是當(dāng)AKT 活化受損時(shí)會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗引起機(jī)體代謝紊亂。雷帕霉素靶蛋白（MTOR）是PI3K 相關(guān)激酶（PIKK）家族中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[20]，參與控制脂肪細(xì)胞功能和PI3K/AKT/MTOR 途徑的脂質(zhì)代謝。此外，MTOR還是細(xì)胞自噬的主要調(diào)節(jié)因子[21]，依靠PI3K/AKT的介導(dǎo)而激活參與蛋白質(zhì)、核苷酸和脂質(zhì)的生物合成，但是肥胖的發(fā)生往往使MTOR 過度激活導(dǎo)致脂肪組織的自噬信號(hào)失調(diào)和產(chǎn)生胰島素抵抗。絲裂原活化蛋白激酶超家族（MAPKs）主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK 三 類[21]。MAPK1 是ERK/MAPK 信 號(hào)通路的重要靶蛋白，直接參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖分化，且MAPK 的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)可最終激活P38MAPK 途徑引起炎癥和胰島素抵抗[22]。JNK 途徑[23]則通過激活胰島素受體底物AKT 磷酸化而調(diào)控機(jī)體代謝紊亂。因此，辣木葉活性成分可能通過HIF-1、胰島素抵抗、EGFR 和癌癥等多通路下游靶標(biāo)作用于胰島素受體，間接激活PI3K/AKT 經(jīng)典信號(hào)通路起到抗肥胖作用。

研究顯示，當(dāng)分子對(duì)接分?jǐn)?shù)小于0 時(shí)，表明配體分子與受體蛋白可自行結(jié)合；當(dāng)對(duì)接分?jǐn)?shù)小于?4 kcal/mol 時(shí)，表明兩者間有一定的對(duì)接活性；當(dāng)對(duì)接分?jǐn)?shù)小于?5.0 kcal/mol 時(shí)，表明兩者間有較好的對(duì)接活性；當(dāng)對(duì)接分?jǐn)?shù)小于?7.0 kcal/mol 時(shí)，表明兩者間有強(qiáng)烈的對(duì)接活性[24]。通過11 個(gè)關(guān)鍵活性成分和6 個(gè)主要核心基因的分子對(duì)接研究，發(fā)現(xiàn)11 個(gè)關(guān)鍵活性成分與其中三個(gè)靶點(diǎn)（PIK3R1、PIK3CA、AKT1）的對(duì)接活性最強(qiáng)，尤其是關(guān)鍵靶點(diǎn)PIK3R1與鼠李黃素之間呈現(xiàn)最低的對(duì)接分?jǐn)?shù)（?9.2 kcal/mol），結(jié)合構(gòu)象最為穩(wěn)定；其次是PIK3CA 與膽甾-5 烯-3 醇，為?9.1 kcal/mol；PIK3R1 與楊梅素，為?8.8 kcal/mol；AKT1 與木犀草素，為?8.7 kcal/mol。結(jié)果表明，以上四種化合物可能是辣木葉抗肥胖的主要活性成分，且其可能通過作用這些靶點(diǎn)發(fā)揮抗肥胖作用。鼠李黃素是一種天然類黃酮，在抗炎、抗氧化和抗腫瘤等方面表現(xiàn)出顯著效果[25]。研究報(bào)道，鼠李黃素可通過降低C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα等脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)來抑制3T3-L1 細(xì)胞脂肪早期的增殖分化，發(fā)揮抑制脂質(zhì)積累作用[26]；可通過抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎癥通路MAPK、ERK、JNK 和環(huán)氧合酶-2（COX-2）途徑中相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用、抗肥胖和胰島素抵抗作用[27?28]。膽甾-5 烯-3 醇又名膽甾醇、膽固醇，外源性膳食甾醇是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅參與調(diào)節(jié)質(zhì)膜的流動(dòng)性和滲透性，還是所有類固醇激素的前體物質(zhì)[29]。膳食補(bǔ)充植物甾醇在一定程度上不僅降低血清中低密度脂蛋白水平[30]，而且植物甾醇能夠顯著改善膽固醇代謝[31]。楊梅素以劑量依賴的方式顯著下調(diào)脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/PPARγ、C/EBPα及其他脂代謝相關(guān)基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平[14]，進(jìn)而發(fā)揮抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累作用；此外，楊梅素可改善高脂飲食大鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗作用，并且通過刺激β-腎上腺素能受體（betaAR），激活cAMP 依賴性途徑，上調(diào)MAPK途徑的磷酸化誘導(dǎo)脂肪分解[32]。同樣地，He 等[33]的研究發(fā)現(xiàn)楊梅素還不同程度地調(diào)節(jié)了高脂高膽固醇血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C、TBA 和LPS 的水平，顯著減少了肝臟脂肪和附睪脂肪的沉積。木犀草素具有顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和糖尿病小鼠體重增加、脂肪沉積和脂肪細(xì)胞增大的作用[34]；其可通過調(diào)節(jié)HIF-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（GLUT-4）、PPARα、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1A（CPT-1A）和丙酮酸脫氫酶激酶-4（PDK-4）的蛋白表達(dá)水平以減少脂肪吸收[35]；并通過活化JAK/STAT3 通路的信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)瘦素分泌，改善肝臟脂質(zhì)沉積和體重增加[36]。由上可知，篩選得到的活性成分在防治肥胖方面具有一定科學(xué)依據(jù)，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的科學(xué)性和可信性。因此，辣木葉中的鼠李黃素、膽甾-5 烯-3 醇、楊梅素、木犀草素等藥效成分可能通過與PIK3R1、PIK3CA、AKT1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控HIF-1、胰島素抵抗、EGFR 和癌癥等多條信號(hào)通路發(fā)揮抗肥胖作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)辣木葉防治肥胖的潛在藥效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)辣木葉治療肥胖呈現(xiàn)多成分作用于同一靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的協(xié)同效應(yīng)。所以，辣木葉可能通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路影響機(jī)體細(xì)胞增殖分化、脂質(zhì)基因表達(dá)及炎癥、癌癥的產(chǎn)生等多維度生命進(jìn)程而協(xié)同發(fā)揮降脂作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證辣木葉改善肥胖的作用機(jī)制及辣木資源的開發(fā)利用提供新的思路和方向。