結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變特征及與耐藥水平關(guān)系的研究*

蔣燕成,張建明,陳紫萱,張志珊

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建泉州 362000

結(jié)核病仍然是世界最致命的傳染病殺手之一。每天約有4 100人死于結(jié)核病,有近2.8萬(wàn)人感染這種可預(yù)防且可治愈的疾病。自2000年以來(lái),全球結(jié)核病的防治工作已經(jīng)挽救了約6 600萬(wàn)人的生命。然而,前幾年新型冠狀病毒感染(COVID-19)大流行使多年來(lái)在終止結(jié)核病方面取得的進(jìn)展出現(xiàn)了倒退。2020年,因結(jié)核病死亡的人數(shù)10年來(lái)第一次出現(xiàn)了增加。我國(guó)2020年估算的結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為84.2萬(wàn)(2019年為83.3萬(wàn)),估算結(jié)核病發(fā)病率為59/10萬(wàn)(2019年為58/10萬(wàn)),在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中我國(guó)估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)排第2位(8.5%)[1]。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)及持續(xù)蔓延,已經(jīng)成為有效控制結(jié)核病的嚴(yán)重威脅,因此控制MDR-TB是一個(gè)迫切需要關(guān)注的問(wèn)題。MDR-TB的出現(xiàn)和傳播主要是由于DOTS策略實(shí)施不當(dāng)、抗結(jié)核藥物短缺或質(zhì)量差、患者對(duì)處方方案治療依從性差[2]。世界衛(wèi)生組織建議對(duì)所有疑似結(jié)核病患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療前都應(yīng)進(jìn)行結(jié)核藥敏試驗(yàn),以避免獲得性耐藥的進(jìn)一步產(chǎn)生[3]。本研究對(duì)結(jié)核分枝桿菌(MTB)的耐藥基因變特征,以及其突變特征與耐藥水平相關(guān)性來(lái)進(jìn)行分析,以了解MTB的耐藥機(jī)制,盡早盡快地為臨床感染患者治療提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2021年6月在泉州市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科經(jīng)結(jié)核藥敏試驗(yàn)鑒定為耐利福平、異煙肼的MTB 51株作為研究對(duì)象。

1.2儀器與和試劑 Extractor 36 核酸快速提取儀,晶芯?SlideWasherTM洗干儀,晶芯?微陣列芯片掃描儀及MTB耐藥基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京博奧晶典生物科技有限公司。PCR儀和Sensititre?結(jié)核藥敏板購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。MGIT 7 mL培養(yǎng)管、BACTEC MGIT 960系統(tǒng)、MGIT 960SIRE藥敏試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3方法

1.3.1DNA微陣列芯片法 (1)DNA提取:向核酸提取管中加入50 μL核酸提取液,取混勻的菌液標(biāo)本(以1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葹橐?20 μL加到核酸提取液中。將核酸提取管置于核酸快速提取儀中,最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min。將核酸提取管置于95 ℃水浴鍋或金屬浴中,加熱5 mim。1 000r/min離心1 min,備用。(2)PCR擴(kuò)增:根據(jù)被測(cè)樣品準(zhǔn)備200 μL離心管,并預(yù)先標(biāo)記樣品編號(hào)。從試劑盒中取出PCR擴(kuò)增試劑使其充分融化,輕搖混勻。將PCR擴(kuò)增試劑按每管18 μL分裝于200 μL離心管中,蓋好管蓋。在標(biāo)本制備區(qū)內(nèi)加入模板DNA。模板DNA包括被測(cè)樣品DNA(核酸提取管中的上清液)、陽(yáng)性對(duì)照品或陰性對(duì)照品。對(duì)于1個(gè)樣品,向3管中分別加入同一模板DNA各20 μL。擴(kuò)增條件設(shè)定:37 ℃ 600 s,94 ℃ 600 s,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共10個(gè)循環(huán);72 ℃ 420 s。(3)芯片雜交:將擴(kuò)增好的產(chǎn)物置于擴(kuò)增儀中95 ℃變性5 min,冰浴5 min,取出雜交緩沖液按9 μL雜交緩沖液,相應(yīng)向每管中分別加入同一樣品的PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2各3 μL,PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物3各3 μL。在基因微陣列芯片雜交盒的底部加入200 μL蒸餾水。經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μL雜交反應(yīng)混合物,迅速蓋上雜交盒并密封。立即將密封好的雜交盒水平加入50 ℃預(yù)熱的恒溫水浴鍋中,待雜交盒全部放入后計(jì)時(shí)120 min。雜交反應(yīng)結(jié)束后,將雜交盒水平取出并將芯片取出,再進(jìn)行芯片的洗滌,洗液Ⅰ洗1次,30 ℃,120 s;洗液Ⅱ洗2次,30 ℃,60 s。然后離心機(jī)中離心5 min,甩干。打開(kāi)TBMDRTest軟件預(yù)熱10 min,將芯片放置掃描儀芯片卡槽中,開(kāi)始掃描芯片,進(jìn)行結(jié)果的判讀。

1.3.2最低抑菌濃度(MIC)藥敏試驗(yàn)法 使用Sensititre MYCOTBI MIC法進(jìn)行MIC測(cè)定試驗(yàn)。每個(gè)測(cè)試批次中均包含作為對(duì)照的MTB H37Rv菌株(ATCC 27294)。分別依據(jù)1.0 μg/mL和0.5 μg/mL的臨界水平對(duì)MTB的耐藥性進(jìn)行判讀,其中MIC≥4 μg/mL為高耐藥,MIC<4 μg/mL為低耐藥。

1.3.3比例法 采用藥敏試驗(yàn)對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行4% NaOH/NaCl前處理后接種至液體培養(yǎng)管中,隨后置于MGIT960培養(yǎng)儀中培養(yǎng)。藥敏試驗(yàn)嚴(yán)格按照美國(guó)BD公司MGIT960系統(tǒng)的操作步驟對(duì)其進(jìn)行異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇4種一線抗結(jié)核藥物檢測(cè),培養(yǎng)管內(nèi)藥物終水平分別為0.1、1.0、1.0、5.0 μg/mL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入整理,使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1表型檢測(cè)和MIC測(cè)定結(jié)果 51株耐藥MTB菌株中,有1株耐利福平單耐藥MTB,2株耐異煙肼單耐藥MTB,48株耐利福平、異煙肼耐多藥MTB。通過(guò)對(duì)23株耐多藥MTB菌株進(jìn)行MIC藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):對(duì)利福平而言,MIC>16 μg/mL有21株(91.30%),MIC=16 μg/mL有1株(4.35%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多藥MTB菌株對(duì)利福平耐藥的構(gòu)成比比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.17,P<0.05);對(duì)異煙肼而言,MIC>4 μg/mL有10株(43.48%),MIC=4 μg/mL有7株(30.43%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),MIC=1 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.25 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.12 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多藥MTB菌株對(duì)異煙肼耐藥的構(gòu)成比比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.72,P<0.05)。

2.2DNA微陣列基因芯片法結(jié)果 通過(guò)DNA微陣列芯片法對(duì)48株耐多藥MTB進(jìn)行基因型檢測(cè),結(jié)果顯示:對(duì)利福平rpoB基因而言,有6株為野生型(12.5%),點(diǎn)突變以531(C→T)突變型為主,有30株(62.5%),其余分別為516(A→T)突變型4株(8.3%)、526(C→T)突變型3株(6.3%)、526(C→G)突變型3株(6.3%)、533(T→C)和516(A→T)雙突變1株(2.1%),有1株出現(xiàn)了樣本異常,利福平rpoB基因不同突變型菌株的構(gòu)成比比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.84,P<0.05);對(duì)異煙肼katG、inhA基因而言,有14株野生型(29.2%),點(diǎn)突變以315(G→C)突變型為主,有25株(52.1%),其余分別為315(G→A)突變型3株(6.3%)、-15(C→T)突變型5株(10.4%)、315(G→C)和-15(C→T)雙突變型1株(2.1%),異煙肼katG、inhA基因不同突變型菌株的構(gòu)成比比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.12,P<0.05)。

2.3不同檢測(cè)法方法對(duì)MDR-TB檢測(cè)結(jié)果的比較 通過(guò)比例法、MIC法、基因芯片法對(duì)23例耐多藥MTB進(jìn)行耐藥情況檢測(cè)顯示,3種方法檢測(cè)出的耐藥菌株均以耐利福平、異煙肼同時(shí)耐藥為主,但3種方法耐利福平、異煙肼菌株檢出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.13,P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 比例法、MIC法、基因芯片法對(duì)MDR-TB檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.4利福平耐藥基因突變類型在不同MIC的分布情況 88.9%的531(C→T)突變菌株MIC>16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=2 μg/mL;4株526(C→T)突變型和1株516(A→T)突變型菌株的MIC均>16 μg/mL。見(jiàn)表2。

表2 利福平耐藥基因突變類型與MIC的關(guān)系[n(%)]

2.5異煙肼耐藥基因突變類型在不同MIC的分布情況 66.7%的野生型突變菌株MIC>4 μg/mL,33.3%的野生型突變菌株MIC=0.12 μg/mL;2株315(G→A)突變型菌株MIC=0.25 μg/mL,MIC=1 μg/mL和MIC>4 μg/mL的315(G→A)突變型菌株各1株;MIC≥4 μg/mL的315(G→C)突變菌株12株,1株315(G→C)突變菌株的MIC=1 μg/mL;1株-15(C→T)突變型菌株MIC=2 μg/mL,1株-15(C→T)突變型菌株MIC>4 μg/mL;1株315(G→C)和-15(C→T)雙突變型菌株MIC=4 μg/mL。見(jiàn)表3。

表3 異煙肼耐藥基因突變類型與MIC的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

目前對(duì)于MTB耐藥的檢測(cè)主要有2種方法,其中一種為表型檢測(cè),另外一種為基因型檢測(cè)。對(duì)MTB來(lái)說(shuō),抗生素的臨界水平或“斷點(diǎn)”指的是能夠抑制95%尚未接觸過(guò)任何抗菌藥物(“野生型”)的菌株的最低水平,通常代表最高的MIC,或者是用尚未接觸過(guò)藥物的野生型菌株所獲得的抑制生物體生長(zhǎng)所需的抗生素的濃度。由于發(fā)現(xiàn)耐多藥MTB對(duì)相應(yīng)的藥物有著不同的耐藥程度[4],筆者將收集到的耐多藥MTB進(jìn)行MIC測(cè)定,其目的是分析耐多藥MTB的不同基因突變特征,以及MIC的變化情況。基因芯片技術(shù)由于其靈敏度和效率高,可作為傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一種補(bǔ)充手段,尤其是對(duì)利福平和異煙肼耐藥菌株的檢測(cè),從而有助于在臨床上如何制訂、實(shí)施有針對(duì)性的個(gè)體化治療和用藥方案[5]。比例法是目前大多醫(yī)院在使用的檢測(cè)MTB耐藥性的主要方法,但其檢驗(yàn)周期較長(zhǎng),得到較純的培養(yǎng)物后還需要4周的時(shí)間才能得到結(jié)果,并且其較多的影響因素,煩瑣的操作步驟,易受干擾[6]。

本研究采用Sensititre MYCOTBI MIC法和DNA微陣列基因芯片法與比例法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示MIC法與比例法的符合率為95.7%,這與RICHTERA等[6]關(guān)于MIC法的研究一致。MIC法能較準(zhǔn)確檢測(cè)出一線、二線抗結(jié)核藥物真實(shí)的MIC,且檢測(cè)周期較比例法短,有利于盡早為臨床醫(yī)生提供耐藥情況以便臨床治療。比例法和基因芯片法的符合率為87.0%,這與李丹等[7]關(guān)于基因芯片技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定和耐藥性分析中應(yīng)用的研究一致。DNA微陣列基因芯片法檢驗(yàn)周期短,高速,可靠,有利于耐藥結(jié)核分枝桿菌的早期檢測(cè)。

本研究結(jié)果表明,88.9%的531(C→T)耐利福平突變菌株中MIC>16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突變菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突變菌株MIC=2 μg/mL,4株526(C→T)突變型和1株516(A→T)突變型均MIC>16,但由于所收集到的菌株數(shù)不足,未能發(fā)現(xiàn)密碼子511和533相關(guān)的MIC。有研究表明,密碼子531、516、526是可能導(dǎo)致MTB對(duì)利福平產(chǎn)生高耐藥水平的常見(jiàn)突變類型,511和533密碼子有可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)利福平的低耐藥水平[8]。對(duì)代謝活躍的MTB,利福平具有顯著的殺菌作用。利福平是靶向DNA依賴性RNA聚合酶并抑制該菌轉(zhuǎn)錄的藥物,細(xì)菌RNA聚合酶基因的81堿基對(duì)區(qū)域中的突變r(jià)poB(密碼子507～533)編碼酶的活性位點(diǎn),其對(duì)所有利福平耐藥菌株的比例>95%[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)利福平rpoB基因而言,最常見(jiàn)的突變類型是531(C→T)突變型,其次是516(A→T)、526(C→T)、526(C→G)突變型。有研究顯示,在墨西哥常見(jiàn)的531(C→T)突變型是在RRDR中觀察到的最常見(jiàn)的突變[10]。ZAW等[11]的研究中指出,rpoB 531(C→T)是最常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP),而密碼子526的突變是第2常見(jiàn)的SNP,即使在同一個(gè)國(guó)家,與耐利福平相關(guān)的rpoB基因突變也有很大差異。

耐多藥MTB中在DNA微陣列基因芯片中對(duì)關(guān)于異煙肼耐藥的katG和inhA基因中檢測(cè),katG具有2 223 bp的長(zhǎng)度并且合成參與霉菌酸合成的過(guò)氧化氫酶,katG基因中最普遍的突變是在密碼子315(Ser315→Thr;S315T)處的取代,發(fā)現(xiàn)其在40%～90%的耐異煙肼臨床MTB分離株中發(fā)生,因此被認(rèn)為是可靠的檢測(cè)標(biāo)記[12]。而inhA是FAS-Ⅱ系統(tǒng)的烯?；??；d體蛋白(ACP)還原酶,其催化在與ACP相關(guān)的生長(zhǎng)脂肪酸鏈的第二位雙鍵NADH依賴性還原,由于異煙肼在治療結(jié)核病患者方面的成功,inhA是臨床驗(yàn)證的目標(biāo)[13],試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要的突變類型是315(G→C)突變型,然后是-15(C→T)突變型,其次是315(G→A)突變型,還有部分的315(G→C)和-15(C→T)雙突變型。50%～95%的耐異煙肼株中存在katG基因位點(diǎn)的第315密碼子突變,20%和35%的耐異煙肼株中存在著inhA調(diào)控區(qū)的突變。最常見(jiàn)的inhA突變發(fā)生在C15T位點(diǎn),是在其的啟動(dòng)子區(qū),這一般與耐藥的單抗有關(guān)。inhA編碼區(qū)突變的菌株通常表現(xiàn)為對(duì)異煙肼的低水平耐藥。

本研究結(jié)果顯示,密碼子531、516、526可能是導(dǎo)致MTB對(duì)利福平產(chǎn)生高耐藥性的常見(jiàn)突變類型。katG315與異煙肼的高耐藥性相關(guān),而inhA則較多與異煙肼的低耐藥性相關(guān)。利福平rpoB中最常見(jiàn)的突變類型是531(C→T)突變型,異煙肼中最常見(jiàn)的是katG315(G→C),其次是inhA-15(C→T)。本研究通過(guò)分析耐藥基因突變位點(diǎn)在不同藥物MIC的分布情況,快速獲得耐藥水平,有助于制訂治療方案和闡明耐藥機(jī)制,指導(dǎo)臨床用藥。