高效液相色譜儀測(cè)定蔬菜中4 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

◎ 李然然

（河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

氨基甲酸酯類的農(nóng)藥屬于高效且低毒的廣譜殺蟲(chóng)劑，在我國(guó)被廣泛用于農(nóng)作物的病蟲(chóng)害防治方面，如谷物、蔬菜以及水果等。此類農(nóng)藥過(guò)量使用會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[1]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥在堿性的條件下水解生成具有熒光特點(diǎn)的甲胺物質(zhì)，可利用液相色譜法來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的分析且衍生化操作，利用熒光檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)一

1.1 檢測(cè)儀器與試劑準(zhǔn)備

本文中主要使用美國(guó) Agilent 公司的1100 LC ，美瑞泰克公司的Pinnacle PCX 柱后衍生儀來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，其中，試劑為色譜純的乙腈、甲醇、二氯甲烷。氨基固相萃取柱主要使用迪馬科技ProElut NH2500 mg/6 mL 進(jìn)行提取。

本文標(biāo)準(zhǔn)樣品以及溶液的配置，需要使用4種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL，濃度為100 μg·mL-1。甲醇稀釋到10 μg·mL-1備用。在樣品制備過(guò)程中，需要稱取蔬菜樣品25.00 g，精確度要達(dá)到0.01 g，將其放置在150 mL 的燒杯內(nèi)，加入50 mL的乙腈之后保持勻漿機(jī)勻漿5 min，經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾之后加入68 mL 的NaCl 具塞比色管中，充分振蕩操作之后，等待靜止，靜止之后產(chǎn)生的分層可以吸取10 mL 放置于燒杯內(nèi)，在80 ℃的水浴上進(jìn)行濃縮操作的同時(shí)還需要吹入氮?dú)猓诮咏珊缘臅r(shí)候取出，利用甲醇+二氯甲烷混合液（1+99）做淋洗液，將燒杯分3 次洗滌，將洗滌液加入氨基小柱，將其收集到淋浴液當(dāng)中，放置在50 ℃的水浴當(dāng)中，保持濃縮到近干的狀態(tài)，其中的殘?jiān)梢岳? mL 的甲醇溶液來(lái)稀釋，經(jīng)過(guò)0.45 μm 的過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，作備用[2]。

在該實(shí)驗(yàn)的液相色譜條件分析的過(guò)程中，C18色譜柱的流動(dòng)相為甲醇和純水，梯度洗脫的時(shí)間保持在0～9 min 的范圍內(nèi)，甲醇的比例為25%，處于9～10 min 范圍內(nèi)的甲醇比例為45%，10～25 min 范圍內(nèi)的甲醇比例為80%，保持1 min，在26 min 后回到初始狀態(tài)。流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 mL。利用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，激發(fā)的波長(zhǎng)為330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為456 nm。4 種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)及出峰時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 4 種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)及出峰時(shí)間表

測(cè)定過(guò)程對(duì)農(nóng)藥保留時(shí)間的定性操作，指標(biāo)需要以色譜峰面積作為定量指標(biāo)來(lái)進(jìn)行分析，計(jì)算的時(shí)候可以利用外標(biāo)法對(duì)蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析和計(jì)算，如表2。

表2 4 種農(nóng)藥的濃度加標(biāo)回收率測(cè)定表

1.2 計(jì)算結(jié)果

對(duì)于4 種農(nóng)藥而言，滅多威、涕滅威砜、異丙威、三羥基克百威經(jīng)過(guò)線性方程計(jì)算之后，其中產(chǎn)生的出峰時(shí)間分別為16.215、12.519、25.799、19.616，在計(jì)算中采用的系數(shù)分別為0.999 76、0.999 76、0.999 80、0.999 8。其平均相關(guān)性數(shù)值為0.999 79，評(píng)價(jià)的回收率范圍在80.70%～118.73%的范圍內(nèi)，滿足檢測(cè)要求且具備快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)二

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑材料以及實(shí)驗(yàn)方式

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)普通板栗進(jìn)行分析，其中樣品重量約為2 kg。試驗(yàn)中使用美國(guó)Thermo Fisher 色譜純乙腈、美國(guó)Thermo Fisher 色譜純甲醇、二氯甲烷、氯化鈉、固相萃取柱氨基柱、有機(jī)濾膜幾種物質(zhì)，還需使用柱后衍生試劑來(lái)完成，其中含鄰苯二甲醛、巰基乙醇、0.05 mol·L-1NaOH 溶液和OPA（鄰苯二甲醛）稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液中含涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威和仲丁威這幾種物質(zhì)[3]。儀器設(shè)備采用Waters 高效液相色譜儀e2695 和熒光檢測(cè)器以及柱后衍生系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析研究，3.9×150 mm 色譜柱，1.5 mL·min-1流速，20 μL 進(jìn)樣量，熒光檢測(cè)器λex339 nm，λem445 nm。

該實(shí)驗(yàn)柱后衍生條件：0.05 mol·L-1NaOH，流速0.3 mL·min-1；OPA 試劑，流速0.3 mL·min-1；反應(yīng)池溫度80 ℃。實(shí)驗(yàn)中，樣品的制備和提取利用四分法，充分搖勻之后放入食品加工粉碎機(jī)作為待測(cè)樣品。同樣方式稱取25 g 樣品放入250 mL 的燒杯中，加入50 mL乙腈之后保持2 min 高度勻漿操作，定性濾紙過(guò)濾，產(chǎn)生的濾液在裝有5～7 g 的NaCl 具塞量筒當(dāng)中進(jìn)行混合后蓋上塞子進(jìn)行膜封，經(jīng)過(guò)2 min 的劇烈振搗搖勻，達(dá)到室內(nèi)溫度下靜置分層1 h，等待凈化操作。具體凈化操作步驟：從具塞量筒當(dāng)中利用移液器吸取10 mL乙腈相提取液，將其放置于200 mL 的燒杯內(nèi)且保持在60 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱操作，蒸發(fā)，對(duì)蒸發(fā)后的干物質(zhì)加入2 mL 的甲醇和二氯甲烷，將殘?jiān)M(jìn)行溶解，完成凈化操作。氨基柱的活化過(guò)程：用6 mL 甲醇+二氯甲烷混合液（1+99）做淋洗液來(lái)完成，分為三次洗滌燒杯，洗滌液內(nèi)需要加入氨基小柱，洗脫溶液用25 mL的試管進(jìn)行收集，用2 mL 的甲醇和二氯甲烷組成的混合液洗滌，在恒溫50 ℃水的基礎(chǔ)上，利用氮吹蒸發(fā)的方式使其接近干燥狀態(tài)，保持1 min 的渦旋混勻，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜之后就可以對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化要從多個(gè)角度多個(gè)方面來(lái)實(shí)現(xiàn)。首先，在選擇標(biāo)品溶劑時(shí)，最終產(chǎn)生的目標(biāo)峰值會(huì)受標(biāo)品溶劑因素的影響，標(biāo)品溶劑不同，對(duì)產(chǎn)生的峰面積以及峰形都會(huì)產(chǎn)生直接的影響[4]。也就是說(shuō)，在混標(biāo)的方式下進(jìn)行進(jìn)樣操作時(shí)，丙酮最終的數(shù)值就會(huì)非常高，再加上之前的疊加效應(yīng)，會(huì)形成很低的標(biāo)品峰壓縮狀態(tài)數(shù)值，再加上對(duì)標(biāo)品溶劑進(jìn)行氮吹操作之后，進(jìn)行混標(biāo)的配置，其中標(biāo)品峰呈現(xiàn)清晰美觀的狀態(tài)。如果溶解試劑為甲醇，則在試驗(yàn)當(dāng)中可以發(fā)現(xiàn)前3 個(gè)峰拖尾屬于平頭峰，響應(yīng)數(shù)值也相對(duì)較低，在利用近似于流動(dòng)相起始比例的甲醇+水進(jìn)行混標(biāo)進(jìn)樣操作的時(shí)候，會(huì)發(fā)現(xiàn)峰形尖銳，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的所有峰形相應(yīng)值也較高。

其次，對(duì)樣品的前處理優(yōu)化操作，要按照相關(guān)的規(guī)定進(jìn)行處理，依據(jù)《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定》（NY/T 761—2008）中第三部分前處理部分進(jìn)行操作時(shí)，如果在封口膜的時(shí)候產(chǎn)生了劇烈震蕩現(xiàn)象，則要預(yù)防提取液漏出問(wèn)題。另外，需要對(duì)靜止時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的氨基柱的活化體積進(jìn)行分析和計(jì)算，借助甲醇和二氯甲烷和體積的方式可以實(shí)現(xiàn)增加洗脫的作用，利用此種方式來(lái)進(jìn)行增加甲醇比例，可以對(duì)氨基甲酸酯農(nóng)藥自身具備的洗脫能力進(jìn)行不斷加強(qiáng)[5]。

最后，對(duì)于定容溶液，根據(jù)相似相容的原理，在《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定》（NY/T 761—2008）第三部分中規(guī)定的甲醇定容方式來(lái)進(jìn)行分析，和前三個(gè)峰一致也出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象。因此，利用甲醇+水2.5 mL 的定容進(jìn)樣出現(xiàn)了峰形尖銳對(duì)稱的現(xiàn)象。在柱后條件進(jìn)行分析之后，利用80 ℃的反應(yīng)器進(jìn)行操作，等到反應(yīng)完全結(jié)束之后，可以有效避免在100 ℃的情況下反應(yīng)器內(nèi)部出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，避免對(duì)熒光檢測(cè)器產(chǎn)生一定的影響。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，此種檢測(cè)方式對(duì)于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)可以進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，其檢測(cè)的時(shí)間為30 min，平均呈現(xiàn)的相關(guān)性數(shù)值為0.999 79，平均的回收率在80.7%～118.73%之間，滿足其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)需求。因此，從數(shù)據(jù)分析中可以得出，此種方式的分離效果好且準(zhǔn)確度較高，實(shí)際的操作過(guò)程也較為簡(jiǎn)便迅速，可以滿足日常的氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的實(shí)際需求。在改變標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋溶液、定容溶液、流動(dòng)相溶劑梯度以及柱后衍生條件之后，可以實(shí)現(xiàn)快速分析且取得良好的分離效果，在靈敏度和準(zhǔn)確度方面都相對(duì)較高。