花生根白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及分離提純

宋青云，李玟君，龐子皓，肖一郎，汪海燕，李玉蝶，劉 運(yùn)，汪 超，李 瑋,

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068；2.湖北妍琪生物科技有限公司，湖北襄陽(yáng) 441000）

白藜蘆醇，3,4',5-三羥基-1,2-二苯基乙烯，又名芪三酚，是某些植物在受外界刺激時(shí)產(chǎn)生的一種抗毒素，在消炎、抗氧化、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、降血脂和預(yù)防心血管疾病等方面有比較顯著的作用[1-2]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)白藜蘆醇的研究多集中以中藥虎杖為提取原料，但虎杖為中藥寶貴資源，提取成本較高。有研究表明花生根內(nèi)含有豐富的白藜蘆醇[3-5]，但是作為花生采收后的副產(chǎn)物之一，花生根除少量作為燃料使用外，其余大部分被隨意丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6-7]。

目前從花生根中提取白藜蘆醇的方法主要有有機(jī)溶劑提取法、酶法和超臨界CO2萃取等[8-10]。對(duì)白藜蘆醇粗提物的純化主要采用大孔樹脂法、高速逆流色譜法和雙水相萃取純化等[11-13]。上述提取純化的方法適于開展大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的很少[14-17]，對(duì)花生根白藜蘆醇提取工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化方面的參考價(jià)值較低。對(duì)花生根的綜合利用研究應(yīng)當(dāng)以利于工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化為目標(biāo)。因此，有必要建立一套完整且適于工業(yè)化生產(chǎn)花生根白藜蘆醇的方法。而超聲輔助溶劑提取則具有耗時(shí)短、效率高及適應(yīng)性廣等方面的優(yōu)勢(shì)[18-19]。大孔樹脂純化具有吸附、解吸較快、選擇性高、吸附容量大和便于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)[20-21]。本研究擬采用超聲波輔助提取聯(lián)合大孔樹脂初步純化花生根白藜蘆醇，以期為花生根的合理開發(fā)、綜合利用和天然白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)化及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生根粉 中花16，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈 色譜級(jí)，Thermo Fisher；乙醇分析純，國(guó)藥集團(tuán)；大孔樹脂H103 安徽三星樹脂科技有限公司；層析柱 1.5×40 cm，上海滬西分析儀器廠有限公司。

Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；ZLGZ-12 冷凍干燥機(jī) 鄭州科旺達(dá)生物儀器有限公司；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SPH-200B 恒溫?fù)u床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HL-1 恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇的提取方法 參考安寶樹[22]的方法，花生根打粉后過40 目篩，用乙醇提取，提取方式為超聲波輔助提取。參考黃紀(jì)念等[23]的方法，固定提取溫度為50 ℃，選取花生根粉與乙醇的不同配比即料液比（g:mL）、乙醇濃度（%）、超聲波功率（W）及超聲時(shí)間（min）四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，以白藜蘆醇的含量為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 乙醇濃度：保持料液比、超聲時(shí)間以及超聲功率分別為1:30 g:mL、9 min 和300 W，乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%和100%?？疾觳煌掖紳舛葘?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的作用。

超聲時(shí)間：保持乙醇濃度、料液比以及超聲功率分別為90%、1:30 g:mL 和300 W，超聲作用時(shí)間分別設(shè)置為3、6、9、12 和15 min?？疾觳煌晻r(shí)間對(duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

超聲功率：保持乙醇濃度、料液比以及超聲時(shí)間分別為90%、1:30 g:mL 和9 min，超聲功率分別設(shè)置為150、200、250、300 和350 W?？疾觳煌暪β蕦?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

料液比：保持乙醇濃度、超聲時(shí)間以及超聲功率分別為90%、9 min 和300 W，料液比分別為1:10、1:20、1:30、1:40 和1:50 g:mL?？疾觳煌弦罕葘?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

依據(jù)式（1）計(jì)算白藜蘆醇含量（μg/g）。

式中：c 為白藜蘆醇質(zhì)量濃度，μg/mL；v 為待測(cè)溶液總體積，mL；m 為花生根粉質(zhì)量，g。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考，選取乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）以及料液比（D）作為影響因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案。以白藜蘆醇含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，確定白藜蘆醇的最佳提取工藝，同時(shí)對(duì)模型建議的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[24]。以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考選取合適的因素以及水平并進(jìn)行編碼，使用響應(yīng)面模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的分離純化 參考吳佳等[25]和駱航等[26]的方法采用H103 大孔樹脂對(duì)花生根白藜蘆醇進(jìn)行初步純化。

1.2.4.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 稱取0.5 g 樹脂，加入提取濃縮后質(zhì)量濃度為247.49 μg/mL 的粗提液原液25 mL，通過恒溫?fù)u床在25 ℃、150 r/min 環(huán)境下振蕩，每隔20 min 測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.2.4.2 靜態(tài)吸附等溫曲線 稱取五份樹脂，每份0.5 g，分別加入25 mL 含有60%、70%、80%、90%和100%提取原液的白藜蘆醇粗提液，通過恒溫?fù)u床在25 ℃、150 r/min 環(huán)境下振蕩，60 min 后分別測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.2.4.3 上樣流速與上樣體積 稱取10 g 樹脂，濕法裝柱[18,27]，將質(zhì)量濃度為70%提取原液的白藜蘆醇粗提液400 mL，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速下收集流出液（10 mL/管），當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為流出液質(zhì)量濃度的10 倍時(shí)確定上樣體積。

1.2.4.4 洗脫流速與洗脫體積 稱取10 g 樹脂，濕法裝柱，使其吸附飽和，以純化水清洗樹脂至流出液中檢測(cè)不到白藜蘆醇，分別在0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min 的流速下洗脫，以90%乙醇為洗脫劑，收集各流速條件下的洗脫液（10 mL/管），測(cè)定白藜蘆醇的含量。

1.2.5 白藜蘆醇含量的測(cè)定 色譜條件：高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定提取液中白藜蘆醇含量[28]。色譜條件參考程杏安等[6]和葉夢(mèng)娜等[29]的方法并略作修改：Symmetry C18色譜柱（150×3.9 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈/水（24.5/75.5，v/v）；等度洗脫；DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm；流速0.45 mL/min；柱溫箱26 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。

標(biāo)曲的制作：以吸收峰面積為縱坐標(biāo)（y），白藜蘆醇含量為橫坐標(biāo)（x），建立回歸方程。對(duì)待測(cè)樣品過0.22 μm 有機(jī)濾膜后按色譜條件進(jìn)樣，平行測(cè)定三次，峰面積取平均值，并通過線性回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品中白藜蘆醇含量。通過計(jì)算得線性回歸方程為y=43.06x+2.0378，R2=0.9997，表明白藜蘆醇在3.92～39.2 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.6 樣品純度的測(cè)定 依照1.2.4 實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。收集洗脫液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空冷凍干燥得純化產(chǎn)物，準(zhǔn)確稱重后用甲醇溶解，測(cè)定白藜蘆醇的含量，依據(jù)式（2）計(jì)算純度P。

式中：c 為白藜蘆醇質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為待測(cè)溶液總體積，mL；W 為白藜蘆醇干粉質(zhì)量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 25 軟件對(duì)單因素進(jìn)行P＜0.05 水平顯著性分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。運(yùn)用Design-Expert 13 軟件中的Box-Behnken 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，采用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1a 所示，乙醇濃度的增加的同時(shí)，白藜蘆醇的含量先增加后減少，90%乙醇時(shí)，含量達(dá)到最高170.35±1.72 μg/g，與其他水平具有顯著性差異（P＜0.05），而后開始下降。這可能是由于乙醇濃度的增加，醇溶性雜質(zhì)及親脂性物質(zhì)溶出，與白藜蘆醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合溶劑，導(dǎo)致白藜蘆醇含量下降[30-31]。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響 由圖1b 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，白藜蘆醇含量迅速增加，12 min 后達(dá)到頂峰168.86±0.74 μg/g，與其他水平具有顯著性差異（P＜0.05），而后開始下降，這可能是由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的破碎，促進(jìn)白藜蘆醇的溶出，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，體系溫度升高，而白藜蘆醇在光、熱條件下穩(wěn)定性較弱，且時(shí)間越長(zhǎng)，白藜蘆醇部分被氧化，從而導(dǎo)致含量下降。

2.1.3 超聲功率對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1c 所示，超聲功率的增加的同時(shí)，白藜蘆醇含量上升，功率為300 W 時(shí)，含量達(dá)到最高163.64±0.49 μg/g，與其他水平具有顯著性差異（P＜0.05），之后開始下降，這可能是由于隨著功率的增加，超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)加強(qiáng)，促進(jìn)白藜蘆醇的溶出，繼續(xù)增加超聲功率，白藜蘆醇受到破壞而含量下降。

2.1.4 料液比對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1d 所示，料液比中提取溶劑增加的同時(shí)，白藜蘆醇含量先增加后趨于穩(wěn)定，到1:40 g:mL 時(shí)達(dá)到最高，達(dá)到159.98±0.63 μg/g，除與1:50 g:mL 水平無(wú)顯著差異外（P＞0.05）和其他水平均具有顯著性差異（P＜0.05），這可能是由于料液比在1:40 g:mL 之前，溶劑的增加促進(jìn)白藜蘆醇的擴(kuò)散溶出，料液比到達(dá)1:40 g:mL 后，這種溶劑促溶達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，使得白藜蘆醇的提取量趨于穩(wěn)定結(jié)果

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Response surface experiment scheme and results

利用軟件Design Expert 13 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立白藜蘆醇含量（R）與乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、液料比（D）之間的二次回歸模型。得到回歸方程如下：

2.2.2 模型方差分析 由表3 方差分析可得，模型失擬項(xiàng)不顯著（P=0.3005＞0.05），而模型P＜0.01，表明模型方程高度顯著，由此得模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較相符，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)1.82%，說明模型的置信度高，決定系數(shù)R2=0.8843，表明模型方程能夠較好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)情況。該模型方程可以用來(lái)預(yù)測(cè)不同提取工藝下花生根白藜蘆醇的含量。通過分析表3 的P值可得乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲功率、乙醇濃度二次項(xiàng)、超聲功率二次項(xiàng)、超聲時(shí)間二次項(xiàng)和料液比二次項(xiàng)對(duì)含量的影響顯著，即實(shí)驗(yàn)的影響因素對(duì)響應(yīng)值并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而交互項(xiàng)以及二次項(xiàng)也存在顯著影響。超聲時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取含量的影響達(dá)到顯著性水平，影響次序?yàn)槌暪β剩–）＞乙醇濃度（A）＞超聲時(shí)間（B）。

表3 模型的ANOVA 分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis results of the model

2.2.3 響應(yīng)面分析 因素與因素間交互作用的曲面圖和等高線圖如圖2a～圖2f 所示。曲面面的傾斜程度反映出實(shí)驗(yàn)值隨實(shí)驗(yàn)條件變化而變化，曲面斜率越大, 實(shí)驗(yàn)條件的變化對(duì)白藜蘆醇提取量影響程度越大，反之，越平緩影響則越小。等高線圖呈圓形說明因素與因素的相互作用影響非顯著，呈橢圓說明因素與因素的相互作用影響顯著，且中心位置向邊緣延伸，白藜蘆醇含量逐漸減少[32-34]。分析圖2 并結(jié)合ANOVA表可知，各因素兩兩之間均存在交互作用，其中乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲功率之間的交互作用顯著（P＜0.05）。

圖2 各因素之間的交互作用對(duì)白藜蘆醇含量的響應(yīng)曲面及等高線Fig.2 Response surface and contour line of interaction among various factors to resveratrol content

2.2.4 最佳工藝驗(yàn)證 通過軟件優(yōu)化分析得出最佳提取工藝條件為超聲功率288.078 W，超聲時(shí)間11.472 min，料液比1:38.183 g:mL，乙醇濃度為91.695%，含量為177.574 μg/g?？紤]到實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)際操作，簡(jiǎn)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件為超聲功率290 W、超聲時(shí)間12 min、料液比1:38 g:mL 和乙醇濃度90%含量為175.53±1.57 μg/g，與預(yù)測(cè)值相近，模型可靠。提取結(jié)果高于陳瓊玲[35]的溶劑提取和王巖等[36]的蒸汽爆破提取。

通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)提取條件為超聲功率290 W，超聲時(shí)間12 min，料液比1:38 g:mL，乙醇濃度為90%，工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的分離純化

2.3.1 大孔樹脂吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 從圖3a 得，在前20 min內(nèi)，曲線斜率較大，說明H103 樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸收較快，之后吸收速率變緩，到60 min 以后，吸收量趨于穩(wěn)定，說明樹脂已基本吸附飽和。所以選擇60 min 為上樣液的靜態(tài)吸附時(shí)間。

圖3 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸附與解析效果Fig.3 Adsorption and resolution of resveratrol by macroporous resin

2.3.1.2 靜態(tài)吸附等溫曲線 從圖3b 得，隨著洗脫液乙醇濃度的增加，白藜蘆醇解吸率先增加后逐漸降低，乙醇濃度為70%時(shí)，解吸率最高。原因可能是當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)不能破壞白藜蘆醇與樹脂之間的氫鍵，從而白藜蘆醇較難被洗脫；而當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，高濃度乙醇和白藜蘆醇極性相差較大，故解吸率下降。所以選擇70%乙醇作為解吸液。

2.3.1.3 上樣流速與上樣體積 從圖3c 得，上樣流速為0.5 和1.0 mL/min 時(shí)，兩者吸附率高且相近，綜合吸附率和吸附時(shí)間，選擇1.0 mL/min 的流速上樣。從圖3d 得，當(dāng)流出液體積達(dá)到120 mL 時(shí)，流出液中白藜蘆醇濃度達(dá)到19.26 μg/mL，此時(shí)已接近上樣濃度的1/10 即達(dá)到泄漏點(diǎn)[25,37]。

2.3.1.4 洗脫流速與洗脫體積 從圖3e 得，在0.25和0.5 mL/min 流速洗脫下，兩者解吸率高且相近，綜合解吸率和解吸時(shí)間，洗脫流速選擇0.5 mL/min。從圖3f 得，160 mL 時(shí)，洗脫液中白藜蘆醇的量只有21.34 μg/mL，隨著洗脫液體積的增加含量無(wú)明顯變化，選擇上樣量為160 mL。

綜上白藜蘆醇的純化工藝為：樹脂H103，上樣的質(zhì)量濃度為70%原液質(zhì)量濃度即201.13 μg/mL，上樣速率為1.0 mL/min，上樣量為120 mL，洗脫溶劑為90%乙醇，洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫量為160 mL。

2.4 大孔樹脂初純物純度的測(cè)定

由表4 得，純化后白藜蘆醇初純物純度達(dá)到49.19%±0.81%，與駱航等[26]的純化結(jié)果34.77%和武鵬程[38]的純化結(jié)果39.61%相比均有所提高，且RSD 值1.65%，表明工藝的純化效果和重現(xiàn)性良好。

表4 樣品純度的測(cè)定Table 4 Determination of sample purity

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化確定最佳提取條件：乙醇濃度90%、超聲功率290W、超聲時(shí)間12 min、料液比1:38 g:mL，白藜蘆醇的含量為175.53±1.57μg/g。優(yōu)化后，經(jīng)H103 樹脂一次處理，粗產(chǎn)品中白藜蘆醇的純度為49.19%±0.81%，RSD為1.65%。超聲輔助提取白藜蘆醇和大孔樹脂初步純化白藜蘆醇是可行的，可為花生根的合理開發(fā)和綜合利用以及天然白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

從實(shí)驗(yàn)室走向工廠，需要經(jīng)歷小試、中試等諸多環(huán)節(jié)。這對(duì)于工藝條件的穩(wěn)定性要求更加嚴(yán)格，諸如提取時(shí)的溶劑揮發(fā)引起的料液比變化、純化用的柱材料和上樣的溫度等因素可能因?yàn)橐?guī)模的放大而成為重要影響因素，這在后續(xù)的研究中有必要進(jìn)行考查。日常生活中，不同的應(yīng)用場(chǎng)景對(duì)于白藜蘆醇純度的要求不同，后續(xù)可考慮對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行分級(jí)純化，以得到滿足不同需求的白藜蘆醇產(chǎn)品。