響應(yīng)面優(yōu)化畜禽歸芪益母湯酶解提取工藝

劉雪松，薛沾枚，楊慶穩(wěn)，張 艷，孟維珊，王 爽，陳 曦，楊旭東，羅天瑤，朱慶賀，鐘 鵬

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省獸用藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.重慶三峽職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 404155）

畜禽歸芪益母湯是傳統(tǒng)中獸藥經(jīng)典組方之一，收錄于《牛經(jīng)備要醫(yī)方》中，是由《內(nèi)外傷辯惑論》中補(bǔ)血湯加益母草組成，主治動(dòng)物氣血虛弱、產(chǎn)后血虛等，具有補(bǔ)氣生血、活血祛瘀等功效[1]。在方劑中，黃芪補(bǔ)脾和肺氣，滋生血源，為君藥；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，使黃芪的補(bǔ)血效果更強(qiáng)，為臣藥；益母草疏通氣血，祛瘀生新，為佐使藥[2]。畜禽歸芪益母湯在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用較為廣泛，可有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)水平、免疫能力和抗病能力，改善動(dòng)物的血液生化指標(biāo)，并可發(fā)揮產(chǎn)后保健作用[3]。

中藥提取是中藥加工中非常重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)中藥提取方式，如煎煮法、浸漬法及滲流法等，因選擇性差、熱敏物質(zhì)降解率高及雜質(zhì)多等缺點(diǎn)，已不能滿足現(xiàn)代的中藥生產(chǎn)需求[4]。面對(duì)這種情況，研究人員一直在探索著新型中藥提取技術(shù)，用來(lái)滿足現(xiàn)代中藥生產(chǎn)需求[5-8]。生物酶解提取中藥有效成分是一種技術(shù)成熟的新型提取技術(shù)，該技術(shù)利用酶的高效性和專一性破壞中藥細(xì)胞壁，使有效成分更加容易擴(kuò)散出來(lái)，從而有效提高有效物質(zhì)的浸出率，相比較于傳統(tǒng)的煎煮法，生物酶解法具有熱敏感物質(zhì)降解率低、性價(jià)比高及設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[9]。生物酶解技術(shù)已發(fā)展多年，技術(shù)成熟，可有效提高中藥中多糖、黃酮及生物堿等有效物質(zhì)的提取率[10-11]。針對(duì)中藥植物細(xì)胞壁的特點(diǎn)，常采用的酶種類包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶及蛋白酶等[12]。畜禽歸芪益母湯的提取依然采用傳統(tǒng)煎煮法，存在藥材中熱敏物質(zhì)降解率高、提取成本高及雜質(zhì)多等缺點(diǎn)。鑒于此，以中藥有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)畜禽歸芪益母湯的酶解提取工藝進(jìn)行探索優(yōu)化，以期掌握畜禽歸芪益母湯最佳的提取工藝。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芪、當(dāng)歸及益母草藥材由黑龍江省領(lǐng)康生物科技有限公司提供；纖維素酶（10 萬(wàn)U∕g）、果膠酶（10 萬(wàn)U∕g）、木瓜蛋白酶（10 萬(wàn)U∕g）、β-葡聚糖酶（4萬(wàn)U∕g）及木聚糖酶（10 萬(wàn)U∕g）等均購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201907）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈均購(gòu)自北京迪科馬科技有限公司；分析級(jí)磷酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析級(jí)甲酸購(gòu)自遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

島津LC20-AT 液相色譜儀、SPD-M20A 二級(jí)陣列管檢測(cè)器、InertSustainC18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等均為日本島津公司產(chǎn)品；FS-250N超聲波處理器為上海生析超聲儀器有限公司產(chǎn)品；MS104TS 電子分析天平為梅特勒-托利多有限公司產(chǎn)品；DH4000 恒溫培養(yǎng)箱為泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 高效液相色譜條件

按照文獻(xiàn)[13-14]的方法，建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸的液相色譜測(cè)定方法。毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜測(cè)定方法：以乙腈-0.2%甲酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫為25 ℃，流速為1 mL∕min。阿魏酸色譜測(cè)定方法：以乙腈-0.085%磷酸溶液（17∶83）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm，柱溫35 ℃，流速為1 mL∕min。

1.4 畜禽歸芪益母湯酶解液制備

取黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院自制畜禽歸芪益母湯酶解提取液，以3 500 r∕min 的條件離心20 min，取上清液濾過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品5 mg 至10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線，混勻，即得毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。通過(guò)稀釋分別獲得質(zhì)量濃度為50、25、10、1、0.5 μg∕mL的工作液，分別進(jìn)樣20μL至液相色譜儀，測(cè)定峰面積，繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。精密稱定阿魏酸對(duì)照品2.4 mg 至10 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶解定容至刻度線，混勻，即得阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。通過(guò)稀釋分別獲得質(zhì)量濃度為24、12、6、3、1、0.5 μg∕mL 的工作液，分別進(jìn)樣20 μL 至液相色譜儀，測(cè)定峰面積，繪制阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

取自制畜禽歸芪益母湯酶解提取液樣品，測(cè)定6 次，分別計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度，進(jìn)行精密度測(cè)定；取同批次自制畜禽歸芪益母湯酶解提取液樣品6 份，分別測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)；將已知毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度的畜禽歸芪益母湯酶解提取液樣品分成3 份，按照80%、100%和120%的比例分別加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸對(duì)照品，處理后測(cè)定質(zhì)量濃度，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

1.7 畜禽歸芪益母湯酶解產(chǎn)物有效物質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定

將120 g 黃芪、30 g 當(dāng)歸和60 g 益母草進(jìn)行粉碎，過(guò)0.425 mm孔徑篩。將20 g中藥粉加入100 mL水后分別調(diào)整到各個(gè)酶的最適pH 值，分別加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶及木聚糖酶。其中纖維素酶組和木聚糖酶組調(diào)節(jié)pH 值至5.0，果膠酶組及木瓜蛋白酶調(diào)節(jié)pH 值至7.0，調(diào)節(jié)β-葡聚糖酶組pH 值至5.5。酶底比為45%，在50 ℃條件下酶解6 h，酶解后加熱10 min 使酶滅活。待酶解產(chǎn)物冷卻后，按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行超聲提取：超聲功率250 W、頻率50 Hz、溫度50 ℃、時(shí)間30 min，提取2 次。將提取液濃縮至25 mL，取2.5 mL 濃縮提取液至25 mL 容量瓶中，加入70%甲醇定容到刻度，搖勻，按照1.4 中的步驟處理后上機(jī)分別測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度。應(yīng)用傳統(tǒng)煎煮法對(duì)中藥進(jìn)行提取作為對(duì)照組。

1.8 纖維素酶酶解條件單因素試驗(yàn)

稱取20 g 中藥粉置于100 mL 水中，酶底比為45%，酶解溫度為50 ℃，pH 值為5.0，酶解時(shí)間分別為3、6、9、12、24 h，測(cè)定不同時(shí)間組酶解產(chǎn)物毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度。在酶解溫度為50 ℃，pH值為5.0，酶解時(shí)間為9 h，酶底比分別為5%、15%、30%、45%、60%的條件下，測(cè)定不同酶底比組酶解產(chǎn)物毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度。在pH 值為5.0，酶解時(shí)間為9 h，酶底比為45%，酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下，測(cè)定不同溫度組酶解產(chǎn)物毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度。在酶解時(shí)間為9 h，酶底比為45%，溫度為50 ℃，分別調(diào)節(jié)pH 值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的條件下，測(cè)定不同pH 值組酶解產(chǎn)物毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度。

1.9 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶酶解條件

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以響應(yīng)面法中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。在45%酶底比的條件下，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，以酶解時(shí)間、酶解溫度和pH 值為自變量按表1設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，從而掌握畜禽歸芪益母湯最佳酶解提取工藝。采用響應(yīng)面法確定的最佳酶解工藝，進(jìn)行5 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。

表1 畜禽歸芪益母湯酶解提取工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平Tab.1 Response surface factors and levels of enzymatic hydrolysis extraction process of live stock and poultry Guiqi Yimu decoction

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法學(xué)驗(yàn)證

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品和酶解提取產(chǎn)物的色譜圖如圖1所示。毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品和酶解提取液樣品均在16.9～17.3 min 處出峰，且周圍無(wú)雜質(zhì)峰干擾。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=475.00X-908.33，決定系數(shù)（R2）為0.999 1。在精密度試驗(yàn)中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.94%，精密度良好；在重復(fù)性試驗(yàn)中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD為0.93%，重復(fù)性良好；在加樣回收率試驗(yàn)中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均回收率為90.13%，RSD為1.97%，回收率良好。以上結(jié)果表明，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜方法可用于測(cè)定樣品。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（A）及酶解提取樣品（B）色譜分析結(jié)果Fig.1 Chromatographic analysis results of clycosin-7-O-β-D-glucopyranoside reference substance sample（A）and enzymatic hydrolysis extraction sample（B）

阿魏酸對(duì)照品及酶解提取產(chǎn)物的色譜圖如圖2所示。阿魏酸對(duì)照品及酶解提取液樣品均在26.2～27.6 min 處出峰，且周圍無(wú)雜質(zhì)峰干擾。阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=455.00X-871.33，決定系數(shù)（R2）為0.998 7。在精密度試驗(yàn)中，阿魏酸峰面積RSD為1.01%，說(shuō)明精密度良好；在重復(fù)性試驗(yàn)中，阿魏酸峰面積RSD為1.04%，重復(fù)性良好；在加樣回收率試驗(yàn)中，阿魏酸平均回收率為90.13%，RSD為1.88%，說(shuō)明回收率良好。以上結(jié)果表明，測(cè)定阿魏酸的色譜方法可用于測(cè)定樣品。

圖2 阿魏酸對(duì)照品（A）及酶解提取樣品（B）色譜分析結(jié)果Fig.2 Chromatographic analysis results of ferulic acid reference substance sample（A）and enzymatic hydrolysis extraction sample（B）

2.2 酶解對(duì)畜禽歸芪益母湯有效物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

酶解對(duì)畜禽歸芪益母湯有效物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響表2 所示。由表2 可以看出，與應(yīng)用傳統(tǒng)方法提取的對(duì)照組相比，纖維素酶酶解產(chǎn)物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度增幅最高，分別為29.45%和35.52%。纖維素酶使黃芪和當(dāng)歸細(xì)胞壁充分酶解，有效物質(zhì)充分釋放，故選用纖維素酶進(jìn)行畜禽歸芪益母湯的酶解提取。

表2 酶解對(duì)畜禽歸芪益母湯有效物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響Tab.2 Effect of enzymatic hydrolysis on the mass concentration of effective substances in livestock and poultry Guiqi Yimu decoctionmg∕mL

2.3 纖維素酶酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

酶解時(shí)間對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度影響如圖3A所示，在3～9 h，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，有效物質(zhì)質(zhì)量濃度也在不斷增加，在9～12 h，有效物質(zhì)質(zhì)量濃度提升較小。酶底比對(duì)有效物質(zhì)質(zhì)量濃度影響如圖3B 所示，在酶底比為5%～45%時(shí)，隨著酶底比的增加，有效物質(zhì)質(zhì)量濃度不斷提升；在酶底比為45%～60%時(shí)，有效物質(zhì)質(zhì)量濃度幾乎不變?？紤]到性價(jià)比等因素，故采用45%酶底比進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。溫度對(duì)有效物質(zhì)質(zhì)量濃度影響結(jié)果如圖3C 所示，隨著溫度提升，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在50 ℃左右質(zhì)量濃度最高。pH 值對(duì)有效物質(zhì)質(zhì)量濃度影響如圖3D 所示，隨著pH 值增加，2 種有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，在pH值為5.0的條件下，2種有效物質(zhì)質(zhì)量濃度最高。

圖3 纖維素酶酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Single factor test results of cellulase hydrolysis conditions

2.4 纖維素酶酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

按照表3 的設(shè)計(jì)進(jìn)行提取試驗(yàn)，建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程：Y=0.220+2.375×10-3A+1.250×10-3B-8.750×10-4C-2.250×10-3AB-1.000×10-3AC+2.500×10-4BC-0.016A2-0.012B2-0.018C2。經(jīng)方差分析，模型F=41.11，P＜0.000 1，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；R2=0.981 4，失擬項(xiàng)P＞0.05（表4），說(shuō)明回歸模型擬合程度高。二次項(xiàng)A2、B2及C2對(duì)方程影響極顯著。酶解溫度與時(shí)間對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖4A。在酶解溫度相同時(shí)，隨著時(shí)間增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。在酶解時(shí)間相同時(shí)，隨著溫度增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度明顯。酶解pH 值與時(shí)間對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖4B。在pH 值相同時(shí)，隨著時(shí)間增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。在時(shí)間相同時(shí)，隨著pH 值增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。酶解pH 值與溫度對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖4C。在pH 值相同時(shí)，隨著溫度增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。在溫度相同時(shí)，隨著pH 值增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度明顯。

圖4 酶解時(shí)間、溫度和pH值對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度交互作用的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis of the interaction among enzymatic time，temperature and pH value on the mass concentration of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside

表3 酶解提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化結(jié)果Tab.3 Enzymolysis extraction experiment design and optimization results

表4 以毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為響應(yīng)值回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model with the content of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside as response value

按照表3 的設(shè)計(jì)進(jìn)行提取試驗(yàn)，建立阿魏酸回歸方程：Y=0.120+5.000×10-4A+7.500×10-4B+2.500×10-4C-2.500×10-4AB-1.250×10-3AC+2.500×10-4BC-3.625×10-3A2-3.125×10-3B2-8.625×10-3C2。經(jīng)方差分析，模型F=14.56，P＜0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；R2=0.949 3，失擬項(xiàng)P＞0.05（表5），說(shuō)明回歸模型擬合程度高。二次項(xiàng)B2對(duì)方程影響顯著，A2和C2對(duì)方程影響極顯著。酶解溫度與時(shí)間對(duì)阿魏酸質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖5A，在溫度相同時(shí)，隨著時(shí)間增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后趨于平緩，響應(yīng)面坡度較明顯。在時(shí)間相同時(shí)，隨著溫度增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后趨于平緩，響應(yīng)面坡度較明顯。酶解pH 值與時(shí)間對(duì)阿魏酸質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖5B。在pH 值相同時(shí)，隨著時(shí)間增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后趨于平緩，響應(yīng)面坡度明顯。在時(shí)間相同時(shí)，隨著pH 值增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。酶解pH 值與溫度對(duì)阿魏酸質(zhì)量濃度影響三維效應(yīng)見(jiàn)圖5C。在pH 值相同時(shí)，隨著溫度增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。在溫度相同時(shí)，隨著pH 值增加，阿魏酸質(zhì)量濃度先增大后減小，響應(yīng)面坡度較大。

圖5 酶解時(shí)間、溫度和pH值對(duì)阿魏酸質(zhì)量濃度交互作用的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface analysis of the interaction among enzymatic time，temperature and pH value on the mass concentration of ferulic acid

表5 以阿魏酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值回歸模型方差分析Tab.5 Variance analysis of regression model with the content of ferulic acid as response value

經(jīng)過(guò)Design Expert 軟件分析，預(yù)測(cè)最佳酶解條件為時(shí)間9.04 h、溫度50.36 ℃，pH值為5.0。在這個(gè)條件下毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為0.222 mg∕mL，阿魏酸質(zhì)量濃度為0.124 mg∕mL。在溫度50 ℃、pH值為5.0、時(shí)間9 h、酶底比為45%的條件下進(jìn)行酶解，驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果有效性，共重復(fù)5次。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為0.217 mg∕mL，阿魏酸質(zhì)量濃度為0.122 mg∕mL，與模型預(yù)期結(jié)果相近。經(jīng)纖維素酶酶解提取的畜禽歸芪益母湯較傳統(tǒng)提取方法的毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度提高48.63%，阿魏酸質(zhì)量濃度提高69.52%。

3 結(jié)論與討論

畜禽歸芪益母湯作為典型的傳統(tǒng)中獸藥，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用較為廣泛，可有效增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力、提高抗氧化能力及改善腎功能等[15]。畜禽歸芪益母湯中主要活性成分包括黃芪異黃酮類、黃芪皂苷類、阿魏酸及多糖類等有效物質(zhì)[16]。黃芪中黃酮類化合物主要包括毛蕊異黃酮、芒柄花素葡糖苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷等[17]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）中規(guī)定的黃芪測(cè)定指標(biāo)之一，具有提高機(jī)體免疫力、抗癌等作用，中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）中規(guī)定黃芪干燥品中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷不得少于0.020%[18]。當(dāng)歸的主要作用活性成分是阿魏酸，是中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）中規(guī)定的當(dāng)歸測(cè)定指標(biāo)之一，中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）規(guī)定當(dāng)歸干燥品中含阿魏酸不得少于0.050%[19]?？紤]到畜禽歸芪益母湯中黃芪為君藥，當(dāng)歸為臣藥，本研究選用毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度作為測(cè)定指標(biāo)，并且這2種有效物質(zhì)使用紫外及二級(jí)陣列管檢測(cè)器便可進(jìn)行檢測(cè)，要求的質(zhì)量濃度測(cè)定設(shè)備較為簡(jiǎn)單。本研究測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜方法是按照文獻(xiàn)[14]中的等度洗脫方法，而非中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）中規(guī)定的梯度洗脫方法。本研究預(yù)試驗(yàn)時(shí)采用中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）中規(guī)定的梯度洗脫方法對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰與基線不能分離，可能是由于畜禽歸芪益母湯中成分復(fù)雜，雜質(zhì)峰較多造成的。隨后采用文獻(xiàn)[14]中描述的等度洗脫方法，增大了流動(dòng)相極性，并且延長(zhǎng)了洗脫時(shí)間，使毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰與基線分離，并且周圍無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

生物學(xué)酶解提取中藥是伴隨著酶工程發(fā)展而興起的一項(xiàng)提取技術(shù)。酶的作用具有極高的專一性，需要根據(jù)中藥的種類選擇酶的種類[20]。呂鳳嬌等[21]利用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取黃芪總皂苷的工藝，發(fā)現(xiàn)纖維素酶可有效酶解黃芪的細(xì)胞壁，提高黃芪總皂苷的提取率。王妮等[22]利用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化黃芪超聲-纖維素酶協(xié)同提取工藝，發(fā)現(xiàn)纖維素酶與超聲協(xié)同可有效提取黃芪中的黃芪多酚。纖維素酶除了可有效酶解黃芪外，也可對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行酶解。劉炳福等[23]的研究表明，纖維素酶可有效提高當(dāng)歸中阿魏酸的質(zhì)量濃度，比傳統(tǒng)水提工藝增加34.36%。本研究中，經(jīng)過(guò)纖維素酶酶解后的畜禽歸芪益母湯中有效物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質(zhì)量濃度為0.217 mg∕mL，經(jīng)過(guò)換算質(zhì)量濃度為0.271 mg∕g，高于侯秋苑等[24]應(yīng)用冷浸法提取理沖湯測(cè)定的0.200 mg∕g，與田甜等[25]在木丹顆粒中測(cè)定的0.286 mg∕g 相近。經(jīng)過(guò)纖維素酶酶解后畜禽歸芪益母湯產(chǎn)物中阿魏酸的質(zhì)量濃度為0.122 mg∕mL，高于溫海波等[26]在復(fù)方生丹芩口服液中測(cè)定的0.043 mg∕mL，高于程偉等[27]應(yīng)用煎煮法提取益腎湯測(cè)定的0.045 mg∕mL。纖維素酶對(duì)黃芪的提取符合Fick 第二定律，纖維素酶不會(huì)改變提取傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)，僅破壞細(xì)胞壁，降低擴(kuò)散阻力，使有效物質(zhì)的傳質(zhì)速率和有效擴(kuò)散系數(shù)顯著提高[29]。纖維素酶也可有效破壞當(dāng)歸的細(xì)胞壁，增加細(xì)胞壁的通透性，使擴(kuò)散阻力減小，從而增加阿魏酸等有效成分的提取率[23]。酶解提取技術(shù)因具有提高中藥有效物質(zhì)的提取率、降低熱敏物質(zhì)的降解率、節(jié)省能源的使用及設(shè)備儀器較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，得到大力提倡[29]。

本研究以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度為指標(biāo)，對(duì)傳統(tǒng)中獸藥組方畜禽歸芪益母湯的纖維素酶酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終掌握了最佳的纖維素酶提取工藝。纖維素酶提取條件：酶解時(shí)間9 h，酶底比45%，溫度50 ℃，pH 值為5.0。在此條件下，酶解產(chǎn)物中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸質(zhì)量濃度均較高。綜上，本研究掌握了可有效提取畜禽歸芪益母湯有效物質(zhì)的纖維素酶提取工藝，為下一步的中試試驗(yàn)提供了依據(jù)。