基于生物信息學分析UBE2C與乳腺癌患者預后及免疫治療反應的關(guān)系

應俊 王衛(wèi)忠 趙釗 呂火烊

2022年發(fā)布的全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達287萬，已經(jīng)成為全球第一大癌癥[1]。在中國女性中，乳腺癌死亡人數(shù)排在癌癥第4位，而在美國乳腺癌死亡人數(shù)已經(jīng)攀升至第2位[2]。隨著乳腺癌發(fā)病率和死亡率不斷提升，乳腺癌防治日益得到各個國家的重視。近年來，免疫治療在癌癥治療領(lǐng)域中開展得如火如荼，已成為治療乳腺癌在內(nèi)多種癌癥的有效方法[3-5]。然而，由于腫瘤異質(zhì)性及微環(huán)境的影響，只有部分患者能從免疫治療中獲益。因此，尋找乳腺癌特定的免疫相關(guān)生物標志物并發(fā)現(xiàn)新的免疫治療靶點，在個體化免疫治療方案選擇、改善患者預后等方面具有重要意義。

泛素結(jié)合酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C）作為泛素偶聯(lián)酶E2家族成員，在泛素化依賴性蛋白水解中發(fā)揮重要作用，進而參與了包括細胞周期、信號轉(zhuǎn)導和分化在內(nèi)的多種細胞進程[6]。研究顯示，UBE2C在乳腺癌組織中呈高表達，抑制UBE2C的表達能夠抑制乳腺癌細胞的生長[7]。UBE2C與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，UBE2C過表達可能通過促進耐藥相關(guān)基因的表達，使乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥性增加[8]。而且，UBE2C與乳腺癌的病理分級和復發(fā)等密切相關(guān)，在乳腺癌的早期診斷以及預后評估方面都具有重要的臨床意義[9]?？傊?，UBE2C在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但UBE2C與乳腺癌的腫瘤微環(huán)境及免疫治療之間關(guān)系的研究較少，是否可以作為乳腺癌的免疫治療相關(guān)標志物還有待進一步的研究。本研究采用癌癥基因組圖譜（The Can‐cer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫綜合分析UBE2C在乳腺癌中的表達及其與患者預后的關(guān)系，探討其與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤的關(guān)系，以闡明UBE2C在乳腺癌免疫治療中的作用。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)提取、差異及生存分析從TCGA中提取1 066例乳腺癌組織及112例癌旁正常乳腺組織的mRNA表達數(shù)據(jù)和臨床病理特征，患者年齡45～71歲，男12例，女1 054例。對數(shù)據(jù)預處理后，提取UBE2C的表達數(shù)據(jù)，比較乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織之間UBE2C表達水平的差異。按照UBE2C的表達水平將乳腺癌患者分為UBE2C高表達組533例與UBE2C低表達組533例，利用R包“survival”比較兩組乳腺癌患者總生存期（overall survival，OS）的差異。

1.2 UBE2C共表達基因分析及UBE2C高低表達組間差異基因篩選通過Pearson相關(guān)進行基因共表達分析，篩選標準為r＞0.6且P＜0.001，并對共表達結(jié)果進行可視化。采用Wilcoxon秩和檢驗比較UBE2C高表達組與低表達組之間的差異基因，篩選錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05且兩組間樣本表達水平比值的對數(shù)絕對值（|log2Fold change|，|log2FC|）＞1的基因作為差異基因，并進行可視化。

1.3 差異基因的功能注釋和富集分析利用R包“clusterProfiler”對UBE2C高表達組與低表達組間的差異基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，以探索差異基因的生物學功能及主要富集的信號通路，從通路來了解UBE2C在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能。

1.4 免疫細胞浸潤分析利用R包“CIBERSORT”計算每個腫瘤樣本中免疫細胞的豐度，評估免疫細胞浸潤水平，比較UBE2C高表達組與低表達組間免疫細胞浸潤的差異。

1.5 UBE2C表達與腫瘤突變負荷（tumor mutation bur‐den，TMB）、免疫檢查點基因的相關(guān)性分析使用R包“maftools”計算乳腺癌每個樣本中每百萬堿基中的腫瘤突變數(shù)得到TMB。通過Spearman秩相關(guān)分析UBE2C與TMB、文獻檢索所得常見免疫檢查點基因的關(guān)系。

1.6 UBE2C表達與乳腺癌免疫治療反應的相關(guān)性分析通過癌癥免疫組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Immu‐nome Atlas，TCIA）下載乳腺癌免疫組數(shù)據(jù)，量化腫瘤免疫原性和分析腫瘤免疫景觀來預測乳腺癌的免疫治療反應，通過數(shù)據(jù)庫中患者的免疫治療得分（immu‐nophenoscore，IPS）可以預測患者對細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）及程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）抑制劑為代表的免疫治療反應差異。使用Wilcoxon秩和檢驗比較UBE2C高表達組與低表達組乳腺癌患者間IPS的差異。

1.7 外部數(shù)據(jù)驗證UBE2C在乳腺癌中的作用使用TNM plot網(wǎng)絡(luò)工具（https://tnmplot.com）中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)驗證UBE2C在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的差異。使用Kaplan-Meier Plotter在線工具（https://kmplot.com/analysis/）中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)評估UBE2C對乳腺癌患者生存的影響。利用蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas，HPA）提供的免疫組化信息，在蛋白水平驗證UBE2C在乳腺癌組織及正常乳腺組織中表達水平的差異。

1.8 統(tǒng)計學處理采用R 4.0.3統(tǒng)計軟件。乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織間UBE2C的表達差異采用兩獨立樣本t檢驗。UBE2C高表達組與UBE2C低表達組之間的差異基因篩選及免疫治療反應的差異采用Wilcoxon秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用對數(shù)秩和檢驗比較組間OS的差異。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)或Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中UBE2C表達及預后分析通過比較TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2C在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的表達發(fā)現(xiàn)，UBE2C在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常乳腺組織（P＜0.01），見圖1A。UBE2C高表達組患者的OS明顯短于低表達組患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 乳腺癌中UBE2C表達及預后分析（A：乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中UBE2C表達差異，aP＜0.05；B：乳腺癌患者UBE2C高低表達組生存曲線的比較）

2.2 乳腺癌中UBE2C的功能分析共表達分析篩選出了乳腺癌中與UBE2C相關(guān)的基因，與UBE2C呈正相關(guān)的前6個基因分別為BIRC5、AURKB、TPX2、PTTG1、MYBL2、TROAP，與UBE2C呈負相關(guān)的前5個基因分別為CRY2、CYBRD1、KIF13B、NOSTRIN、WBP1L，見圖2A（插頁）。

圖2 乳腺癌中UBE2C的功能分析（A：乳腺癌中UBE2C共表達基因；B：UBE2C高低表達組差異基因熱圖；C：差異基因GO分析；D：差異基因KEGG信號通路富集分析）

通過差異分析，UBE2C高表達組與低表達組間共篩選得到2 691個差異基因，其中1 478個基因的表達量在UBE2C高表達組中較UBE2C低表達組低，1 213個基因的表達水平在UBE2C高表達組中較UBE2C低表達組高，UBE2C高低表達組間上下調(diào)差異最明顯的前50個基因熱圖見圖2B（插頁）。并對得到的2 691個差異基因進行GO、KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因可能在細胞的增殖、分裂和細胞因子活性及趨化因子活性中發(fā)揮重要作用，見圖2C（插頁）。KEGG信號通路主要富集在細胞因子相關(guān)的信號通路及IL-17相關(guān)信號通路，見圖2D（插頁）。

2.3 乳腺癌中UBE2C與免疫細胞浸潤、TMB、免疫檢查點相關(guān)性分析免疫細胞浸潤分析發(fā)現(xiàn)，UBE2C高表達組中幼稚B細胞、靜止的CD4記憶T細胞、單核細胞、M2巨噬細胞、靜止的樹突狀細胞、靜止的肥大細胞的浸潤水平均明顯低于UBE2C低表達組，而活化的CD4記憶T細胞、T濾泡輔助細胞、T調(diào)節(jié)細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞的浸潤水平均明顯高于UBE2C低表達組（均P＜0.01），見圖3A（插頁）；UBE2C與免疫細胞的相關(guān)性分析見圖3B（插頁），UBE2C與M1巨噬細胞等免疫細胞呈正相關(guān)，與M2巨噬細胞等免疫細胞呈負相關(guān)。乳腺癌中UBE2C的表達與TMB呈正相關(guān)，見圖3C（插頁）。免疫檢查點相關(guān)性分析見圖3D（插頁），UBE2C與CTLA-4、LAG3和IDO1等免疫檢查點呈正相關(guān)，與NRP1、CD220等基因呈負相關(guān)。

圖3 乳腺癌中UBE2C與免疫功能相關(guān)性分析（A：UBE2C高低表達組中浸潤免疫細胞差異柱狀圖，aP＜0.01；B：UBE2C與腫瘤微環(huán)境中浸潤免疫細胞的相關(guān)性棒棒糖圖；C：UBE2C與TMB相關(guān)性的散點圖；D：UBE2C與免疫檢查點相關(guān)性熱圖）

2.4 乳腺癌中UBE2C與免疫治療反應相關(guān)性分析UBE2C高表達組對單獨抗PD-1、抗CTLA-4的免疫治療反應較UBE2C低表達組敏感，并且抗PD-1和抗CTLA-4的聯(lián)合治療顯著改善了抗PD-1和抗CTLA-4單獨治療的治療反應，見圖4。

圖4 乳腺癌UBE2C高低表達組免疫治療反應差異（A：UBE2C高低表達組間CTLA-4負反應和PD-1負反應的IPS差異分析；B：UBE2C高低表達組間CTLA-4負反應和PD-1正反應的IPS差異分析；C：UBE2C高低表達組間CTLA-4正反應和PD-1負反應的IPS差異分析；D：UBE2C高低表達組間CTLA-4正反應和PD-1正反應的IPS差異分析）

2.5 乳腺癌芯片數(shù)據(jù)與免疫組化驗證UBE2C在乳腺癌組織中的作用乳腺癌芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果與TCGA的乳腺癌測序分析結(jié)果一致，UBE2C在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，并且UBE2C基因高表達組患者的OS明顯短于低表達組患者。通過HPA數(shù)據(jù)庫分析UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺組織與乳腺癌組織中表達水平的差異，與TCGA的UBE2C mRNA的表達水平一致，乳腺癌組織中UBE2C的表達水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，見圖5（插頁）。

圖5 乳腺癌芯片數(shù)據(jù)與免疫組化驗證UBE2C在乳腺癌組織中的作用（A：TNM plot中的芯片數(shù)據(jù)研究乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中UBE2C的表達差異；B：Kaplan-Meier Plotter中的芯片數(shù)據(jù)研究UBE2C在乳腺癌中的生存分析；C：UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺組織中的表達，免疫組化染色，×40；D：UBE2C蛋白在乳腺癌組織中的表達，免疫組化染色，×40）

3 討論

泛素化是細胞內(nèi)靶蛋白降解的重要機制，對調(diào)控細胞周期、細胞程序性死亡、轉(zhuǎn)錄及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用［10］。UBE2C是泛素－蛋白酶體通路中的重要組成部分，在與腫瘤抑制基因和癌基因編碼的蛋白降解有關(guān)的泛素蛋白酶途徑中起著關(guān)鍵性作用。研究表明，在乳腺癌中UBE2C呈現(xiàn)高表達，導致癌癥中的染色體錯誤分離和不受控制的細胞周期[11-12]。本研究通過生物信息學方法評估了TCGA數(shù)據(jù)庫乳腺癌中的UBE2C表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常乳腺組織相比，乳腺癌中的UBE2C表達水平明顯增加，并且TNM plot中的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)與HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果與TCGA測序數(shù)據(jù)一致。這些結(jié)果表明，UBE2C表達水平可作為乳腺癌的潛在診斷指標。為了確認UBE2C是否可以用作預后生物標志物，筆者通過TCGA乳腺癌測序數(shù)據(jù)與Kaplan-Meier Plot‐ter數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)分析了UBE2C表達與OS之間的關(guān)系。分析結(jié)果表明，較高的UBE2C表達與乳腺癌較差的OS相關(guān)，表明UBE2C在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的重要性。通過對UBE2C共表達基因及UBE2C高低表達組差異基因分析，發(fā)現(xiàn)UBE2C高低表達組之間的基因表達存在顯著差異，而且與UBE2C相關(guān)的差異基因主要富集在細胞因子相關(guān)信號通路等免疫通路上，提示UBE2C可能在乳腺癌的免疫反應中發(fā)揮重要作用，可作為乳腺癌免疫治療潛在的生物標志物。

乳腺癌的腫瘤微環(huán)境包括免疫細胞、成纖維細胞、炎性細胞和細胞外基質(zhì)[13]。腫瘤微環(huán)境內(nèi)浸潤的免疫細胞不但影響腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，還在腫瘤免疫治療反應中起著重要作用[14-15]。通過免疫細胞浸潤分析，結(jié)果證實了UBE2C基因與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的相關(guān)性。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細胞，巨噬細胞可以極化為兩種類型：M1和M2。M1型巨噬細胞可以通過吞噬作用及介導Th1應答來殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長；而M2型巨噬細胞則通過產(chǎn)生細胞因子及介導Th2應答，促進組織修復、血管形成、產(chǎn)生免疫抑制，進一步助長了腫瘤的演進[16-17]。筆者通過免疫細胞浸潤分析發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達組中發(fā)揮免疫抑制及促腫瘤作用的M2巨噬細胞明顯降低，而抑制腫瘤進展的M1巨噬細胞明顯增加，表明UBE2C可能通過影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)的M1/M2巨噬細胞比例在乳腺癌發(fā)生和進展中發(fā)揮作用。然而，需要進一步的實驗來揭示UBE2C調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞浸潤的潛在機制。

近年來，乳腺癌的免疫治療取得了巨大進步，但缺乏能夠精準預測免疫治療療效生物標志物[18]。因此，需要進一步加強基礎(chǔ)和臨床研究，以提高免疫治療的療效，并找到能夠預測免疫治療反應的生物標志物，以達到“個體化”的免疫治療效果。UBE2C基因的表達或拷貝數(shù)變化會影響腫瘤微環(huán)境，可能在腫瘤的免疫應答中發(fā)揮重要作用。為了探索UBE2C預測乳腺癌患者免疫治療反應的可能性，筆者評估了UBE2C與免疫檢查點基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UBE2C與多個免疫檢查點基因的表達具有相關(guān)性，可能在乳腺癌免疫治療中發(fā)揮重要作用。TMB是指每百萬堿基中被檢出發(fā)生體細胞突變的總數(shù)。由于腫瘤體細胞突變而產(chǎn)生的新抗原，能誘導機體的抗腫瘤免疫反應。TMB是一種新興的預測免疫治療效果的指標。TMB高的患者在體內(nèi)產(chǎn)生大量的抗原，對免疫治療具有更大的臨床益處。有研究指出，在高TMB的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，免疫治療反應性更好，但是難以定義的TMB界值是限制相關(guān)研究推進的因素之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中UBE2C的表達與TMB呈正相關(guān)，表明UBE2C基因與乳腺癌免疫治療之間的相關(guān)性。免疫治療反應預測分析發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達組對免疫檢查點抑制劑抗PD-1和抗CTLA-4的治療反應較UBE2C低表達患者更加敏感，表明UBE2C在乳腺癌的免疫治療中起著重要作用，顯示了UBE2C在預測乳腺癌免疫治療反應方面的潛力。

綜上所述，通過綜合生物信息學分析，本研究發(fā)現(xiàn)UBE2C可以作為乳腺癌的潛在預后標志物，并且可以用來評估乳腺癌患者的免疫狀態(tài)，可以根據(jù)UBE2C的表達對患者進行分層，在治療前預測免疫治療的有效性，以此為依據(jù)選擇個體化的免疫治療方案。