放射性核素探針在嵌合抗原受體T 細胞治療顯像中的應用

王培 王帥亮 朱華 楊志

1 貴州大學醫(yī)學院，貴陽 550025；2 北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所核醫(yī)學科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142

傳統(tǒng)的治療方法（如手術(shù)、放療和化療）在復發(fā)性和難治性腫瘤的治療中往往存在著局限性，因此，免疫治療、細胞治療等新型腫瘤治療策略正逐漸在臨床腫瘤治療中發(fā)揮巨大作用。其中，嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法是近年來發(fā)展迅速的腫瘤過繼性細胞療法，尤其是在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中卓有成效。截至目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局先后批準了6 種分別基于CD19 及B 細胞成熟抗原（BCMA）的CAR-T 療法，極大地推動了血液系統(tǒng)腫瘤治療策略的快速發(fā)展[1]。

CAR-T 通過與靶細胞形成免疫突觸來表達促凋亡配體，并釋放細胞毒性穿孔素和顆粒酶以及分泌促炎細胞因子（如干擾素α、干擾素γ 和白細胞介素2）來殺傷靶細胞。以CD19 為靶點的T 細胞療法是目前CAR-T 療法中最具代表性的形式，其通過基因工程改造自體T 細胞來表達特異性CD19 抗原受體，從而以高親和力攻擊CD19 陽性的惡性腫瘤細胞，并產(chǎn)生持久的反應[2]，尤其是在白血病和淋巴瘤的治療中療效顯著[3]。但CAR-T 療法治療實體瘤的效果不盡人意，究其原因可能與腫瘤特異性靶點的難以確定、實體瘤復雜的免疫抑制微環(huán)境以及CAR-T 向腫瘤部分的轉(zhuǎn)運有限等相關(guān)[4]。同時CAR-T 療法通常可能會伴隨著嚴重的不良反應，如靶點外毒性、腦毒性、神經(jīng)毒性及嚴重的細胞因子風暴[5]。Ma 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，可通過借助輔助診斷克服T 細胞特性和腫瘤環(huán)境所造成的障礙，即對CAR-T 體內(nèi)動態(tài)進行監(jiān)測，可更大程度地提高CAR-T 療法在實體瘤中的療效和安全性。

傳統(tǒng)的影像學方法（如CT、MRI）可通過對腫瘤大小和形態(tài)變化的檢測來提供腫瘤相關(guān)形態(tài)學信息，但無法檢測T 細胞的空間信息[7]。外周血液檢測雖可檢測循環(huán)中過繼轉(zhuǎn)移的T 細胞、免疫標志物及相關(guān)細胞因子，但也不能提供T 細胞的空間分布狀態(tài)和腫瘤特異性的擴張情況，因而難以準確量化T 細胞的腫瘤浸潤程度[8]。腫瘤組織活檢采樣通常只包含一小部分腫瘤組織，因而也不能完全反映T 細胞在整個腫瘤中的浸潤情況[7]?；诜派湫院怂氐腃AR-T 顯像，可無創(chuàng)、實時、定量評價T 細胞在體內(nèi)的分布，是提供T 細胞的空間信息、實現(xiàn)CAR-T 療法動態(tài)監(jiān)測的關(guān)鍵，對CAR-T 療法的療效預測及安全性評價具有重要的指導意義。

目前，基于放射性核素T 細胞顯像的方法主要包括3 大類：直接標記顯像、報告基因顯像和內(nèi)源性細胞顯像，筆者將對這3 種顯像方法的優(yōu)劣勢進行綜述，并展望未來的發(fā)展方向。

1 直接標記顯像

直接標記是指使用放射性核素對CAR-T 標記的技術(shù)，其標記過程簡單，對細胞的操作較少。根據(jù)小分子和納米顆粒能在體內(nèi)滯留的特性，CAR-T 可使用小分子和納米顆粒直接進行放射性標記。

1.1 基于小分子的標記

Parente-Pereira 等[9]用111In-tropolate 直接標記CAR-T 后，發(fā)現(xiàn)通過靜脈注射時，111In-tropolate-CAR-T 分布于肺部、肝臟和脾臟中，但沒有明顯的腫瘤滲透，而通過腹腔或皮下注射時，111In-tropolate-CAR-T 主要滯留在注射部位，這為CAR-T 的直接標記提供了寶貴經(jīng)驗。

8-羥基喹啉（oxine）常被用于標記和示蹤鼠源淋巴細胞[10]。Weist 等[11]將8-羥基喹啉（oxine）用于人源CAR-T 的放射性89Zr 標記，標記活度為70 kBq/百萬細胞，該研究結(jié)果顯示，89Zr-oxine-CAR-T 能在體內(nèi)遷移，并能維持細胞因子的產(chǎn)生、腫瘤細胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性。

1.2 基于納米顆粒的標記

Oh 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，金納米顆粒（gold nanoparticles，GNPs）可在細胞內(nèi)滯留并具有生物安全性。Bhatnagar 等[13]利用GNPs 的這一特性來標記示蹤CAR-T，然后通過靜脈注射到健康小鼠體內(nèi)行PET 顯像，10 min 后顯示，經(jīng)GNPs標記后的CAR-T 富集于肺部，隨后肝臟、脾臟的放射性活度逐漸增強。

上述研究均證實了直接標記CAR-T 是可行性的。然而，T 細胞對射線較為敏感，同時由于細胞分裂和死亡會導致放射性信號的稀釋，以及標記細胞的死亡會被吞噬細胞吞噬而導致信號混疊等，會對CAR-T 在體內(nèi)分布狀態(tài)的評價產(chǎn)生干擾。此外，像GNPs 這樣的納米材料作為放射性核素的載體被引入細胞中是否會對CAR-T 造成潛在的生物毒性也有待研究驗證。以上因素在一定程度上限制了直接標記CAR-T 顯像策略的廣泛應用。

2 報告基因顯像

報告基因顯像是一種非侵入式的基因顯像方法，近年來已被用于CAR-T 的監(jiān)測與定位。其原理是先將CAR-T在體外進行DNA 轉(zhuǎn)導，構(gòu)建重組DNA 使其共表達腫瘤特異性CAR 及報告抗原，然后注射與報告基因耦合的核素標記的探針進行顯像。

2.1 酶基報告基因

可用放射性核素（如124I、14C、18F 等）標記單純皰疹病毒1 型胸苷激酶（herpes simplex virus 1 thymidine kinase，HSV1-TK），該基因是目前唯一用于患者CAR-T 顯像的酶基報告基因。Yaghoubi 等[14]使用HSV1-TK 作為報告基因在1 例Ⅳ級多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者中評價CAR-T 的分布狀態(tài)，后又使用相同的報告基因成像開展臨床試驗（編號分別為NCT00730613 和NCT01082926），其中包括7 例傳統(tǒng)治療無效的復發(fā)性高級別膠質(zhì)瘤患者，發(fā)現(xiàn)了CAR-T 向腫瘤部位的遷移。Ponomarev 等[15]使用基于HSV1-TK 報告基因的成像技術(shù)來監(jiān)測依賴T 細胞受體（TCR）的活化T 細胞核因子（NFAT）介導的T 細胞活化，結(jié)果表明可以通過基于HSV1-TK 報告基因成像來實現(xiàn)對CAR-T 激活的監(jiān)測。以上研究均證實了該報告基因顯像的可行性，另外還有研究結(jié)果顯示，使用哺乳動物類的報告基因結(jié)構(gòu)可有效降低這種風險[16]。

大腸桿菌二氫葉酸還原酶（E.colidihydrofolate reductase，eDHFR）也是一種酶基報告基因，但其比HSV1-TK 的相對分子質(zhì)量?。?8 000 對46 000）。Sellmyer 等[17]使用eDHFR作為報告基因，以11C 和（或）18F-氟丙基甲氧芐啶（TMP）作為該報告系統(tǒng)的探針，應用在小鼠骨肉瘤模型中監(jiān)測靶向二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）的CAR-T，發(fā)現(xiàn)CAR-T 早期主要聚集在脾臟，晚期則主要向腫瘤內(nèi)遷移。此外，基因測序結(jié)果顯示，eDHFR 的免疫活性表位更少，且截短該酶可使其潛在的免疫原性降至最低，這在加深對CAR-T 動力學的理解和促進該報告基因顯像系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化應用方面具有重要意義[18]。

2.2 基于協(xié)同載體的報告基因

人鈉碘轉(zhuǎn)運蛋白（human sodium-iodine symporter，hNIS）屬于鈉依賴轉(zhuǎn)運蛋白家族，可用于調(diào)節(jié)碘和其他幾種陰離子的跨膜轉(zhuǎn)運[19]。大量的臨床研究結(jié)果表明，hNIS 可作為報告基因可視化評估CAR-T 的體內(nèi)分布。Emami-Shahri 等[20]使用hNIS/99TcmO4?報告基因/探針對前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）靶向CAR-T 進行成像和監(jiān)測。Volpe 等[21]則構(gòu)建了T4NT CAR-T 細胞，可以表達NIS 報告基因，同時還可靶向泛erbb 家族，該研究結(jié)果顯示，免疫檢查點程序化細胞死亡配體1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）的表達水平會影響CAR-T 在不同腫瘤中的滯留，可見CAR-T 療法在實體瘤的應用方面仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。

2.3 基于受體的報告基因

生長抑素受體（somatostatin receptors，SSTRs）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在多數(shù)器官中的表達水平相對較低。SSTR 包含5 個不同的亞型，分別為SSTR1、2、3、4、5。其中SSTR2 對天然生長抑素和合成生長抑素類似物的親和力最高，因此SSTR2 更多地被用于報告基因系統(tǒng)。Vedvyas等[22]使用SSTR2 作為報告基因，將人T 細胞共表達細胞間黏附分子1（ICAM-1）用于腫瘤靶向，建立了一種簡單的方法來評估實體瘤中浸潤的CAR-T 密度。

PSMA 是一種非免疫原性的人類蛋白，其僅在前列腺、腎臟和大腦等少數(shù)器官中表達，但內(nèi)化野生型的PSMA與配體結(jié)合后會阻止其翻譯為報告基因。因而Minn等[23]設(shè)計了一個N 端修飾的 PSMA 變體：tPSMA（N9del）（Nterminally modified PSMA variant，tPSMA），以防止PSMA內(nèi)化和增加表面表達，并使用 tPSMA（N9del）/18F-2（3-{1-羧基-5-[（6-[18F]氟-吡啶-3-羰基）-胺基]-戊基}-脲基）-戊二酸（2-（3-{1-carboxy-5-[（6-18F-fluoro-pyridine-3-carbonyl）-amino]-pentyl}-ureido）pentanedioic acid，18F-DCFPyL）對 CD19 靶向 CAR-T 監(jiān)測，結(jié)果顯示，18F-DCFPyL 能與 PSMA 有效結(jié)合，并可使體內(nèi)至少 2 000 個細胞可視化。

除了前述的SSTR2 和PSMA，另一種人源報告基因人去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白（human norepinephrine transporter，hNET）也可用于T 細胞可視化監(jiān)測。Moroz 等[24]對4 種不同的報告基因系統(tǒng)[包括HSV1-TK、hNET、hNIS 和人脫氧胞苷激酶雙突變體（hdCKDM）]檢測報告基因轉(zhuǎn)導的T 細胞的靈敏度進行了比較，結(jié)果表明hNET 報告基因系統(tǒng)是最靈敏的，因此，hNET 報告基因在T 細胞可視化成像方面極具應用潛力。

2.4 基于抗體的報告基因

Krebs 等[25]在之前的研究基礎(chǔ)上，使用單鏈抗體可變片段（ScFv）構(gòu)建了 1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）抗體報告1（antibody reporter 1，DAbR1）基因，使用DAbR1 和（或）（S）-2-（4-丙烯酰胺苯甲基）-DOTA （（S）-2-（4-acrylamidobenzyl）-DOTA，AABD）作為報告基因或探針在體內(nèi)示蹤CD19 靶向的CAR-T，分別用86Y 和177Lu 標記AABD 進行PET/CT 和SPECT/CT 顯像，顯像結(jié)果中均能觀察到CAR-T 發(fā)出明顯的放射性信號。但CAR-T 療法可能會帶來嚴重的不良反應，故此，該研究團隊用DAbR1 作為自殺基因，經(jīng)177Lu-AABD 治療后，CAR-DAbR1 T 細胞受到輻射破壞或死亡，從而控制CAR-T 療法可能帶來的嚴重不良反應[25]。

綜上，報告基因成像技術(shù)雖可在相對不受限制的時間內(nèi)對體內(nèi)CAR-T 進行無創(chuàng)可視化監(jiān)測，但無法評估CAR-T聚集于腫瘤部位的激活狀態(tài)，且一種CAR-T 報告系統(tǒng)僅能針對一種類型的疾病，CAR-T 產(chǎn)品獲批授權(quán)應用時效長。HSV1-TK、大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDFHR）和DAbR1存在的潛在免疫原性，以及SSTR2、hNIS 和PSMA 在多個正常器官中的固有表達，都有可能導致背景干擾，從而在一定程度上限制了該方法的應用。

3 內(nèi)源性細胞顯像

內(nèi)源性T 細胞顯像可以反映細胞的激活和功能狀態(tài)，是目前臨床研究應用中較為成熟的技術(shù)[26-27]，但與CAR-T相關(guān)的研究還很少。

3.1 基于細胞表面標志物的成像

細胞表面標志物（如CD4、CD8、CD3 等）以及免疫檢查點[如程序化細胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）、PD-L1 和細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）]對于特定T 細胞群的體內(nèi)顯像具有重要意義[28]。其成像原理是通過構(gòu)建特異性靶向T 細胞表面標志物的放射性核素探針，使用PET 或SPECT 顯像來追蹤靶細胞群，通過評估標志物的表達水平來反映細胞的免疫狀態(tài)。

Larimer 等[29]使用89Zr 標記的抗CD3 抗體（89Zr-DFOCD3）對抗CTLA-4 治療期間結(jié)腸癌T 細胞浸潤進行定量，發(fā)現(xiàn)CD3 浸潤表達水平與腫瘤的消退呈正相關(guān)。Rashidian等[30]開發(fā)了一種89Zr 標記的針對CD8 的聚乙二醇化單域抗體片段，可檢測黑色素瘤和胰腺癌中CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞。

癌細胞可以上調(diào)PD-L1 的表達水平，PD-L1 與T 細胞上的PD-1 相互作用，在抑制T 細胞活性中起主要作用[31]。89Zr-Dfnivolumab PET 可用來定位表達PD-1 的T 細胞，且PD-1 的攝取強度與活檢腫瘤中表達PD-1 的T 細胞數(shù)量存在相關(guān)性[32]。Higashikawa等[33]研制了一種CTLA-4 靶向PET 分子探針（64Cu-DOTA-Anti-CTLA-4 mAb）來檢測CTLA-4在CT26 荷瘤小鼠中的表達情況，發(fā)現(xiàn)CTLA-4 的高表達與T 細胞浸潤腫瘤相關(guān)。Xiao 等[34]發(fā)現(xiàn)了一種誘導型T 細胞共刺激因子（inducible T-cell costimulator，簡稱ICOS 或CD278），并依此設(shè)計了一種ICOS 靶向分子探針（89Zr-DFO-ICOS mAb），使用PET 顯像可將Lewis 肺癌模型中T細胞的激活可視化，并以此預測療效。上述研究結(jié)果均表明靶向細胞表面標志物在T 細胞顯像中的可行性與安全性。

3.2 基于新陳代謝途徑的T 細胞顯像

代謝途徑可作為靶點來區(qū)分激活和未激活的T 細胞，脫氧胞苷激酶（dCK）和脫氧鳥苷激酶（dGK）是脫氧核糖核苷酸挽救途徑中的限速酶，目前已有多種示蹤劑被開發(fā)作為其底物。18F-氯法拉濱是一種通過脫氧胞苷激酶代謝的核苷酸嘌呤類似物，在造血骨髓和次級淋巴器官中的分布較廣[35]，而另一種探針18F-脫氧阿糖鳥苷主要通過脫氧鳥苷激酶途徑在激活的T 細胞中積聚[36]。

此外，T 細胞的激活還伴隨著白介素2（interleukin-2，IL-2）的分泌及其受體的表達。D'Alessandria 等[37]將IL-2 與聯(lián)肼尼克酰胺相連，使用99Tcm標記后用于活化T 細胞顯像，用于檢測慢性炎癥反應和自身免疫性疾病。Hartimath 等[38]則用N-4-18F-氟代苯甲酰基標記IL-2（18F-FB-IL-2），用于監(jiān)測因治療引起的T 細胞激活狀態(tài)，結(jié)果顯示，在聯(lián)合治療和免疫治療的腫瘤組織中，T 細胞浸潤水平遠高于僅接受放療的腫瘤組織。

綜上所述，內(nèi)源性細胞顯像可直接評估免疫治療過程中體內(nèi)特定細胞群（如細胞毒性T 淋巴細胞）的存在、定位、數(shù)量、激活和功能狀態(tài)，并提供有關(guān)CAR-T 在治療中作用的關(guān)鍵信息，對于CAR-T 療法療效的早期預測及改進具有重要的指導意義。

4 小結(jié)與展望

直接標記顯像、報告基因顯像和內(nèi)源性細胞顯像3 種方式均可通過PET 或SPECT 信號檢測和定量觀察CAR-T的移行、分布、存活等，且有助于確定正常組織中是否存在非特異性攝取，這對于評價脫靶毒性是關(guān)鍵的。直接標記在操作上最為簡便，不足之處在于CAR-T 對射線較為靈敏，即使用放射性核素直接標記CAR-T，也可能會引起CAR-T 的死亡而致底物輻射泄露進而對其體內(nèi)示蹤產(chǎn)生干擾，雖可用納米材料作為替代載體，但其潛在的毒性仍未可知。報告基因顯像的不足之處在于潛在的安全性，如重組報告基因的慢病毒，感染CAR-T 時的隨機插入等，且正常組織還可能存有報告基因的固有表達。內(nèi)源細胞顯像可以更有效地對T 細胞的激活和功能狀態(tài)進行監(jiān)測，可通過監(jiān)測細胞的擴張或收縮來判斷腫瘤負荷，從而間接反映無效的增殖（T 細胞繼續(xù)增殖，但腫瘤沒有得到控制）或有效的殺傷（T 細胞擴張后腫瘤縮?。?，有望解決和優(yōu)化CAR-T療法在實體瘤中所面臨的挑戰(zhàn)。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明王培負責文獻的查閱、綜述的撰寫；王帥亮負責觀點的提出與綜述的修訂；朱華負責命題思路的指導；楊志負責綜述的審閱