林有東 李 芳 阮海濤
(1 福建省立醫(yī)院檢驗科,福建 福州 350001;2 三明市第一醫(yī)院藥劑科,福建 三明 365000;3 福建醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)工程學院/福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院檢驗科,福建 福州 350004)
胃癌是全球常見的癌癥之一,也是位居病死率第三位的癌癥[1]。胃腺癌是胃癌中最常見的組織類型,但其潛在的發(fā)生發(fā)展機制仍尚未闡明[2]。血小板是巨核細胞脫落而來的細胞質(zhì)碎片,主要在骨髓、血液和肺中生成[3]。血小板與血栓的形成、止血以及機體的免疫和炎性反應(yīng)包括腫瘤免疫反應(yīng)密切相關(guān)[4-6]。同時也有很多研究發(fā)現(xiàn),血小板通過其顆粒內(nèi)的生物活性因子促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。血小板分泌大量的血小板衍生因子,如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)。TGFβ是一種多功能的細胞因子,它代表一個由33個結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞外蛋白組成的超家族,它影響了多種生物學功能,如細胞生長、分化、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)控各種腫瘤如胃腺癌、肝癌和乳腺癌等的發(fā)生發(fā)展[7]。因此,目前研究普遍認為TGFβ是治療多種癌癥潛在的重要靶標。TGFβ共有5種亞型,但在哺乳動物如人類體內(nèi)僅存在TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3,這3種亞型具有相似的作用,其中以TGFβ1最為豐富。人體內(nèi)的TGFβ主要來源于血小板內(nèi)的α顆粒。血小板源性的TGFβ1可以通過降低NK細胞介導的細胞毒性的NK組2D(NKG2D)因子及抑制NK細胞的抗腫瘤反應(yīng)性來降低NK細胞的活性,或者通過降低NK細胞Fas配體和TNF相關(guān)的凋亡誘導配體識別和消除腫瘤細胞的作用。血小板源性的TGFβ1也可通過激活TGF-β/Smad和NF-κB通路,誘導上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。也有一些研究認為TGFβ1對腫瘤細胞的作用具有兩面性,其參與了腫瘤細胞的免疫逃逸,血小板被腫瘤細胞活化后可能通過纖維蛋白、P-選擇素和整合素等分子黏附在腫瘤細胞上形成一層保護物質(zhì),使腫瘤細胞避免受到NK細胞的殺傷。體內(nèi)外試驗表明血小板源性的TGFβ1能影響肝癌和卵巢凋亡和轉(zhuǎn)移,但其對胃腺癌細胞生物學行為的影響尚未見報道。因此,本課題探討血小板源性TGFβ1對胃腺癌細胞增殖和遷移的影響,可以更好地為闡明胃腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定基礎(chǔ)。
1.1 胃腺癌細胞株 胃腺癌AGS、MKN-45兩種細胞株,其中AGS細胞株購買自廣州賽諾實驗有限公司,MKN-45細胞株為本課題組凍存于福建省立醫(yī)院檢驗科細胞室。
1.2 試劑耗材 MKN-45細胞液體培養(yǎng)基DMEM購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;AGS細胞液體培養(yǎng)基F12和PBS緩沖液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合液和CCK試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司;siRNA(包括NCsiRNA和TGFβR1-homo-351siRNA)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成;轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 細胞培養(yǎng) 將細胞凍存管從液氮罐中取出復(fù)蘇,于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶各加入5 mL培養(yǎng)液后移至37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞生長狀態(tài)良好且無污染,貼壁細胞密度已達到80%以上后進行傳代分組備用。
1.3.2 實驗分組 CCK增殖實驗:細胞定量培養(yǎng)于96孔板,每株細胞設(shè)未處理組(without treated)、健康人血小板組(normal)、胃腺癌血小板組(cancer)3組。分別是不加血小板、加健康人血小板、加胃腺癌患者血小板進行共培養(yǎng)。劃痕實驗:細胞定量培養(yǎng)于6孔板。每株細胞設(shè)未處理組(without treated)、健康人血小板組(normal)、胃腺癌血小板組(cancer)、胃腺癌血小板+NCsiRNA組(cancer+NCsiRNA)、胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA351(cancer+siRNA351)組共5組,分別是不加血小板、加健康人血小板、加胃腺癌患者血小板、加胃腺癌患者血小板和NcSiRNA、胃腺癌血小板和TGFβR1siRNA351進行共培養(yǎng)。
1.3.3 血小板制備 取健康人或者胃腺癌患者靜脈血于無菌玻璃管采血管,以800 rpm離心15 min;吸離心后的上清液于無菌玻璃采血管,3 000 rpm離心10 min;棄上清液,得到濃縮血小板團塊,之后加入5 mL無菌生理鹽水輕輕吹打混勻,再3 000 rpm離心10 min;再次棄上清液,加入5 mL未加小牛血清和雙抗的細胞培養(yǎng)液,輕輕吹打混勻備用,顯微鏡下計數(shù),調(diào)整血小板濃度為2×104個/μL。
圖1 血小板顯微鏡鏡下計數(shù)(400倍)
1.3.4 siRNA轉(zhuǎn)染 細胞定量培養(yǎng)后細胞密度需達到約70%時轉(zhuǎn)染;在進行轉(zhuǎn)染前,需將每孔內(nèi)的舊培養(yǎng)液棄去,換成新鮮的已配制的培養(yǎng)液2 mL;取無菌離心管,加125 μL未配制的培養(yǎng)液和5 μLsiRNA,用移液槍輕輕吹打混勻,再加入4 μL轉(zhuǎn)染試劑,再次輕輕吹打混勻,避光存放30 min后使用,所得試劑6 h內(nèi)可用。
1.3.5 CCK細胞增殖實驗 ①取對數(shù)生長期的腫瘤細胞,制成細胞懸液。進行細胞計數(shù)后,96孔板中按照實驗分組每孔接種1 0 μL的細胞懸液(每孔2×103個細胞),再加入140 μL的培養(yǎng)液,每組共8個復(fù)孔,放置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~24 h。②96孔板置顯微鏡下觀察,確認細胞貼壁生長且有足夠細胞密度后,根據(jù)分組每孔加入濃度為2×104個/μL血小板懸液40 μL、siRNA與細胞共培養(yǎng)12 h。③培養(yǎng)后每孔加入CCK試劑20 μL,輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng),于添加CCK試劑后0、6、18 h用酶標儀測定450 nm的吸光值。
1.3.6 劃痕實驗 ①取對數(shù)生長期的腫瘤細胞,制成細胞懸液。進行細胞計數(shù)后,6孔板中每孔各接種300 μL的細胞懸液(每孔5×104個細胞),再加入2 mL配制好的培養(yǎng)液,放置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②6孔板置顯微鏡下觀察,確認細胞貼壁生長且有足夠細胞密度后,棄去培養(yǎng)液,使用10 μL無菌槍頭進行劃線。③用PBS溶液洗滌劃線后的各孔,以使劃下的細胞被洗去。洗滌后置于顯微鏡下觀察并拍照記錄(0 h)。④根據(jù)分組每孔加入濃度為2×104個/μL血小板懸液1 mL、siRNA與細胞共培養(yǎng);自接種72 h后于顯微鏡下拍照,使用軟件計算劃痕面積。
1.4 統(tǒng)計分析 圖表繪制使用GraphPad Prism 9.3.1,劃痕實驗面積計算使用ImageJ軟件,結(jié)果分析用SPSS 20.0軟件,檢驗水準為雙側(cè)P<0.05有統(tǒng)計學意義。
2.1 CCK細胞增殖實驗
2.1.1 AGS細胞增殖實驗 AGS細胞在加入CCK試劑并進行溫浴后0、6、18 h的OD值見表1,3組的OD值均值分別從0 h的1.107、1.320、0.639快速增長到18 h的4.281、4.805、2.112。在18 h時未處理組OD值(4.281±1.362)與健康人血小板組OD值(4.805±1.393),無統(tǒng)計學差異(P>0.05);未處理組OD值(4.281±1.362)高于胃腺癌血小板組OD值(2.112±0.473),有統(tǒng)計學差異(P<0.05);健康人血小板組OD值(4.805±1.393)亦明顯高于胃腺癌血小板組;OD值(2.112±0.473),有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
表1 AGS細胞CCK增殖實驗OD值()
表1 AGS細胞CCK增殖實驗OD值()
2.1.2 MKN-45細胞增殖實驗 MKN-45細胞在加入CCK試劑并溫浴后0、6、18 h的OD值見表2。3組的均值分別從0.303、0.397、0.370增長到4.924、4.965、0.988。在18 h時未處理組OD值(4.924±1.102)與健康人血小板組OD值(4.965±1.207)比較變化不大(P>0.05);未處理組與健康人血小板組OD值均明顯高于胃腺癌血小板組OD值,差異有顯著性(P<0.01)。
表2 MKN-45細胞CCK增殖實驗OD值()
表2 MKN-45細胞CCK增殖實驗OD值()
2.2 劃痕實驗
2.2.1 AGS細胞劃痕實驗 AGS細胞劃線培養(yǎng)72 h后AGS細胞的各組細胞劃痕的面積如圖2、圖3和表3所示。未處理組劃痕面積(2.393±0.370)與健康人血小板組(2.748±0.214)無差別(P>0.05);胃腺癌血小板組的劃痕幾乎被AGS細胞遷移覆蓋,其劃痕面積(0.799±0.141)均明顯小于未處理組、健康人血小板組與胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351組的劃痕面積(2.393±0.370、2.748±0.214、2.670±0.387,P<0.01);而胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351組的劃痕面積(2.670±0.387)明顯大于胃腺癌血小板加NCsiRNA組(0.714±0.103,P<0.01)。
表3 AGS細胞各組劃痕面積()
表3 AGS細胞各組劃痕面積()
圖2 AGS細胞各組劃痕
圖3 AGS細胞各組劃痕面積
2.2.2 MKN-45細胞劃痕實驗 細胞劃線培養(yǎng)72 h后MKN-45細胞的各組劃痕的面積如圖4、圖5和表4所示。未處理組劃痕面積(5.742±0.288)與健康人血小板組(6.182±0.106)無差別(P>0.05);胃腺癌血小板組的劃痕大部分被MKN-45遷移,其劃痕面積(1.304±0.288)均明顯小于未處理組、健康人血小板組與胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351組的劃痕面積(5.742±0.288)、(6.182±0.106)、(4.078±0.458),均P<0.01;而胃腺癌血小板加TGFβR1si-RNA351組的劃痕面積(4.078±0.458)明顯大于胃腺癌血小板加NCsiRNA組(1.585±0.749),P<0.01。
表4 MKN-45細胞各組劃痕面積()
表4 MKN-45細胞各組劃痕面積()
圖4 MKN-45細胞各組劃痕
圖5 MKN-45細胞各組劃痕面積
胃腺癌目前仍然是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,但控制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移是尚未解決的一大難題[8-9]。因此,研究胃腺癌細胞增殖與遷移的機制具有重要的價值。本研究為明確血小板源性的TGFβ1是否對胃腺癌細胞的增殖和遷移產(chǎn)生影響,我們選擇了AGS和MKN-45兩株胃腺癌細胞同時進行體外試驗,使用兩株細胞提高了實驗結(jié)果的可靠性[10-12]。
AGS細胞的CCK增殖實驗時我們發(fā)現(xiàn),在加入CCK試劑并進行4 h的孵育后,在進行0 h的第1次吸光度測定時,有加入siRNA和轉(zhuǎn)染劑的兩組(NCsiRNA與TGFβR1siRNA)所測定的吸光度較接近且均低于未處理組和健康人血小板組。但在同樣條件處理下,MKN-45細胞測定的實驗結(jié)果并沒有這種情況,在0 h時,MKN-45細胞的4組實驗所測得的吸光度較為接近,因此,我們推測加入的siRNA或轉(zhuǎn)染試劑對AGS細胞具有毒性作用[13]。另外,本研究發(fā)現(xiàn)AGS細胞的胃腺癌血小板+NCsiRNA組與胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA組之間CCK實驗的OD值沒有差別,證明血小板源性的TGFβ1對胃腺癌細胞的增殖沒有影響?;谝陨?個原因,CCK實驗只比較了未處理組、健康人血小板組與胃腺癌血小板組的結(jié)果。
兩株細胞CCK增殖實驗結(jié)果均表明,未處理組與健康人血小板組兩組細胞的增殖差異較小,提示加入健康人血小板不影響胃腺癌細胞的增殖;兩株細胞和胃腺癌血小板共培養(yǎng)后,隨著培養(yǎng)時間的增加,胃腺癌血小板組的細胞增殖程度明顯低于另外兩組,結(jié)果提示胃腺癌患者的血小板在體外可以抑制胃腺癌細胞的增殖[14]。
AGS細胞和MKN-45細胞的劃痕實驗結(jié)果顯示,劃線72 h后未處理組與健康人血小板組劃痕面積基本相同,匯合度無明顯變化,提示健康人血小板對胃腺癌細胞的遷移無明顯影響。胃腺癌血小板組劃線72 h后劃痕內(nèi)出現(xiàn)大量胃腺癌細胞,劃痕面積明顯小于未處理組與健康人血小板組,此結(jié)果表明胃腺癌患者的血小板在體外可以促進胃腺癌細胞的遷移[15]。
胃腺癌血小板+NCsiRNA組作為利用siRNA進行基因敲減的陰性對照,我們發(fā)現(xiàn)胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA351組的劃痕面積明顯增大,進一步證明了胃腺癌細胞的TGFβR1被siRNA351抑制后,胃腺癌細胞的遷移能力較未抑制前明顯下降。劃痕實驗結(jié)果證明胃腺癌患者血小板源性的TGFβ1在體外促進了胃腺癌細胞的遷移。
Plantureux等[16]于2020年發(fā)表的研究報道通過體內(nèi)動物實驗表明,直腸癌患者的血小板可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖及促進其遷移。我們的實驗結(jié)果與此報道的結(jié)果一致。但由于本實驗為體外細胞實驗,具有一定的局限性。為進一步探討血小板對胃腺癌的影響,我們須完善動物體內(nèi)實驗。