富血小板纖維蛋白滲出液對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化及納米羥基磷灰石支架生物相容性的影響

李志鵬 葉眉 李崢 吳剛 張晨 王麗雯 陳辰

[摘要]目的：觀察Beagle犬脂肪干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化過程中富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）滲出液的作用，及其與支架材料納米羥基磷灰石支架生物相容性的實(shí)驗(yàn)研究。方法：酶消化法獲得Beagle犬脂肪干細(xì)胞，將收集的富血小板纖維蛋白滲出液分為成骨誘導(dǎo)礦化液組（含成骨礦化液+5% PRF滲出液）、B組對(duì)照組（含成骨礦化液的10% FBS的DMEM）和C組空白組（普通10% FBS的DMEM培養(yǎng)液），觀察PRF滲出液對(duì)成骨的影響，并用環(huán)境掃描電鏡觀察Beagle犬脂肪干細(xì)胞與經(jīng)PRF滲出液孵育的納米羥基磷灰石支架復(fù)合培養(yǎng)后的附著增殖情況。結(jié)果：在PRF滲出液的作用下，脂肪干細(xì)胞能夠更加有效地向成骨細(xì)胞分化，形成更多的鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)細(xì)小致密。環(huán)境掃描電鏡觀察，脂肪干細(xì)胞能在支架上充分地附著伸展。結(jié)論：PRF滲出液能夠有效促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，納米羥基磷灰石三維支架材料具有很好的生物相容性。

[關(guān)鍵詞]富血小板纖維蛋白滲出液；脂肪干細(xì)胞；成骨分化；牙周組織工程；納米羥基磷灰石

[中圖分類號(hào)]R318.08? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）07-0074-04

Effects of Platelet-Rich Fibrin and Nano-hydroxyapatite/Collagen Scaffold on the Differentiaion of Beagle Adipose-derived Stem Cells， ADSCs into Osteoblastsin Invitro

LI Zhipeng1，YE Mei1，LI Zheng1，WU Gang2，ZHANG Chen3，WANG Liwen4，CHEN Chen4

（1.Department of Stomatology，Anhui No.2 Provincial People's Hospital，Hefei 230041，Anhui，China; 2.Department of Clinical Medicine，Shanghai Smartee Denti-Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China; 3.Department of Stomatology，Anhui Medical College，Hefei 230601，Anhui，China; 4.Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of USTC，Division of Life Sciences and Medicine，University of Science and Technology of China，Hefei 230036，Anhui，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect ofplatelet-rich fibrin extract （PRFe） on the diffentiation of Beagleadiposederivedstemcellsintoosteoblast， and to study the biocompatibility with nano-hydroxyapatite scaffolds. Methods? Beagle ADSCs were obtained by enzyme digestion method. Platelette-rich fibrin exudate collected were divided into osteogenic induced mineralization solution group （containing osteogenic mineralization solution+5% PRFe）， control group B （DMEM containing 10% FBS of osteogenic mineralization solution） and blank group C （DMEM medium of normal 10% FBS）. The effect of PRF exudate on osteogenesis was observed， and the attachment proliferation of Beagle dog adipose stem cells and nano-hydroxyapatite scaffold incubated by PRFe were observed by environmental scanning electron microscopy. Results? Under the action of PRF exudate， adipose stem cells can differentiate more efficiently into osteoblasts， more calcified nodules form， and the nodules are small and dense.Environmental scanning electron microscope observation，adipose stem cells can be fully attached and extended on the scaffold. Conclusion? PRFe can effectively promote the differentiation of adipose stem cells into osteoblasts， and nano-hydroxyapatite three-dimensional scaffold material has good biocompatibility.

Key words： platelet-rich fibrin exudate; adipose-derived stem cells; osteoblasts; periodontal tissue regeneration; nano-hap/collagen

牙周組織工程是將體外培養(yǎng)的高濃度、功能相關(guān)的組織細(xì)胞種植于具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維支架載體上，再將此復(fù)合物植于牙槽骨的缺損處，誘導(dǎo)牙周組織的修復(fù)重建。富血小板纖維蛋白是高濃度的血漿提取物，通過其富含的多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)種子細(xì)胞向組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化，吸引與促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)的物質(zhì)聚集和分化的作用[1]。本研究旨在研究Beagle犬脂肪干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化過程中富血小板纖維蛋白滲出液的作用及與支架材料—納米羥基磷灰石/膠原（nano-Hap/Collagen，nHAC）的生物相容性，并觀察脂肪干細(xì)胞-PRFe-納米羥基磷灰石/膠原模式在牙周組織再生中的應(yīng)用潛能。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：健康純種雄性1歲Beagle犬3只（購(gòu)于安徽省阜陽市微光實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），DMEM培養(yǎng)基（Hylcone，美國(guó)）；納米羥基磷灰石膠原（南京埃普瑞公司）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；I型膠原酶（Sigma，美國(guó)）、CD44，CD29（ABZOOM，USA）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、VitC，SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（上海生工生物）、細(xì)胞培養(yǎng)箱、Von Kossa染色試劑盒（南京杰美生物技術(shù)有限公司）；熒光倒置顯微鏡（ZEISS，德國(guó)）；平底6孔培養(yǎng)板、平底12孔培養(yǎng)板、平底96孔培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)）；掃描電鏡（Hitachi，日本）。

1.2 Beagle犬脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 Beagle犬脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取Beagle犬腹股溝處脂肪10 ml，剪除脂肪組織中明顯的血管，充分洗滌，加入等體積新鮮配制的1 g/LⅠ型膠原酶，37℃振蕩消化30 min，再加入等體積的DMEM培養(yǎng)液（1%青霉素G、1%鏈霉素）中和，200目篩網(wǎng)過濾后離心（1 000 rpm，5 min）。棄上清且培養(yǎng)液重懸，移至培養(yǎng)瓶中，在37℃，5% CO2的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞貼壁首次換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%，胰酶消化傳代或凍存。

1.2.2 Beagle犬脂肪干細(xì)胞的鑒定：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代Beagle犬ADSC以1×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種在放有載玻片的6孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底70%～80%后取出載玻片，體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定20 min，按照SP試劑盒的步驟進(jìn)行CD29、CD44免疫組織化學(xué)染色。

1.3 PRF滲出液的制備：取Beagle犬的靜脈血各40 ml，采用離心法制備PRF。以3 000 r/min離心10 min可見3層分層，上層為位于底層的紅細(xì)胞碎片和位于頂層的淡黃色澄清液體血小板血漿，中層為淡黃色半透明的PRF凝膠層，下層為紅細(xì)胞碎片層。將采血管上層的血漿層棄去，使用剪刀分離中間層纖維蛋白凝塊和下層底部的紅血細(xì)胞層，獲得初級(jí)的PRF凝膠，然后將PRF凝膠塊置于無菌離心管中，-80℃冰凍1 h，4℃解凍230 g離心10 min，取上清液即為PRF滲出液。

1.4 PRF滲出液對(duì)Beagle犬脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響：取第3代Beagle犬ADSCs，以1×104/ml接種在12孔板中，待細(xì)胞匯合至70%～80%后，更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分為3組。A組成骨誘導(dǎo)礦化液組（含有10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 mmol/L地塞米松和新鮮制備的0.2 mmol/L維生素C的含有10% FBS的DMEM+5% PRF滲出液）、B組對(duì)照組（含有10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 mmol/L地塞米松和新鮮制備的0.2 mmol/L維生素C的含有10% FBS的DMEM）和C組空白組（普通10% FBS的DMEM培養(yǎng)液）。

1.5 堿性磷酸酶染色：孵育第7、14、21天，PBS沖洗各組樣品2次，0.5% TritonX-100冰上裂解40 min后，將各組細(xì)胞裂解液吸入離心管中，4℃離心10 min，并收取各組上清液。向96孔板加入上清樣品50 μl、每孔內(nèi)加入顯色底物對(duì)硝基苯磷酸酯50 μl，吹打混勻，室溫37℃孵育30 min，每孔加入100 μl反應(yīng)終止液NaOH終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm下的吸光度OD值。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算樣品的濃度。

1.6 VonKossa鈣結(jié)節(jié)染色：孵育第21天，用PBS洗滌各組樣品2遍，浸入1%硝酸銀水溶液中10 min，紫外光照射45 min，蒸餾水沖洗洗滌，3%硫代硫酸鈉處理5 min，蒸餾水洗滌；1%中性紅復(fù)染5 min，水洗，晾干，酒精系列脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 Beagle犬脂肪干細(xì)胞與納米羥基磷灰石/膠原共培養(yǎng)：精確稱量支架材料，24孔板10 mg每孔，紫外線消毒2 h，將2 ml PRF滲出液滴加到支架上，37℃孵箱孵育2 h，取第3代Beagle犬ADSCs，以1×104/ml的細(xì)胞密度接種，每天倒置相差顯微鏡觀察，每3 d換液，7 d后，2.5%戊二醛固定液固定，置4℃冰箱過夜后環(huán)境掃描電鏡觀察細(xì)胞與支架的復(fù)合情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量數(shù)據(jù)以（x?±s）表示，采用SPSS軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用配方t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 Beagle犬脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)：倒置顯微鏡下，Beagle犬脂肪干細(xì)胞24 h即能貼壁，剛貼壁的脂肪干細(xì)胞大多數(shù)呈成長(zhǎng)梭形外觀，少數(shù)呈短梭狀，72～96 h貼壁細(xì)胞體積增大，呈長(zhǎng)梭狀，細(xì)胞突起相互連接，可匯合呈單層，見圖1。傳代后，增殖迅速，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭狀、旋渦狀，緊密單層復(fù)合生長(zhǎng)，各代細(xì)胞無明顯變化，見圖2。

2.2 Beagle犬ADSCs免疫組化鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示Beagle犬ADSCsCD44、CD29結(jié)果分別見圖3A、B，細(xì)胞形態(tài)均一，約有80%的細(xì)胞CD44、CD29染色陽性。

2.3 PRF滲出液對(duì)Beagle犬脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響

2.3.1 堿性磷酸酶活性檢測(cè)：細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性是檢測(cè)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，ALP值越高，成骨潛能越大。各組測(cè)出吸光值后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，半定量分析結(jié)果顯示，復(fù)合培養(yǎng)21 d后，A組ALP活性值明顯高于B組、C組，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3.2 倒置相差顯微鏡觀察：Beagle犬脂肪干細(xì)胞在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液中，1周左右能形成零星的鈣化結(jié)節(jié)，而在PRF滲出液的作用下，1周即能形成非常明顯的鈣化結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞形態(tài)多呈多角形或短矩形，細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)更加明顯，VonKossa染色可見PRF滲出液組成片的鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)細(xì)小但致密，對(duì)照組也有較多的結(jié)節(jié)形成，但空白組結(jié)節(jié)較少，見圖4。

2.4 Beagle犬脂肪干細(xì)胞與納米羥基磷灰石/膠原共培養(yǎng)：環(huán)境掃描電鏡下，支架材料為相互交通的多孔狀三維立體結(jié)構(gòu)，含大量空隙且空隙相互交通，孔壁間結(jié)合狀態(tài)良好，見圖5。對(duì)于PRF滲出液-Beagle犬ADSCs/nHA復(fù)合物，細(xì)胞在材料表面伸展、黏附，形態(tài)為梭形或卵圓形，呈聚集性分布，細(xì)胞周圍有大量基質(zhì)，見圖6。

3? 討論

牙周組織再生是指實(shí)現(xiàn)牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周膜間的再生與功能重建。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)是最可靠的一個(gè)替代方法。這種方法主要依靠反應(yīng)細(xì)胞、支持基質(zhì)和生物反應(yīng)分子三者之間的相互作用。PRF中生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在炎癥和傷口愈合中起著關(guān)鍵作用，可作為一種新的生物支材料聯(lián)合多種促再生方法用于牙周組織再生工程[2]。并有研究表明，在牙周病中PRF還可以用于優(yōu)化軟組織愈合，可以促進(jìn)歸干細(xì)胞增殖、分化，共同參與牙槽骨結(jié)構(gòu)的修復(fù)[3-6]。在引導(dǎo)性骨再生技術(shù)的同時(shí)使用PRF，不僅僅有利于牙周手術(shù)中組織愈合且對(duì)骨缺損也有良好的臨床效果，可減少探診深度[7-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)5%濃度的PRFe體外促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的效果最佳，并非隨PRF含量的增多越強(qiáng)[9-10]。

三維的微環(huán)境對(duì)于組織工程來說是非常必要的。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，羥基磷灰石復(fù)合生物材料逐漸成為骨組織領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[11-12]。研究表明，當(dāng)羥基磷灰石的尺寸達(dá)到納米級(jí)時(shí)，其生物復(fù)合材料顯示出被認(rèn)為可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化以及礦物沉積，比純膠原蛋白支架更高的細(xì)胞相容性，更高的機(jī)械強(qiáng)度，具有更大的表面積和較高的表面自由能，此特征有利于種子細(xì)胞黏附、增殖和遷移[13-14]。通常在口腔科和整形外科手術(shù)中作為骨替代材料，以恢復(fù)再生受損的骨組織[15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞-PRFe-納米羥基磷灰石/膠原支架復(fù)合物培養(yǎng)掃描電鏡可見，支架內(nèi)部孔洞內(nèi)大量細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞完全伸展、形態(tài)各異并有細(xì)胞基質(zhì)分泌。一方面它可容納高密度的細(xì)胞，使細(xì)胞間形成合適的空間分布和細(xì)胞連接，為細(xì)胞提供特異性生長(zhǎng)和分化信號(hào)，另一方面，細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)良好的固定在細(xì)胞附近，而不易流入細(xì)胞液中，并有利于保持細(xì)胞特定的形態(tài)、代謝、增殖和分化，下一將運(yùn)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shí)現(xiàn)牙周組織外形、結(jié)構(gòu)和功能的再生，為臨床治療牙周病提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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[收稿日期]2022-04-29

本文引用格式：李志鵬，葉眉，李崢，等.富血小板纖維蛋白滲出液對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化及納米羥基磷灰石支架生物相容性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（7）：74-77.