中藥復(fù)方干預(yù)血管性癡呆痰濁蒙竅證代謝組學(xué)生物標(biāo)志物臨床研究

樛秀俊 林圓圓 張 寶 楊 帆 蘇海燕

（呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）為各種腦血管因素引起腦組織損害并致腦功能障礙，以操作、解決及組織能力等認(rèn)知功能障礙為主[1]，屬中醫(yī)“癡呆”“呆病”等范疇[2]，病位在腦，與臟腑功能失調(diào)相關(guān)[3]，結(jié)合本地區(qū)特點(diǎn)，痰濁蒙竅是該病的病理關(guān)鍵，瘀血與痰濁貫穿其始終且互結(jié)，久滯不化，釀毒損髓腦絡(luò)則是其發(fā)生及演變的核心環(huán)節(jié)，本研究探尋中藥復(fù)方-“調(diào)肺健脾、化痰理血”法影響血管性癡呆痰濁蒙竅證可能代謝組學(xué)生物標(biāo)志物水平變化情況，對(duì)今后指導(dǎo)臨床診療及病證從宏觀到微觀臨床研究奠定基礎(chǔ)，具有顯著意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本科室血管性癡呆痰濁蒙竅證患者80例，隨機(jī)分治療組、對(duì)照組，每組各40例。兩組年齡、性別、病程、病情輕重、中醫(yī)證候積分、日常生活活動(dòng)能力、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表評(píng)分均P＞0.05，無(wú)顯著差異，具有可比性。患者或家屬對(duì)研究知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) ①西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照美國(guó)精神障礙診斷統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版（DSM-IV）及《血管性癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)（草案）》（2002年）[4]。②中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002年）中的“癡呆”診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合血管性癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除其他導(dǎo)致患者癡呆的疾病。②符合中醫(yī)辨證為痰濁蒙竅證的患者。

1.1.3 排除或終止標(biāo)準(zhǔn) ①其他原因?qū)е掳V呆的疾病患者。②伴急性疾病者。③合并重要臟器、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)病和精神病、惡性腫瘤者。④各種原因需終止者。

1.2 治療方法

1.2.1 治療組 在給予患者內(nèi)科基礎(chǔ)治療時(shí)聯(lián)合以“調(diào)肺健脾、化痰理血”法為主要治則的中藥復(fù)方進(jìn)行治療。中藥復(fù)方組成如下：陳皮12 g、法半夏12 g、甘草6 g、茯苓20 g、葛根30 g、澤瀉10 g、石菖蒲15 g、郁金10 g、白術(shù)12 g、山藥10 g、佩蘭12 g、枳實(shí)12 g、當(dāng)歸12 g、黨參10 g、遠(yuǎn)志12 g、竹茹12 g、川芎6 g、丹參20 g，每日1劑，早晚溫服，共治療4周。

1.2.2 對(duì)照組 給予患者內(nèi)科基礎(chǔ)治療，根據(jù)病情合理選擇藥物及用量，共治療4周。

1.2.3 樣品的采集與制備 早上采集空腹患者血液后立即4 ℃條件下3 000 rpm離心10 min，將血漿放到EP管-40 ℃保存。在4 ℃條件下解凍，經(jīng)多層次樣本處理后取上清進(jìn)樣分析。

1.2.4 試驗(yàn)條件 色譜分離：整個(gè)分析過(guò)程中樣品置4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，樣品采用SHIMADZU-LC30超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）使用HILIC色譜柱進(jìn)行分離。質(zhì)譜采集：每例樣品分別采用電噴霧電離（ESI）進(jìn)行正、負(fù)離子模式檢測(cè)。

1.3 療效觀察

1.3.1 觀察指標(biāo) 本課題前期研究結(jié)果顯示，血管性癡呆痰濁蒙竅證患者存在區(qū)別于正常及其他證型（腎虛髓減、心肝陰虛、心脾兩虛、氣虛血瘀證）的代謝通路完成了核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)分子和相互作用、氨基酸代謝、碳水化合物代謝。其中，存在22種對(duì)分型貢獻(xiàn)較為顯著的差異性物質(zhì)：丙酮酸、谷氨酰胺、牛磺酸、茵芋堿、花生四烯酸、香蘭素、肉毒堿、甲氨二氮?、甘油-3-磷酸氧化酶、血栓素B2、左旋谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、乙酰天冬氨酰谷氨酸、甲狀腺素、琥珀酸、迷迭香酸、甘露糖、乙酰神經(jīng)氨酸、尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸酯、半乳糖、黃豆苷元。這22種物質(zhì)均可能為血管性癡呆痰濁蒙竅證代謝組學(xué)生物標(biāo)志物，可作為觀察指標(biāo)，并且前9種貢獻(xiàn)較大。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理方法 原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積，經(jīng)UV預(yù)處理后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

治療組與對(duì)照組各代謝標(biāo)志物比較：治療組與對(duì)照組各代謝標(biāo)志物比較經(jīng)檢驗(yàn)P＞0.05，無(wú)顯著性差異，故兩組具有可比性。兩組患者自身治療前后各代謝標(biāo)志物比較，均可見(jiàn)治療后的代謝標(biāo)志物水平向正常水平趨近，但經(jīng)檢驗(yàn)，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且兩組藥后組間比較經(jīng)檢驗(yàn)P＞0.05，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1～4、表1）。其中，TZYQ-治療組治療前、TZYH-治療組治療后，TDYQ-對(duì)照組治療前、TDYH -對(duì)照組治療后，ZC-正常對(duì)照組。

圖1 治療組治療前后及正常對(duì)比(P)

圖2 治療組治療前后及正常對(duì)比(N)

圖3 對(duì)照組治療前后及正常對(duì)比(P)

圖4 對(duì)照組治療前后及正常對(duì)比(N)

觀察兩組治療前后生物標(biāo)志物變化情況如下：治療組中谷氨酰胺、花生四烯酸治療前后差異顯著，對(duì)照組中茵芋堿、尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸酯治療前后差異顯著，其余物質(zhì)兩組治療前后經(jīng)檢驗(yàn)均P＞0.05，但均可見(jiàn)向正常水平趨近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且兩組藥后組間比較經(jīng)檢驗(yàn)P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療組可使生物標(biāo)志物更易向正常水平趨近。

3 討論

近年隨著諸多因素致腦血管疾病逐漸增多，血管性癡呆的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，威脅著人類的身心健康，加重家人的陪伴和護(hù)理負(fù)擔(dān)，也是全球范圍內(nèi)較重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。目前臨床主要采用西藥通過(guò)擴(kuò)張血管、改善腦循環(huán)等進(jìn)行治療[6]，尚缺乏非常理想且療效肯定的治療方法，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。西藥不良反應(yīng)多、依賴性大及可能導(dǎo)致其他并發(fā)癥[7]，且國(guó)內(nèi)外的醫(yī)療發(fā)展趨勢(shì)均是在治病的同時(shí)盡可能減少對(duì)器官及其功能的損害[8]，尤其是為患者爭(zhēng)取良好的遠(yuǎn)期療效及生活質(zhì)量等成為當(dāng)前該病診療的趨勢(shì)，對(duì)此中醫(yī)藥在諸多方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)證候是對(duì)疾病處于一定階段的病因、病位、病變性質(zhì)以及邪正雙方力量對(duì)比等各方面情況的病理概括[9-10]。中醫(yī)是介于自然科學(xué)與社會(huì)科學(xué)之間的科學(xué)體系，其復(fù)雜性使人們對(duì)其的診療機(jī)制尚不完全明確，且尚無(wú)特異性診斷的試驗(yàn)指標(biāo)。中醫(yī)的證候是通過(guò)望、聞、問(wèn)、切四診所獲得的一組有相互關(guān)聯(lián)的癥狀和體征群的信息整理而得，其準(zhǔn)確性在很大程度上依賴醫(yī)師“經(jīng)驗(yàn)”診療水平[11]，缺乏客觀依據(jù)，許多學(xué)者期望依賴現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)一步闡明證候?qū)嵸|(zhì)。因此，不斷探索并建立具有臨床實(shí)際指導(dǎo)意義的中醫(yī)病證統(tǒng)一的證候診斷金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)患者的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)（如生化指標(biāo)、物理項(xiàng)目等）、微觀物質(zhì)（如代謝生物標(biāo)志物等）等進(jìn)行檢查并觀察中醫(yī)藥治療前后的變化，在不斷驗(yàn)證和完善疾病中西醫(yī)證候診斷的同時(shí)，為中醫(yī)臨床診療疾病的效果的判定提供評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]，使其有理有據(jù)，更具有說(shuō)服力、可靠性、科學(xué)性[13]。使中醫(yī)藥診療疾病由經(jīng)驗(yàn)走向有據(jù)可依，將有力推動(dòng)中醫(yī)藥的快速發(fā)展，這也是時(shí)代對(duì)中醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的迫切需求。

人們希望通過(guò)證候物質(zhì)基礎(chǔ)的尋找，找到證候的特異性指標(biāo)，建立證候試驗(yàn)診斷客觀性金指標(biāo)，并通過(guò)治療前后標(biāo)志物的變化情況佐證標(biāo)志物的可能性，從而實(shí)現(xiàn)證候的微觀辨證依據(jù)。代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，通過(guò)考察生命個(gè)體對(duì)由病理生理刺激或遺傳修飾引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，來(lái)研究整體的生物學(xué)狀況[14]，能揭示證候的系統(tǒng)化、動(dòng)態(tài)化、整體化的特點(diǎn)，從而為中醫(yī)證候研究提供嶄新的技術(shù)平臺(tái)[15]，是“證”本質(zhì)研究方法學(xué)體系的一種拓展和深化?！白C”是中醫(yī)對(duì)疾病某一階段的特定病理生理過(guò)程的認(rèn)識(shí)[16]，是中醫(yī)理論中的基本概念，也是辨證論治體系的基礎(chǔ)?？梢?jiàn)代謝組學(xué)適用于血管性癡呆證侯本質(zhì)的相關(guān)研究。

血管性癡呆發(fā)病機(jī)制的研究多涉及膽堿能系統(tǒng)受損、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性、炎性反應(yīng)、氧自由基毒性損傷、突觸可塑性、遺傳等[17-20]，本課題前期研究結(jié)果顯示，血管性癡呆痰濁蒙竅證與其他證型比較，存在著區(qū)別于其他證型的嘧啶代謝、花生四烯酸代謝、甘油脂類新陳代謝、神經(jīng)退化多種疾病的通絡(luò)、多巴胺能神經(jīng)突觸、刺激神經(jīng)受體相互作用、酪氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丙氨酸及天冬氨酸和谷氨酸代謝、丙酮酸代謝氨基糖和核苷酸糖代謝通路，這些通路完成了核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)分子和相互作用、氨基酸代謝、碳水化合物代謝，其中存在22種對(duì)分型貢獻(xiàn)較為顯著的差異性物質(zhì)。通過(guò)對(duì)中藥復(fù)方-“調(diào)肺健脾、化痰理血”法干預(yù)血管性癡呆的痰濁蒙竅證治療前后該22種可能代謝組學(xué)生物標(biāo)志物的水平比較研究，結(jié)果顯示治療組中谷氨酰胺、花生四烯酸治療前后差異顯著，對(duì)照組中茵芋堿、尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸酯治療前后差異顯著，其余物質(zhì)兩組治療前后經(jīng)檢驗(yàn)均P＞0.05，但均可見(jiàn)治療后的指標(biāo)水平向正常水平趨近。并且兩組藥后組間比較經(jīng)檢驗(yàn)P＞0.05，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從改變幅度上治療組略優(yōu)于對(duì)照組，可影響生物標(biāo)志物更易向正常水平趨近。可見(jiàn)各代謝物通過(guò)諸多途徑參與血管性癡呆痰濁蒙竅證的生物代謝，中藥復(fù)方-“調(diào)肺健脾、化痰理血”法可影響血管性癡呆痰濁蒙竅證可能生物標(biāo)志物更易向正常水平趨近，從微觀角度闡釋其臨床療效，并進(jìn)一步佐證了該22種代謝物質(zhì)為該病證的代謝組學(xué)生物標(biāo)志物的較大可能性，為進(jìn)一步深化研究提奠定了一定的研究基礎(chǔ)。