外泌體對骨質(zhì)疏松癥調(diào)控機(jī)制及中藥干預(yù)作用

牛建明，馮疆鑫，杜志峰

（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 承德 067000；2.華北理工大學(xué)研究生院，河北 唐山 063210；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)骨傷科，河北 承德 067000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨脆性增加及骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征[1]。一項(xiàng)針對我國大陸成人的研究發(fā)現(xiàn)，在40 歲以上人群中，男性O(shè)P 患病率為5.0%，女性為20.6%；男性椎骨骨折患病率為10.5%，女性為9.7%[2]。隨著人口老齡化問題持續(xù)發(fā)展，預(yù)計(jì)我國OP 患者將繼續(xù)增加，針對OP 的診斷和治療顯得非常緊迫。近年來，外泌體（exosomes，Exos）受到廣泛關(guān)注。最新研究表明[3]，Exos 在包括OP 在內(nèi)的多種生物過程和疾病發(fā)展中起重要作用。Exos 是由細(xì)胞分泌的小囊泡，可以作為納米級載體，通過轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵的蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)（如miRNA，mRNA 和DNA 等）參與骨骼微環(huán)境的調(diào)節(jié)和OP 細(xì)胞間通訊，對OP 的診治有重要意義[4]。與傳統(tǒng)抗OP藥物相比，中藥（Chinese herbal medicines，CHM）在防治OP 方面療效顯著且安全性較高，能有效改善患者癥狀，預(yù)防并發(fā)癥。探討其機(jī)制可能與調(diào)控OP相關(guān)Exos 有關(guān)。本文通過闡述Exos 對OP 的調(diào)控機(jī)制以及CHM 在治療OP 中與Exos 之間的聯(lián)系，希望為OP 的治療提供新的思路和方法。

1 Exos 構(gòu)成及功能

Exos 是一種直徑在30～150 nm 的小囊泡，是細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的亞型，區(qū)別于微囊泡（ectosomes）和凋亡小體（apoptotic body）[5]。幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放Exos。Exos 廣泛存在于唾液、血漿、尿液、腹水、母乳和羊水等體液中[6]。Exos 最早被認(rèn)為是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的“垃圾”，但最近研究發(fā)現(xiàn)，其在人體生理和病理發(fā)展過程中充當(dāng)細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的媒介，可廣泛參與細(xì)胞增值與凋亡調(diào)控、血管生成、免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、代謝調(diào)控等過程[7]。Exos 具有納米球膜型脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、mRNA 和miRNA 等物質(zhì)[8]。不同Exos 所包含的內(nèi)容物不同，其內(nèi)容物可以反映源細(xì)胞的狀態(tài)，因此可以通過檢測其內(nèi)容物含量作為診斷疾病的生物標(biāo)志物[9]。同時(shí)，研究表明[10]，Exos 還具有低免疫原性、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高、可穿越屏障等獨(dú)特優(yōu)勢，可作為遞送藥物的天然載體。正因?yàn)镋xos 有上述特征和優(yōu)勢，越來越多的研究將目光聚集在Exos 對OP 的診治和藥物遞送的潛力中。

2 Exos 對OP 的調(diào)控機(jī)制

OP 的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制為骨穩(wěn)態(tài)遭到破壞。骨穩(wěn)態(tài)即成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）介導(dǎo)的骨吸收不斷作用于骨骼以維持身體骨量的平衡[11]。在此過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、OB、OC 及其他細(xì)胞因子等相互影響、相互調(diào)節(jié)，共同維持骨穩(wěn)態(tài)[12]。Exos 作為細(xì)胞間信息的傳遞者，能促進(jìn)OP 發(fā)病過程中多種相關(guān)細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的轉(zhuǎn)移，這在OP的診斷和治療中起關(guān)鍵作用[13]。

2.1 Exos 與MSCs MSCs 具有自我更新及多向分化的潛能，可分化為OB、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，在維持骨穩(wěn)態(tài)方面有著重要作用[14]。作為細(xì)胞間通訊的信使，Exos 是參與旁分泌的重要介質(zhì)，用于調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞過程。有研究表明[15]，OB 來源Exos（osteoblasts-derived exosomes，OB-Exos）可以通過增強(qiáng)MSCs 中的成骨基因表達(dá)來增加成骨分化，建立骨形成的正反饋。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）主要分化為OB 和軟骨細(xì)胞。Li Z 等[16]研究表明，M2 巨噬細(xì)胞衍生的Exos（M2D-Exos）可以通過miR-690/IRS-1/TAZ 軸促進(jìn)BMSCs 成骨分化并減少脂肪生成。同樣，Xiong Y 等[17]通過研究M2D-ExosmiRNA 對BMSCs 分化的影響，發(fā)現(xiàn)miR-5106 在M2D-Exos 中高度富集，并且可以轉(zhuǎn)移到BMSCs 中，通過靶向SIK2 和SIK3 基因以誘導(dǎo)體外和體內(nèi)OB 分化。

由以上研究可知，Exos 可通過不同機(jī)制參與調(diào)控MSCs 的分化過程并影響其分化結(jié)果，進(jìn)而影響骨穩(wěn)態(tài)的變化，這可能是治療OP 的潛在方法。

2.2 Exos 與OB 骨骼中大約4%～6%的常駐細(xì)胞是OB，這對骨骼的生長和維持至關(guān)重要。此外，OB 主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，在骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[18]。Exos 可以通過調(diào)節(jié)OB 的增殖和活性來影響骨穩(wěn)態(tài)。不同細(xì)胞衍生的Exos 可能對OB 產(chǎn)生不同的影響。Qiu M 等[19]通過研究證實(shí)BMSCs來源的Exos（BMSCs-Exos）miR-150-3p 可以通過調(diào)節(jié)成骨因子Runx2、Osterix、ALP 和骨鈣素（osteocalcin）等的表達(dá)，進(jìn)而刺激OB 的增殖和分化。Chen J等[20]發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）小鼠模型中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞衍生的Exos（RA-FLSs-Exos）可以被OB 吞噬，并通過上調(diào)miR-486-5p 和靶向Tob1 來激活成骨相關(guān)的信號通路以促進(jìn)成骨分化。除了促進(jìn)作用，Exos 對OB 活性也存在抑制作用。Li D 等[21]發(fā)現(xiàn)OC 來源的Exos（osteoclast-derived exosomes，OC-Exos）miR-214-3p 被轉(zhuǎn)移到OB 中，以抑制OB 活性并減少骨形成，抑制OC-Exos 中miR-214-3p 的水平可能是治療涉及骨形成減少的骨骼疾病的策略。

2.3 Exos 與OC OC 是來源于單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系造血祖細(xì)胞的多核細(xì)胞，是唯一參與生物體中骨組織破壞和再吸收的細(xì)胞類型[22]。OC 可以通過吞噬作用吸收Exos，并受Exos 攜帶的各種內(nèi)容物的影響。Guo L 等[23]證明乳腺癌細(xì)胞來源Exos miR-20a-5p通過靶向SRCIN1 促進(jìn)OC 的增殖和分化。RANKL是OC 分化所必需的生長因子。最近的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，OB 釋放的含RANKL 的Exos 可以靶向OC 并刺激OC 形成[24]。Xiao F 等[25]通過研究證明，來自周期性機(jī)械拉伸（cyclic mechanical stretch，CMS）處理的BMSCs 來源外泌體（CMS-Exos）通過抑制RANKL誘導(dǎo)的nuclear factor kappa-B（NF-κB）信號通路來抑制OC 分化，并在體內(nèi)HU 小鼠模型中改善了由去應(yīng)力負(fù)荷引起的OP 癥狀。Song H 等[26]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生Exos（EC-Exos）可以被骨髓衍生的巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMM）內(nèi)化并改變BMM 的形態(tài)。外泌體miRNA 的測序結(jié)果顯示miR-155 在EC-Exos 處理的BMM 中高度表達(dá)。阻斷BMM miR-155 水平能夠解除EC-Exos 對OC 的抑制，證實(shí)Exos miR-155 可能具有抗OP 的治療潛力。

綜上所述，不同細(xì)胞來源Exos 可以通過不同機(jī)制和信號通路調(diào)控MSCs、OB、OC 等細(xì)胞的增殖、分化和成熟，從而促進(jìn)或抑制骨形成和骨吸收，在骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用，通過Exos 治療OP 擁有廣闊前景。此外，Exos 內(nèi)容物可以反映出源細(xì)胞及其微環(huán)境的狀態(tài)[27]，因此可以將Exos 用作OP 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。如Zhang Y 等[28]通過研究證明，與對照組相比，OP 組中血漿Exos tRF-25-R9ODMJ6B26（tRF-25），tRF -38 -QB1MK8YUBS68BFD2（tRF-38），tRF-18-BS68BFD2（tRF-18）的表達(dá)較高，提示血漿Exos 中tRF-25，tRF-38 和tRF-18 可能作為診斷OP 新的血清學(xué)生物標(biāo)志物。還有研究發(fā)現(xiàn)[29]，過度表達(dá)miR-424-5p 的Exos 可以通過WIF1/Wnt/β-catenin軸減弱成骨分化，這表明miR-424-5p 可能作為治療OP 的新生物標(biāo)志物。雖然目前將Exos 用作OP生物標(biāo)志物的研究技術(shù)不完善且研究數(shù)量相對缺乏，但Exos 的特征決定了它們適合作為疾病診治的生物標(biāo)志物，將Exos 作為OP 診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物具有很高的研究價(jià)值。

3 CHM 干預(yù)Exos 治療OP

CHM 治療在我國防治疾病、保障人民健康中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)代研究表明[30]，多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用模式是CHM 防病治病的特色優(yōu)勢，尤其在治療OP 等復(fù)雜性疾病方面有獨(dú)特療效。在CHM 治療的發(fā)展過程中，使用單一CHM 是原始治療形式，CHM 配方通過在單一CHM 中加入一種或多種CHM 逐漸發(fā)展完善。隨著藥理學(xué)的進(jìn)步，針對CHM 生物活性成分的研究越來越受到重視，無論哪種CHM 治療方式都有其獨(dú)特優(yōu)勢。近年來，CHM 干預(yù)Exos 治療OP 的研究不斷出現(xiàn)，從微觀的角度證明CHM 對OP 的治療與Exos 有明確聯(lián)系。此外，Exos 作為藥物載體，具有低免疫原性，高穩(wěn)定性、高靶向性等優(yōu)勢，能有效彌補(bǔ)CHM 溶解度低、藥物活性穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。通過Exos 將CHM 有效成分精確輸送至靶細(xì)胞，發(fā)揮更高效的作用，對于OP 的治療具有重大意義。

3.1 淫羊藿苷 淫羊藿苷（Icaritin，ICA）是淫羊藿的主要活性成分，具有補(bǔ)腎壯陽、促進(jìn)骨代謝等功效。楊傲飛[31]通過研究發(fā)現(xiàn)，ICA 可以通過調(diào)控miR-122-5p 對BMSCs 的成骨分化、遷移發(fā)生起促進(jìn)作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，OB-Exos 的作用靶點(diǎn)為miR-122-5p，OB-Exos 聯(lián)合ICA 對BMSCs 的成骨分化、遷移發(fā)生具有更明顯的促進(jìn)作用。此外，ICA 還可以將Exos作為載體對骨穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)控。Dong M 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用ICA 相比，使用胎牛血清（FBS）Exos攜帶ICA（FBS Exo-Ica）在促進(jìn)OB 的增殖和骨再生方面具有更高效的作用，對改善OP 有指導(dǎo)意義。

3.2 牛膝醇提物 牛膝醇提物是牛膝有效成分的濃縮物，具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的功能。Exos 可以調(diào)節(jié)BMSCs 的成骨分化能力。馬篤軍等[33]用牛膝醇提物含藥血清培養(yǎng)BMSCs-Exos 對OA 模型兔進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其對OA 模型兔關(guān)節(jié)局部骨組織超微結(jié)構(gòu)的影響表現(xiàn)在對骨小梁的形態(tài)進(jìn)行了重建，并且顯著提高了骨量。此外通過干預(yù)NLRP3/Caspase-1/Toll4/NF-κB 這一炎癥通路，改善了OA 模型兔的炎癥狀態(tài)，從而降低了軟骨細(xì)胞凋亡及減緩軟骨退變。

3.3 異補(bǔ)骨脂素 補(bǔ)骨脂具有抗OP 的作用，其中有效成分異補(bǔ)骨脂素（Isopsoralen，IP）可加快骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨形成。王劍等[34]通過研究中藥干預(yù)后的骨代謝相關(guān)細(xì)胞外泌體變化以及對成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)IP 干預(yù)后BMSCs-Exos 調(diào)控MC3T3-E1 成骨分化現(xiàn)象顯著，尤其可加快成骨分化相關(guān)基因ALP、OPG、BMP2 的表達(dá)，對OP 的治療具有推動作用。

3.4 龜鹿二仙膠 龜鹿二仙膠為補(bǔ)腎名方，具有滋陰填精，益氣壯陽之功效，可有效緩解OP 患者的癥狀。Exos 可以包裹并傳遞信號分子，是OB-OC 間交互的主要中介因素。司譽(yù)豪[35]發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠可通過OB-Exos 在動物體的細(xì)胞水平上發(fā)揮抗OP 作用，其機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β/Smads 信號通路中Smad3 與TGF-β 以及抑制RANK/RANKL/OPG 中NFATc1 等轉(zhuǎn)錄和破骨特異因子有關(guān)，繼而雙向平衡OB-OC 之間的耦聯(lián)，改善骨代謝、微觀結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能。

3.5 溫腎通絡(luò)止痛方 溫腎通絡(luò)止痛方可改善骨、脂代謝，延緩OP 進(jìn)程。王禮寧[36]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞（Adipocyte）來源Exos 可通過其攜帶的效應(yīng)miRNA-122-5p 調(diào)控SPRY2 介導(dǎo)的MAPK 信號通路，進(jìn)而影響骨髓內(nèi)BMSCs 的成骨與成脂分化，最終調(diào)節(jié)骨脂平衡。而溫腎通絡(luò)止痛方可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌Exos，并通過上述過程發(fā)揮抗OP 效應(yīng)。

4 總結(jié)與展望

Exos 作為細(xì)胞間通訊的重要信息載體，在OP發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。Exos 因其內(nèi)容物與源細(xì)胞息息相關(guān)，其既可以作為OP 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，也可以對OP 過程進(jìn)行調(diào)控。但不同Exos對骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控具有雙向作用，其具體促進(jìn)還是抑制OP 發(fā)展仍需要行進(jìn)一步探索。CHM 在我國已經(jīng)應(yīng)用數(shù)千年，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，CHM 可通過多途徑、多靶點(diǎn)對骨穩(wěn)態(tài)相關(guān)靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，在治療OP 方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。無論是CHM 干預(yù)Exos的調(diào)控作用還是將Exos 作為CHM 載體，二者聯(lián)合將在OP 的治療領(lǐng)域大有可為。不過目前CHM 干預(yù)Exos 防治OP 的研究仍處于初始階段，需要更深入的了解Exos 在OP 過程中的作用機(jī)制及其對CHM有效成分的加載機(jī)制，以便發(fā)揮更大作用。不過可以預(yù)見的是，以CHM 為突破點(diǎn)，通過Exos 診治OP作為新的醫(yī)學(xué)方式，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，未來可能成為OP 的現(xiàn)實(shí)臨床療法。