表面改性磁性納米材料對吡咯喹啉醌的萃取性能研究

馬 科，程源航

（鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450008）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學名4,5-二羰基-1-吡咯-2,3-f-喹啉-2,7,9-三羧酸，可以參與氧化還原反應，還可參與脫氫、氧化、脫羧等。PQQ 可作為多種酶的輔因子，是繼核黃素和煙酰胺之后第三類輔酶[1-2]。其廣泛存在于自然界多種生命體，包括細菌、真菌、植物、動物等[3-6]。PQQ 對人體也具有多種生理功能，包括神經(jīng)保護、促進生長發(fā)育、抑制氧化應激等[7-10]。2022 年被衛(wèi)生健康委食品安全標準與監(jiān)測評估司認定為“三新食品”，在醫(yī)藥、食品、健康等領域具有巨大開發(fā)潛力[11]。

目前從發(fā)酵液中分離純化PQQ 的方法有陰離子交換樹脂法、高效液相色譜法、絡合萃取法、超分子溶劑萃取法等[12-16]。但以上方法均不適用于工廠大規(guī)模生產(chǎn)，故為了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)PQQ，必須解決分離純化技術難題。

固相萃取技術在醫(yī)藥、化工、生物等多領域得到廣泛應用，是目前天然產(chǎn)物分離純化的熱門技術[17-19]。而磁性固相萃取是基于固相萃取技術，使用磁性或可磁化材料為吸附劑的新型萃取技術[20-21]。磁性吸附劑不直接填充吸附柱，而是添加到溶液或懸浮液中，吸附分離目標物。然后，使用外部磁場將磁吸附劑從溶液中分離出來。再使用適當?shù)娜軇┫疵撃繕宋铮⑹褂猛獠看艌鰧⑾疵摵蟮奈絼南疵撘褐蟹蛛x，實現(xiàn)目標物的分離[22]。

目前，磁性納米材料用于PQQ 的固相萃取主要存在吸附性能差的問題。本文為突破PQQ 分離純化難題，促進PQQ 新食品資源開發(fā)，擬通過研究不同表面改性的磁性納米材料對PQQ 的吸附性能的影響，探索吸附性能與磁性納米材料表面吸附位點不同官能團與PQQ 的分子相互作用力之間的內(nèi)在規(guī)律，以期為解決PQQ 固相萃取磁性納米材料吸附性能差的問題提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、無水甲醇、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、葡萄糖、酵母粉、硫酸銨磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；三氟乙酸、四氧化三鐵納米顆粒

分析級，百靈威科技有限公司；PQQ 標準品 色譜級，百靈威科技有限公司。

DF-101S 水浴鍋 鞏義于華儀器公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器公司；超聲恒溫水浴SCQ-HD300A 上海聲彥超聲波儀器有限公司；磁力攪拌器 力辰科技有限公司；安捷倫1260 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性納米材料的制備 為了開發(fā)高效吸附PQQ 的磁性納米材料，本文根據(jù)材料表面吸附位點活性基團與目標物PQQ 分子間作用力大小不同，設計了以下三種表面改性方法，以期探索吸附性能與磁性納米材料表面吸附位點不同官能團對PQQ 的分子相互作用力之間的關系。

1.2.1.1 材料1 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報道，但稍作修改[23]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過超聲，均勻分散到150 mL 無水乙醇中，加入1 mL超純水，劇烈攪拌，加入300 μL 的四甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.1.2 材料2 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報道，但稍作修改[24]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過超聲，均勻分散到150 mL 無水乙醇中，加入1 mL 超純水，劇烈攪拌，加入500 μL 的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.1.3 材料3 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報道，但稍作修改[25]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過超聲，均勻分散到150 mL 無水乙醇中，加入1 mL 的超純水，劇烈攪拌，加入2 mL 的十六烷基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。取上述材料1 g 通過超聲分散到20 mL 的10%十六烷基三甲基溴化銨溶液中，劇烈攪拌，30 ℃下，反應2 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.2 磁性納米材料對PQQ 的萃取性能研究 三種磁性納米材料對PQQ 的吸附性能的對比：參考現(xiàn)有報道，但是具體條件有所改變[26]。本實驗所需的PQQ 濃度為10～1200 mg·L-1，吸附實驗均在pH6.5，磁性納米材料添加量為10 g·L-1，混合時保證吸附劑均勻分散于溶液中，30 ℃下以轉(zhuǎn)速200 r/min 震蕩15 min，吸附完成后用磁鐵將吸附劑與溶液分離，通過HPLC 測定剩余溶液中PQQ 的含量。

吸附量（Q，mg·g-1）通過以下公式（1）計算。

式中：C0（mg·L-1）和Ce（mg·L-1）分別是溶液中PQQ 的初始濃度和吸附后剩余濃度；V（mL）是PQQ 溶液的體積；m（mg）是磁性納米材料的質(zhì)量。

1.2.3 吸附動力學研究

1.2.3.1 吸附動力曲線 利用上述磁性納米材料對PQQ 的吸附量的方法，在條件不變的情況下，在0、4、6、10、15、20、30、40、50、60 min 時間點各取三個樣，測定吸附量和吸附率，并繪制吸附動力曲線。

1.2.3.2 吸附動力學模型的測定 通過選用文獻報道的相關模型，包括準一級動力學模型（公式（2）），準二級動力學模型（公式（3）），和粒子內(nèi)擴散模型（公式（4））研究PQQ 的吸附機理[27]。

式中：t（min）是吸附時間；qe和qt（mg·g-1）分別是平衡時間和時間t 時的吸附量；k1（min-1）和k2（g·mg-1·min-1）分別是偽一級動力學、偽二級動力學吸附速率常數(shù)；kd（g·mg-1·min-0.5）是內(nèi)擴散速率常數(shù)；C（mg·g-1）表示邊界層厚度。

1.2.3.3 吸附等溫線研究 吸附等溫線研究：通過Langmuir（公式（5）），F(xiàn)reundich（公式（6））和Tempkin（公式（7））分析實驗數(shù)據(jù)[28]。

式中：ce是平衡時的吸附濃度（mg·L-1）；qe是平衡時的吸附容量（mg·g-1）；qmax是最大吸附容量（mg·g-1）；KL和KF是Langmuir 和Freundlich 模型的吸附速率常數(shù)；KT和f（L·mg-1）是Tempkin 常數(shù)和Tempkin 結合常數(shù)，分別反應吸附熱和最大結合能。

1.2.4 解吸附研究 利用上述磁性納米材料對PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在條件不變的情況下，用以NaOH 溶液、甲酸、乙酸、氨水等為解吸劑進行解吸研究，在5、60、120 min 時間點各取三個樣，測定解吸量和解析率。

利用磁性納米材料對PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在條件不變的情況下，選擇上述步驟中解吸附最優(yōu)的為解吸附劑進行解吸研究，在5、30、60、120、180 min 時間點各取三個樣，測定解吸量和解析率。

1.2.5 HPLC 法檢測PQQ 檢測方法參考現(xiàn)有報道采用HPLC 法，但是具體條件有所改變[29]。對PQQ 進行全波長掃描，顯示其在249 和330 nm 處有兩個吸收峰，但在249 nm 處有最大吸收。以甲醇（A）-水（B）、千分之一三氟乙酸為流動相，利用反向C18色譜柱，測試吸收峰面積。按照所述色譜條件測定，峰面積（Y）與PQQ 濃度（X）的回歸方程為Y=4629.59X-242.06，線性范圍為0.5～5 μg/μL，決定系數(shù)R2為0.99936，PQQ 濃度與峰面積線性關系良好，以下關于PQQ 濃度檢測均使用該標準曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次試驗中PQQ 含量檢測數(shù)據(jù)均重復6 次，結果表示均以實驗數(shù)據(jù)的平均值±標準偏差的形式呈現(xiàn)。采用Minitab 進行數(shù)據(jù)處理；采用Origin 2021進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 三種磁性納米材料對PQQ 的吸附性能比較

為了選擇對PQQ 吸附能力最強的改性磁性納米材料，研究了三種表明改性磁性納米材料對PQQ 的吸附能力。結果如圖1 所示，經(jīng)過四甲基硅烷表面修飾的材料1 對PQQ 吸附量最小，氨基硅烷化表面修飾的材料2 次之，而離子對硅烷化表明修飾的材料3 吸附作用最強，可達140.32 mg·g-1。后續(xù)實驗選擇烷基化磁性納米材料作為吸附材料?，F(xiàn)有研究表明，不同改性試劑改性后，材料表面活性吸附基團不同，活性基團對目標物的作用力越強，改性材料對目標物的吸附能力越強[30]。材料1 表面活性基團為甲氧基，其與PQQ 芳環(huán)氫之間的分子間相互作用力僅有較弱的范德華力，材料2 表面活性基團3-氨基丙基與PQQ 羧基之間有以甲氧基為供電子體的氫鍵作用力，以及活性基團甲氧基與PQQ 芳環(huán)氫之間的范德華力，材料3 表面活性基團為十六烷基、甲氧基、銨根離子，其與PQQ 分子間相互作用力有比較強的銨根離子與PQQ 羧基形成的離子鍵作用力，以及甲氧基為供電子體的氫鍵作用力和范德華力[31-32]。因此，可能由于材料3 表面吸附位點對PQQ 分子間相互作用力最強，材料2 次之，材料1 最弱，從而導致材料3 吸附量最大，材料1 吸附量最小。表面改性磁性納米材料對PQQ 吸附能力與表面活性基團對吸附目標物的分子間相互作用力可能呈正相關。

圖1 不同表面改性磁性納米材料對PQQ 吸附的影響Fig.1 Effects of different magnetic nanomaterials on PQQ adsorption

2.2 材料3 對PQQ 吸附動力學研究

通過研究三種改性的磁性納米材料對PQQ 吸附量，發(fā)現(xiàn)離子對烷基化表面修飾的材料3 吸附能力最大，因此進一步對其吸附PQQ 的吸附動力學進行了研究。

2.2.1 吸附動力曲線 對不同吸附時間材料3 對PQQ 的吸附量進行了檢測，并繪制吸附動力曲線。結果如圖2 所示，從該吸附動力學曲線可以發(fā)現(xiàn)，PQQ 在20 min 前吸附速率非?？?，這是由于初始PQQ 濃度較高和磁性納米材料表面空白吸附位點較多，隨著表面吸附位點的減少，20～35 min 吸附速率減慢，直至50～60 min 達到平衡狀態(tài)。PQQ 平衡時的最大吸附量為160.81 mg·g-1。因此后續(xù)選擇吸附時間為50 min。

圖2 吸附時間對材料3 吸附PQQ 的影響Fig.2 Effect of adsorption time on PQQ adsorption by material-3

2.2.2 吸附動力學模型 圖3 顯示了三種動力學模型模擬的結果，表1 顯示了三種動力學模型的動力學參數(shù)。其中擬一級動力學模型的決定系數(shù)在0.9976～0.9982 范圍內(nèi)，擬二級動力學模型的相關系數(shù)為0.9803～0.9927，同時，擬一級模型計算的qe與實驗吸附容量大致相符。這表明與擬二級動力學模型相比，擬一級動力學模型比較適合用于模擬該磁性納米材料PQQ 吸附。圖3C 顯示三種濃度下的雙線性，表明該納米材料對PQQ 的吸附不止一個吸附過程，第一個吸附過程發(fā)生在0～30 min，屬于快速吸附過程，納米材料表面的吸附位點對PQQ 進行吸附，因為初始時表面活性位點較多，吸附速率快，隨著吸附位點的減少吸附進入第二個階段，PQQ 分子在納米材料內(nèi)部進行擴散，圖中三條曲線都沒有經(jīng)過原點，表明粒子的內(nèi)擴散不是唯一速率確定方式。

表1 吸附動力學各項參數(shù)Table 1 Various parameters of adsorption kinetics

圖3 磁性納米材料對PQQ 的吸附動力學模型Fig.3 Adsorption kinetic model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.2.3 吸附等溫線 采用三種模型對磁性納米材料吸附PQQ 過程中等溫曲線進行描述，得到如圖4 所示數(shù)據(jù)，表2 為三種模型的參數(shù)總結。Lgangmuir 模型的R2=0.9989 遠高于另外兩種的擬合程度，因此磁性納米材料對PQQ 的吸附更適合于Lgangmuir模型，表明PQQ 在磁性納米材上的吸附適用于單層吸附，在吸附劑表面的吸附結合位點是均一的。

表2 吸附等溫各項參數(shù)Table 2 Parameters of adsorption isotherm

圖4 磁性納米材料對PQQ 的等溫線模型Fig.4 Isotherm model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.3 解吸附研究

解吸附是將目標物從萃取材料上解吸釋放的過程，是固相萃取的重要環(huán)節(jié)，解吸附率是考察萃取過程的重要指標。本文為了開發(fā)對PQQ 具有高效分離純化性能的磁性納米材料，除了吸附能力外，還考察了磁性納米材料的解吸附性能。

2.3.1 解吸附溶劑 解吸附溶劑通過與吸附材料表面活性基團相互作用，從吸附材料替換目標物而使其解吸附。解吸附劑的性能主要通過解吸附率評價。研究結果如圖5A 所示，氫氧化鈉作為解吸附溶劑，解吸附率可達85.03%，效果最好，氨水次之，甲醇和乙酸基本沒有解吸附作用。其原因推測為解吸附機制為離子交換解吸附，氫氧根離子交換PQQ 陰離子，而使其從材料表面解吸附出來。氨水堿性弱，無法完全交換。因此，隨著氫氧化鈉濃度的增加，離子交換越完全，解吸附效果持續(xù)升高，用質(zhì)量濃度0.05%的氫氧化鈉為解吸附溶劑，解吸附率可達85.13%，解吸附率與0.08%的氫氧化鈉作為解吸附劑相比差異不明顯。以上結果說明，使用濃度0.05%氫氧化鈉作為解吸附劑效果最好。

圖5 不同溶劑對磁性納米材料解吸附的影響Fig.5 Effect of different solvents on desorption of magnetic nanomaterials

2.3.2 解吸附劑體積 為了考察解吸附劑體積對解吸附率的影響，研究了不同氫氧化鈉溶液體積（圖6）。隨著氫氧化鈉體積的增加，解吸附率逐漸增加，后趨于穩(wěn)定。當氫氧化鈉體積為8 mL 時，解吸附率最大為90.5%。氫氧化鈉體積為4 mL 時，解析率已達到87%，故選擇4 mL 為最適解吸附劑體積。

圖6 氫氧化鈉體積對解吸附的影響Fig.6 Effect of sodium hydroxide volume on desorption

2.3.3 解吸附時間 對不同時間PQQ 的解吸附（圖7）研究結果表明，在0.1～1 h 期間，隨著時間的增加，解吸附速率最快，此時結合到磁性納米材料表面的PQQ 較多，容易解吸附，3 h 時解吸附率最大為87.0%，后隨著時間的增加，解吸附增加較為緩慢，因為大多數(shù)PQQ 已經(jīng)被洗脫，考慮到盡可能取最適解吸附率，因此選擇3 h 為最適解吸附時間。

圖7 解吸附時間對納米材料解吸附的影響Fig.7 Effect of desorption time on desorption of nanomaterials

2.4 萃取材料的吸附重復性研究

萃取材料的重復使用性，是考察萃取材料實際應用的重要性能。本文對該材料的重復使用性進行了研究。結果如圖8 所示，材料循環(huán)使用5 次，吸附量由初次使用時的160.81 mg·g-1（見2.2.1）下降到145.96 mg·g-1，僅僅下降9.23%，表明該材料具有較好的重復使用性。

圖8 萃取材料的吸附重復性研究Fig.8 Adsorption repeatability of extraction materials

3 結論

本文制備了3 種表面改性磁性納米材料，并研究了這3 種材料對吡咯喹啉醌的萃取吸附性能，發(fā)現(xiàn)材料3 表面活性基團銨根離子與PQQ 羧基形成的離子鍵作用力，以及甲氧基為供電子體的氫鍵作用力和范德華力，對PQQ 的分子相互作用力最強，吸附量最大。其最適解吸附劑為0.05%氫氧化鈉，解吸附3 h，最大解析率達87.00%。材料用于吸附、解吸附的重復使用性較好，連續(xù)使用5 次以上吸附量僅下降9.23%?？傊?，本文探索了表面改性對磁性納米材料PQQ 吸附性能的影響規(guī)律，為PQQ 固相萃取材料開發(fā)具有一定的理論指導意義。但是，本文吸附與解吸附是在PQQ 純品溶液中進行，為了驗證該材料能否大規(guī)模用于PQQ 的分離純化工藝，下一步需要研究利用該材料從發(fā)酵液中萃取分離PQQ 的性能，以期開發(fā)高效分離純化PQQ 的磁性固相萃取技術。