1 株光合細(xì)菌的分離鑒定、培養(yǎng)基優(yōu)化及脫氮特性研究

靳 鵬，和子涵，武婧玉，賈一然，張曉彤，張建新

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)[1]。改革開(kāi)放以來(lái)，中國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，養(yǎng)殖產(chǎn)量已連續(xù)30 a 位列世界第一[2]。為了提高產(chǎn)量，水產(chǎn)動(dòng)物大多采用高密度的養(yǎng)殖模式[3]，而這也導(dǎo)致水環(huán)境污染方面的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重[4-5]。水環(huán)境中的氨氮（NH3-N）隨餌料進(jìn)入水生生物體后，會(huì)影響生物體內(nèi)的酶水解作用及膜的穩(wěn)定性，引起水生生物呼吸不暢、抗病能力下降等諸多問(wèn)題[6]；亞硝酸氮（）也會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一定的毒性及致癌作用，影響水生生物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，如何能富有成效地調(diào)節(jié)水質(zhì)環(huán)境是一個(gè)十分嚴(yán)峻的問(wèn)題[7]。在調(diào)節(jié)水質(zhì)方面，微生物處理法因其操作簡(jiǎn)單、維護(hù)成本低和污染物去除效率高而受到廣泛關(guān)注[8-10]。

光合細(xì)菌（PSB）作為常見(jiàn)的水質(zhì)改良劑[11]，其分布非常廣泛，一般在江海、湖泊、沼澤地、水塘和泥土中都有生長(zhǎng)[12-13]，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留等特點(diǎn)[14]。光合細(xì)菌不僅可以有效降低水體中NH3-N、等有害物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)水質(zhì)環(huán)境[15-16]，在生物環(huán)境修復(fù)、生物能源生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[17]。此外，光合細(xì)菌本身又是一種富含大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、價(jià)值較高的微生物，可被用作養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的食物[13]。光合細(xì)菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理，有利于提升水質(zhì)改良效果[18-19]、魚(yú)的免疫力和存活率、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益，在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的廢物清除中發(fā)揮著重要作用[20]。

目前，市場(chǎng)上售賣(mài)的光合細(xì)菌良莠不齊，菌液濃度不高，影響了光合細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的使用，主要原因是菌種純度不高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。鑒于此，有必要對(duì)光合細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，提升光合細(xì)菌菌液濃度，促進(jìn)光合細(xì)菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水環(huán)境的改良和養(yǎng)殖魚(yú)體的健康生長(zhǎng)。試驗(yàn)以分離出的光合細(xì)菌為對(duì)象，優(yōu)化光合細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并探究其產(chǎn)酶特性以及降NH3-N、能力，旨在為光合細(xì)菌大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 提DNA 試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；Taq酶購(gòu)自鄭州久是生物技術(shù)有限公司；通用引物購(gòu)自深圳華大基因科技有限公司；NaOH、NH4Cl、NaNO2購(gòu)自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；HgI2、C10H7NHCH2NH2·2HCl 購(gòu)自上海阿拉丁有限公司；KI購(gòu)自天津市津北精細(xì)化工有限公司；KNaC4H6O6、NH2SO2C6H4NH2購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；剛果紅、碘購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器 雙人單面凈化工作臺(tái)（鄭州金友寧儀器有限公司，SW-CJ-2FD）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器蘇州有限公司，UV-2600）、蒸汽滅菌器（KAGOSHIMA SEISAKUSYO，KG-SK-700）、光照培養(yǎng)箱（上海一恒有限公司，MGC-P）、pH 計(jì)（奧豪斯儀器蘇州有限公司，ST300）、白熾燈（60 W）、聚乙烯塑料瓶若干（600 mL、300 mL規(guī)格）。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：CH3COONa 3.0 g∕L、NH4Cl 1.0 g∕L、酵母浸粉1.0 g∕L、乙醇1.5 mL∕L、NaCl 2.0 g∕L、K2HPO40.2 g∕L、MgSO40.2 g∕L、NaHCO31.0 g∕L，調(diào)pH值為7.0。

分離培養(yǎng)基：CH3COONa 3.0 g∕L、CH3CH2COONa 0.3 g∕L、NaCl 1.0 g∕L、MgSO40.2 g∕L、（NH4）2SO40.3 g∕L、KH2PO40.5 g∕L、K2HPO40.3 g∕L、CaCl250 mg∕L、酵母浸粉1.0 g∕L、谷氨酸0.2 mg∕L、MnSO42.5 mg∕L、蛋白胨10 mg∕L、FeSO45 mg∕L、瓊脂18 g∕L，調(diào)pH 值為7.0。

發(fā)酵方培養(yǎng)基：將密集培養(yǎng)基中乙醇去除。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：KH2PO41.5 g∕L、蛋白胨5.0 g∕L、酵母膏0.5 g∕L、MgSO40.2 g∕L、NaCl 5.0 g∕L、瓊脂8.0 g∕L、羧甲基纖維素鈉10.0 g∕L，調(diào)pH 值為7.2。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2.0 g∕L、蛋白胨10.0 g∕L、牛肉膏5.0 g∕L、NaCl 5.0 g∕L、瓊脂15.0 g∕L，調(diào)pH值為7.0。

酪素培養(yǎng)基：酪素8.0 g∕L、牛肉膏3.0 g∕L、瓊脂15.0 g∕L，調(diào)pH值為7.0。

1.2 光合細(xì)菌分離

1.2.1 取樣與富集 從河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)河水域中采集底泥，將樣本放入燒杯中，密封帶回水產(chǎn)工程技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室。將50 g 樣品加入到300 mL的帶塞聚乙烯塑料瓶中，之后加滿滅菌的富集培養(yǎng)基，將聚乙烯塑料瓶置于30 ℃、2 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，直至聚乙烯塑料瓶中的液體變?yōu)榧t棕色時(shí)，吸取50 mL的富集液，再次富集培養(yǎng)。

1.2.2 分離和純化 采用雙層平板法，取100μL富集培養(yǎng)液涂布于固體分離培養(yǎng)基上，之后再覆蓋一層瓊脂培養(yǎng)基，在30 ℃下，進(jìn)行光照培養(yǎng)直到長(zhǎng)出紅色菌落，將分離菌株命名為WH-1，挑取單菌落再次平板劃線培養(yǎng)，直到菌種完全純化。

1.3 分離菌株WH-1的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 挑取單菌落接種到分離培養(yǎng)基，放在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，待菌落變紅，革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)。

1.3.2 16S rDNA 鑒定 利用艾德萊DNA 試劑盒提取WH-1 菌株的DNA，通用引物27F 和1492R 對(duì)WH-1菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增。采用25μL的PCR反應(yīng)體系：菌株基因組DNA 1 μL、27F 1 μL、1492R 1μL、ddH2O 12 μL、Taq酶10 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，34 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃末端延伸10 min。制備1%的瓊脂糖凝膠，電泳后在1 500 bp出現(xiàn)條帶，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送去南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 對(duì)光合細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以CH3COONa、NH?Cl、酵母浸粉、NaHCO3為單因素變量，分析比較得出各物質(zhì)適合WH-1 生長(zhǎng)的最佳質(zhì)量濃度。

1.4.1.1 不同質(zhì)量濃度CH3COONa 對(duì)WH-1 生長(zhǎng)的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度保持不變，調(diào)整CH3COONa 的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g∕L，每種培養(yǎng)條件做3個(gè)重復(fù)。

1.4.1.2 不同質(zhì)量濃度NH?Cl 對(duì)WH-1 生長(zhǎng)的影響 CH3COONa 采用初步優(yōu)化后的最適質(zhì)量濃度，培養(yǎng)基中其他物質(zhì)的質(zhì)量濃度保持不變，調(diào)整NH?Cl的質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g∕L，每種培養(yǎng)條件做3個(gè)重復(fù)。

1.4.1.3 不同質(zhì)量濃度酵母浸粉對(duì)WH-1 生長(zhǎng)的影響 CH3COONa 和NH?Cl 使用初步優(yōu)化后的最適質(zhì)量濃度，培養(yǎng)基中其他物質(zhì)的質(zhì)量濃度保持不變，調(diào)整酵母浸粉的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g∕L，每種培養(yǎng)條件做3個(gè)重復(fù)。

1.4.1.4 不同質(zhì)量濃度NaHCO3對(duì)WH-1 生長(zhǎng)的影響 CH3COONa、NH?Cl和酵母浸粉均使用優(yōu)化后的最適質(zhì)量濃度，培養(yǎng)基中其他物質(zhì)的質(zhì)量濃度保持不變，調(diào)整NaHCO3質(zhì)量濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g∕L，每種培養(yǎng)條件做3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 正交試驗(yàn) 菌株WH-1 的生長(zhǎng)受到多種因素的影響，在單因素試驗(yàn)的結(jié)果基礎(chǔ)上，將CH3COONa、NH?Cl、酵母浸粉、NaHCO3等4 種物質(zhì)作為對(duì)其生長(zhǎng)有影響的因素（表1），設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)（表2）。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Tab.1 Orthogonal test factors and levelsg∕L

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.2 Orthogonal test design schemeg∕L

1.4.3 菌液WH-1 計(jì)數(shù) 用牙簽挑取菌落進(jìn)行接種，在溫度30 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx 條件下，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，待菌體變紅。取WH-1菌液適量，梯度稀釋后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)WH-1 進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 分離菌株WH-1產(chǎn)酶特性研究

制備羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，若菌株WH-1 產(chǎn)纖維素酶，則該菌株附近會(huì)產(chǎn)生顯色圈，觀察顯色情況并記錄顯色圈直徑。

制備淀粉培養(yǎng)基，若菌株WH-1 產(chǎn)淀粉酶，則該菌株周?chē)a(chǎn)生透明圈，其余部分顯藍(lán)色，觀察顯色情況并記錄透明圈直徑。

制備酪素培養(yǎng)基，若菌株WH-1 產(chǎn)蛋白酶，則該菌株附近會(huì)形成蛋白質(zhì)水解圈，觀察并記錄WH-1菌株周?chē)鞍踪|(zhì)水解圈直徑。

1.6 分離菌株WH-1降NH3-N試驗(yàn)

采用納什試劑法，在波長(zhǎng)420 nm 處，用10 mm玻璃比色皿，以無(wú)氨純水作參比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)組按1%的接種量接入到含NH3-N 的液體培養(yǎng)基中［添加（NH4）2SO42 g∕L］，每24 h 取樣1 次，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，連續(xù)取樣5 d，測(cè)定NH3-N含量。

1.7 分離菌株WH-1降-N試驗(yàn)

采用重氮-偶氮光度法，在波長(zhǎng)543 nm 處，用10 mm 玻璃比色皿，以純水作參比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)組按1%的接種量接入到含-N 的液體培養(yǎng)基中（添加NaNO22 g∕L），每24 h 取樣1 次，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，連續(xù)取樣5 d，測(cè)定-N含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，根據(jù)Duncan’s 檢驗(yàn)法判斷是否有顯著差異（P＜0.05）；使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行柱狀圖和折線圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 WH-1菌株形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)過(guò)5 d 的光照培養(yǎng)，平板上單菌落呈紅色不透明狀，扁平、圓形（圖1）；革蘭氏染色呈陰性，菌體呈卵圓形（圖2），無(wú)芽孢。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]中沼澤紅假單胞菌的形態(tài)、大小等特性基本相符，可初步確定分離菌株為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。

圖1 菌株WH-1菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain WH-1

圖2 菌株WH-1革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining results of strain WH-1

2.2 WH-1菌株分子鑒定

將WH-1 菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用MEGA 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)分離的菌株WH-1與沼澤紅假單胞菌（R.palustris，GenBank 登錄號(hào)：NR 115542.1）聚在一起，相似性高達(dá)99%，結(jié)合菌株形態(tài)特征觀察，鑒定WH-1 為沼澤紅假單胞菌（R.palustris）（圖3）。

圖3 WH-1菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of WH-1 strain

2.3 WH-1培養(yǎng)基配方的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 以CH3COONa 為培養(yǎng)基組成成分變量因素，培養(yǎng)基其他組成成分不變。從圖4可看出，CH3COONa質(zhì)量濃度為5.0 g∕L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的OD 值為組內(nèi)最大值，且與1.0 g∕L 和4.0 g∕L 所對(duì)應(yīng)的組別之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。考慮到發(fā)酵培養(yǎng)基中原材料的使用和實(shí)際經(jīng)濟(jì)成本，選擇1.0 g∕L為培養(yǎng)基的最佳質(zhì)量濃度。

圖4 CH3COONa對(duì)WH-1菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of CH3COONa on the growth of WH-1 strain

以NH?Cl 為培養(yǎng)基組成成分變量因素，培養(yǎng)基其他組成成分不變。從圖5 可看出，NH?Cl 質(zhì)量濃度為0.5 g∕L 所對(duì)應(yīng)的OD 值最大，且0.5 g∕L 組與其他組別之間均存在顯著差異（P＜0.05）。質(zhì)量濃度為1.0、1.5、2.0 g∕L 三者所對(duì)應(yīng)的OD 值沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)NH?Cl 質(zhì)量濃度為2.5 g∕L 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的OD 值為組內(nèi)最小值，且與0.5、1.0、1.5、2.0 g∕L組別之間均有顯著差異（P＜0.05）。隨著NH?Cl質(zhì)量濃度的增加，WH-1菌株生長(zhǎng)濃度反而降低，原因可能是隨著氮源的增加，使得培養(yǎng)基碳氮比降低，從而導(dǎo)致了WH-1 菌株生長(zhǎng)濃度的下降。綜上，選擇0.5 g∕L為最佳質(zhì)量濃度。

圖5 NH4Cl對(duì)WH-1菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of NH4Cl on the growth of WH-1 strain

以酵母浸粉為培養(yǎng)基組成成分變量因素，培養(yǎng)基其他組成成分不變。從圖6 可看出，酵母浸粉質(zhì)量濃度為2.5 g∕L 所對(duì)應(yīng)的OD 值為組內(nèi)最大值，且與其他組別之間均存在顯著差異（P＜0.05）。隨著酵母浸粉質(zhì)量濃度的增加，WH-1 菌株生長(zhǎng)的濃度也在增加，其原因可能是酵母浸粉中存在大量的WH-1 菌株生長(zhǎng)所需要的生長(zhǎng)因子，酵母浸粉的增加為WH-1 菌株的生長(zhǎng)提供了良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，使得WH-1 菌株生長(zhǎng)良好。綜上，選擇2.5 g∕L 為最佳質(zhì)量濃度。

圖6 酵母浸粉對(duì)WH-1菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of yeast extract on the growth of WH-1 strain

以NaHCO3為培養(yǎng)基組成成分變量因素，培養(yǎng)基其他組成成分不變。從圖7可看出，NaHCO3質(zhì)量濃度為4.0 g∕L 所對(duì)應(yīng)的OD 值為組內(nèi)最大值，且與3.0 g∕L之間不存在顯著差異（P＞0.05）。質(zhì)量濃度為0、1.0、2.0 g∕L 三者所對(duì)應(yīng)的OD 值沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。隨著NaHCO3質(zhì)量濃度的增加，對(duì)應(yīng)的OD 值也緩慢增加，說(shuō)明WH-1 菌液濃度在增加，其原因可能是NaHCO3的增加使得培養(yǎng)基中的碳源增加，當(dāng)其他組成成分不變時(shí)，最終培養(yǎng)基中的碳氮比增加，較高的碳氮比為WH-1 菌株的生長(zhǎng)提供了良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件，使得WH-1 菌株生長(zhǎng)濃度上升。綜上，考慮到發(fā)酵培養(yǎng)基中原材料的使用和實(shí)際經(jīng)濟(jì)成本，選擇3.0 g∕L 為培養(yǎng)基的最佳質(zhì)量濃度。

圖7 NaHCO3對(duì)WH-1菌株生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of NaHCO3 on the growth of WH-1 strain

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3 可知，最佳培養(yǎng)基配方為A3B2C3D3。R值的大小可反映出4 種因素對(duì)WH-1的影響程度，比較表中R值可得各因素的影響主次為A＞C＞B＞D，即CH3COONa＞酵母浸粉＞NH?Cl＞NaHCO3。綜合單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果，適合WH-1 生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方：CH3COONa 1.0 g∕L、NH ?Cl 0.5 g∕L、酵母浸粉3.0 g∕L、NaCl 2.0 g∕L、K2HPO40.2 g∕L、NaHCO33.0 g∕L、MgSO40.2 g∕L。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal test results

2.3.3 菌液濃度計(jì)數(shù) 經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，相比較優(yōu)化前的菌液濃度3.05×109個(gè)∕mL，優(yōu)化后的WH-1 菌液濃度可以達(dá)到4.37×109個(gè)∕mL，證明WH-1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化效果良好。

2.4 WH-1菌株產(chǎn)酶特性

在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，0.2%剛果紅水溶液染色后，可以看到明顯的透明圈，說(shuō)明WH-1 可以產(chǎn)纖維素酶（圖8）；在淀粉培養(yǎng)基中，將盧氏碘液浸于培養(yǎng)基表面，立即檢視，可看到明顯的透明圈，說(shuō)明WH-1 可以產(chǎn)生淀粉酶（圖9）；在酪素培養(yǎng)基中，將酪素添加之后，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有形成蛋白質(zhì)水解圈，說(shuō)明WH-1 不產(chǎn)生蛋白酶。因此，WH-1 可以產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，但是不產(chǎn)蛋白酶。經(jīng)顯色處理后，可以明顯看到該菌株周?chē)娘@色圈直徑在20.0 mm 以上（表4），說(shuō)明WH-1 具有良好的產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)淀粉酶特性，有利于降解水體中的大分子碳水化合物，進(jìn)一步澄清水質(zhì)。

圖8 WH-1菌株產(chǎn)纖維素酶測(cè)定Fig.8 Detection of WH-1 strain produced cellulase

圖9 WH-1菌株產(chǎn)淀粉酶測(cè)定Fig.9 Detection of WH-1 strain produced amylase

表4 菌株WH-1產(chǎn)酶的顯色圈大小Tab.4 Color ring size of enzyme production by strain WH-1

2.5 WH-1菌株對(duì)NH3-N、降解特性

從圖10 可以看出，WH-1 脫氮能力呈線性遞增趨勢(shì)。試驗(yàn)期間，隨著天數(shù)的增加，WH-1 降解NH3-N、的能力在逐漸增強(qiáng)，但是相比較WH-1 對(duì)NH3-N 的降解，降解變化相對(duì)平緩，可能原因是WH-1 對(duì)NH3-N 中氮源的吸收轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)于對(duì)中氮源的吸收轉(zhuǎn)化能力?？傮w上，在高質(zhì)量濃度的NH3-N、環(huán)境中，培養(yǎng)基優(yōu)化之后，WH-1 在第5 天時(shí)降解NH3-N 達(dá)到49.89%、降解達(dá)到31.15%，顯示了WH-1 改良水質(zhì)中良好的脫氮能力。

圖10 WH-1菌株對(duì)NH3-N、降解特性Fig.10 Degradation characteristics of NH3-N and by WH-1 strain

3 結(jié)論與討論

本研究從河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)河分離出1株光合細(xì)菌WH-1，經(jīng)鑒定WH-1 為R.palustris?？紤]到影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)的主要因素是培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)以及含量[22]，因此，本研究選擇CH3COONa、NH?Cl、酵母浸粉、NaHCO3等4 種不同物質(zhì)作為因素變量，探究4種物質(zhì)不同質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的影響，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，得到WH-1生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方：CH3COONa 1.0 g∕L、NH?Cl 0.5 g∕L、酵母浸粉3.0 g∕L、NaCl 2.0 g∕L、K2HPO40.2 g∕L、NaHCO33.0 g∕L、MgSO40.2 g∕L。測(cè)定WH-1 菌液濃度為4.37×109個(gè)∕mL，相比較優(yōu)化之前的菌液濃度增長(zhǎng)43.33%。前人對(duì)CH3COONa 培養(yǎng)基配方的研究中，菌液OD 值在2.0 左右，而本研究中光合細(xì)菌的OD值可達(dá)到2.615。陳秀麗等[23]對(duì)光合細(xì)菌的培養(yǎng)基優(yōu)化之后，菌數(shù)由1.75×109cfu∕mL提高到3.19×109cfu∕mL；陳海生[24]對(duì)光合細(xì)菌的培養(yǎng)基優(yōu)化之后，測(cè)定菌數(shù)為3.96×109cfu∕mL?？梢?jiàn)，本研究?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于光合細(xì)菌的生長(zhǎng)。

由于光合細(xì)菌屬于兼性厭氧菌，采用雙層稀釋平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，操作較為煩瑣，不方便進(jìn)行測(cè)量，因此，本研究對(duì)光合細(xì)菌采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)數(shù)，相對(duì)傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)法，對(duì)光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)更加高效和準(zhǔn)確，采用新的發(fā)酵培養(yǎng)基，測(cè)定菌數(shù)在40 億個(gè)∕mL以上。

本研究發(fā)現(xiàn)，接種WH-1 菌液于高質(zhì)量濃度NH3-N 和的培養(yǎng)基中，5 d 后測(cè)定NH3-N 和的降解率，分別為49.89%和31.15%，NH3-N和降解量分別為105.90 mg 和123.95 mg，相比較王雨婷等[25]分離篩選出的光合細(xì)菌P-3 對(duì)NH3-N 和的降解率89.68% 和94.98%，WH-1 降解率較低。但是考慮到王雨婷等[25]的研究中NH3-N 和初始質(zhì)量濃度均為50 mg∕L，而本試驗(yàn)NH3-N 和的初始質(zhì)量濃度分別為211.27 mg∕L 和397.52 mg∕L，對(duì)比其N(xiāo)H3-N 和降解量44.84 mg 和47.49 mg，顯然本研究中光合細(xì)菌脫氮的質(zhì)量和效果反而更佳。

綜上，本研究從河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)河分離篩選出1 株光合細(xì)菌WH-1，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，有效提高了菌液濃度，且WH-1 具有良好的產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)淀粉酶特性，有利于降解水體中的大分子碳水化合物，在對(duì)NH3-N和的降解試驗(yàn)中，表現(xiàn)出良好的脫氮能力，為光合細(xì)菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖奠定了良好基礎(chǔ)。