西雙版納黃瓜種質(zhì)的改良

孫宇紅 謝翌帆 秦培超 普文才 何歡樂(lè)* 張慧婷

（1 上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務(wù)中心，上海 201109；2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3納板河流域國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，景洪 666100） *為通信作者

黃瓜(Cucumis sativusL.)是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，以設(shè)施栽培為主，可周年供應(yīng)，經(jīng)濟(jì)效益高，且果實(shí)脆嫩爽口，深受大眾喜歡。但是，黃瓜的遺傳背景相對(duì)較窄，不利于品種改良，故挖掘和利用各類(lèi)種質(zhì)資源，引入更多的優(yōu)異基因，成為了當(dāng)前黃瓜育種的趨勢(shì)之一。

黃瓜起源于喜馬拉雅山南麓，我國(guó)的西雙版納地區(qū)是黃瓜的起源地之一[1]。西雙版納黃瓜（C.sativusL.var.xishuangbannanesis）是在長(zhǎng)期地理隔離和交流受限等條件下形成的特殊種質(zhì)群體，與其他黃瓜材料的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，屬于半野生材料，具有長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗性強(qiáng)、果實(shí)外形粗大、單瓜質(zhì)量為2～3 kg、老瓜果肉和胎座均呈橙黃色、果肉富含β-胡蘿卜素、果實(shí)耐貯藏等特性[2-5]。但是，隨著黃瓜商業(yè)品種在云南省的大量種植和上市，當(dāng)?shù)氐奈麟p版納黃瓜品種受到了很大沖擊。目前，西雙版納黃瓜品種以農(nóng)家零星種植為主，栽培面積逐年減少，亟需對(duì)其進(jìn)行足夠的保護(hù)和利用，以發(fā)揮其資源潛力。同時(shí)，由于長(zhǎng)期適應(yīng)云南西雙版納地區(qū)的短日照條件，西雙版納黃瓜品種在長(zhǎng)日照地區(qū)種植普遍表現(xiàn)為晚開(kāi)花[6-8]、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、主蔓雌花率較低、白粉病抗性不夠理想等，不利于直接將其應(yīng)用于育種，需要先對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的遺傳改良，再進(jìn)行應(yīng)用。鑒于此，筆者對(duì)西雙版納黃瓜進(jìn)行了種質(zhì)改良，即將西雙版納黃瓜農(nóng)家種與歐洲溫室型自交系進(jìn)行雜交，然后將西雙版納黃瓜農(nóng)家種作為輪回親本，回交3 代，同時(shí)利用黃瓜白粉病抗性基因與全雌基因F的連鎖標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，以期獲得早花、全雌、抗白粉病的西雙版納黃瓜自交系，從而為黃瓜抗白粉病品種的選育與西雙版納黃瓜農(nóng)家種的有效利用奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將相關(guān)改良情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種包括歐洲溫室型自交系SA0422、西雙版納黃瓜農(nóng)家種BN5-1 和BN38。其中，SA0422的抗白粉病等級(jí)為抗病，具有白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2，開(kāi)花習(xí)性為早花、全雌，雌花率為100%；BN5-1 和BN38 的抗白粉病等級(jí)均為中間類(lèi)型，開(kāi)花習(xí)性為晚花，雌花率低，老熟瓜果肉心腔顏色為橙黃色，5心皮。另外，以白粉病抗性測(cè)定為感病的華北型自交系9930作為對(duì)照品種。黃瓜材料均種植在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院的溫室中，采用懸吊式、基質(zhì)滴灌栽培，統(tǒng)一水肥管理。

1.2 種質(zhì)改良方法

1.2.1 黃瓜遺傳改良方案

將西雙版納黃瓜農(nóng)家種BN5-1 和BN38 分別與歐洲溫室型自交系SA0422（供體親本）進(jìn)行雜交，然后用輪回親本BN5-1 和BN38 各回交3 代，最后自交獲得純合株BN5-1R 和BN38R，回交和自交后代植株利用白粉病抗性基因（pm5.1和PM5.2）與全雌基因F的連鎖標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇（Markerassisted selection，MAS）。在回交后代MAS 的前景選擇中，挑選出含供體親本條帶的植株定植于田間。早花性狀為顯性，可通過(guò)田間早花表型選擇后代植株。在改良后代自交系鑒定中，每個(gè)自交系材料分別種植10 株，重復(fù)3 次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

1.2.2 白粉病抗性鑒定

在黃瓜成株期（植株具有15～20張葉片），調(diào)查植株最下方的5～6張真葉的白粉病發(fā)生情況，并記錄發(fā)病等級(jí)（分為5個(gè)等級(jí)）[9-10]。其中，發(fā)病等級(jí)小于1.5 時(shí)，記為抗白粉?。≧）；發(fā)病等級(jí)大于等于1.5、小于3.0 時(shí)，記為中間類(lèi)型（M）；發(fā)病等級(jí)大于等于3.0 時(shí)，記為感白粉?。⊿）。

1.2.3 田間始花時(shí)間和雌花率調(diào)查

始花時(shí)間的調(diào)查：記錄每株材料主蔓上第一朵花的開(kāi)放時(shí)間。

雌花率調(diào)查：記錄黃瓜植株主蔓上每個(gè)節(jié)位的開(kāi)花類(lèi)型，雌花率為主蔓前20節(jié)上著生雌花節(jié)位數(shù)的百分比。

1.2.4 分子標(biāo)記輔助選擇

在黃瓜植株苗期，采集1/4 片子葉，采用改良CTAB 法[11]提取基因組DNA，并利用目標(biāo)基因連鎖標(biāo)記進(jìn)行MAS，然后從回交群體中篩選出含供體親本帶型的植株定植于溫室，用于后續(xù)的田間選擇和回交等。目標(biāo)基因具體為：（1）白粉病抗性基因pm5.1。選擇黃瓜抗白粉病基因pm5.1的InDel 標(biāo)記InDel-MLO 1，其正向引物為5'- G C TA TT TG C TG TT C TCTTCATCCT-3'，反向引物為5'- TCATATT G T G A A C T T A C C C C A T T G-3' 。P C R 和電泳檢測(cè)參照相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]。（2）白粉病抗性基因PM5.2。利用PM5.2緊密連鎖標(biāo)記S-InDel-98 進(jìn)行該抗性基因的MAS。標(biāo)記S-InDel-98 與PM5.2 基因的物理距離小于20 kb，其正向引物為5'-TGAATATT T G T G T T A T G T G T G G G-3' ，反向引物為5'-T G A A A T T G A G A A T G G A A G G G-3' 。（3）全雌基因F。黃瓜全雌基因F（CsACS1G）的共分離標(biāo)記參照Mibus 等[12]的方法，其正向引物為5'-TTAAC T AC TT C GG A CG GG C AT A G-3'，反向引物為5'-A G G T G T T C A G C A A A C A T A G G G T G-3' 。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)性分析，采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜回交后代植株的分子標(biāo)記輔助選擇

在回交轉(zhuǎn)育改良西雙版納黃瓜農(nóng)家種過(guò)程中，在苗期進(jìn)行MAS，即利用目標(biāo)性狀（抗白粉病和全雌）的連鎖標(biāo)記選擇回交后代植株，挑選出含有目標(biāo)區(qū)段的小苗20～30 株，定植于溫室，再通過(guò)田間早花表型選擇后代植株，繼續(xù)回交或自交留種。

在pm5.1基因的MAS 中，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，InDel-MLO1 標(biāo)記可顯著區(qū)分白粉病抗性為中間類(lèi)型的親本BN5-1 和抗病親本SA0422，F(xiàn)1包含兩個(gè)親本的帶型，由于此抗病基因?yàn)殡[性遺傳，故雜合帶型個(gè)體對(duì)應(yīng)為感病植株，這與聶京濤等[9]的結(jié)果一致。最終，從回交群體中選出含pm5.1基因的雜合個(gè)體，或從F2 群體中選出含pm5.1基因的純合個(gè)體。見(jiàn)圖1。

圖1 抗白粉病基因pm5.1 共分離標(biāo)記InDel-MLO1篩選黃瓜回交群體的電泳結(jié)果

利用PM5.2緊密連鎖標(biāo)記S-InDel-98 篩選出黃瓜回交后代植株，挑出含供體親本帶型的后代植株，其白粉病抗性與預(yù)期相符。見(jiàn)圖2。

圖2 抗白粉病基因PM5.2 連鎖標(biāo)記S-InDel-98篩選黃瓜回交群體的電泳結(jié)果

由圖3 可知，利用全雌基因F的標(biāo)記進(jìn)行MAS，基因型為ff的西雙版納黃瓜植株不含CsACS1G基因，沒(méi)有該標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增帶，故利用全雌基因F的標(biāo)記可以在苗期快速篩選出具有全雌基因F的后代植株。

圖3 全雌基因F 共分離標(biāo)記篩選黃瓜回交群體的電泳結(jié)果

2.2 西雙版納黃瓜改良后代的表型分析

通過(guò)雜交和回交，將目標(biāo)性狀基因?qū)胛麟p版納黃瓜農(nóng)家種BN5-1 和BN38 中，經(jīng)過(guò)3 次回交，然后自交1～2 代，同時(shí)結(jié)合MAS 和田間表型選擇，最后獲得目標(biāo)基因純合株系BN5-1R 和BN38R。將其后代植株種植于田間，進(jìn)行相應(yīng)的表型鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)性狀的改良情況。

由表1可知，對(duì)照材料9930的平均白粉病病級(jí)最高，其抗病性顯著低于其他自交系，感病程度與預(yù)期一致；西雙版納黃瓜農(nóng)家種BN5-1 和BN38均為中間類(lèi)型，對(duì)白粉病具有一定的抗性，病級(jí)顯著低于9930，兩材料之間的白粉病病級(jí)差異不顯著；SA0422 的平均病級(jí)為0，表現(xiàn)為高抗白粉??；回交轉(zhuǎn)育含白粉病抗性基因的西雙版納黃瓜自交系BN5-1R 和BN38R 的平均病級(jí)與SA0422 相近，即為抗白粉病，這3個(gè)自交系間的白粉病病級(jí)差異不顯著。由此表明，種質(zhì)改良成功導(dǎo)入了2個(gè)白粉病抗性基因，提高了西雙版納黃瓜農(nóng)家種的白粉病抗性。

表1 黃瓜田間性狀的調(diào)查情況

由表1 可知，SA0422 的始花時(shí)間約為30 d，顯著低于其他材料；而B(niǎo)N5-1 和BN38 的始花時(shí)間較長(zhǎng)，約58 d，2個(gè)材料間的始花時(shí)間差異不顯著；改良后代BN5-1R 和BN38R 的始花時(shí)間大幅度降低，約32 d，接近于親本SA0422。在植株雌花率方面，SA0422 為全雌，雌花率約為100%，顯著高于其他材料；而B(niǎo)N5-1 和BN38 雌花率均較低，在主蔓的前20節(jié)上沒(méi)有出現(xiàn)雌花，與沈鏑等[13]的研究結(jié)果一致；遺傳改良后代BN5-1R 和BN38R 的雌花率大幅度提高，有些植株前面幾節(jié)無(wú)花芽，但植株產(chǎn)生的花芽均為雌花，即實(shí)際雌花率達(dá)100%，這與植株的F純合基因型相符。

綜上，通過(guò)雜交和回交，成功地將4個(gè)目標(biāo)性狀基因?qū)胛麟p版納黃瓜中，獲得了早花、全雌型、抗白粉病的改良株系，且保持了原材料果肉橙黃色、黃瓜味濃厚的特性，這為西雙版納黃瓜資源的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

在黃瓜生產(chǎn)上，白粉病的發(fā)生非常普遍，應(yīng)用抗病品種是防治該病害的主要策略之一。黃瓜白粉病抗性基因pm5.1為隱性抗病基因，在常規(guī)育種中回交轉(zhuǎn)育時(shí)無(wú)法根據(jù)回交當(dāng)代的表型選擇后代，需要通過(guò)自交后的抗性鑒定確認(rèn)抗性基因，但育種周期長(zhǎng)、效率低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而利用隱性基因的連鎖標(biāo)記輔助育種可以突破該瓶頸。本研究對(duì)西雙版納黃瓜農(nóng)家種的改良，充分體現(xiàn)了MAS 的優(yōu)勢(shì)，在苗期即可進(jìn)行大規(guī)模篩選，不需要進(jìn)行抗病接種鑒定，且選種準(zhǔn)確，節(jié)約了大量的田間栽培時(shí)間和管理投入。同時(shí)，本研究對(duì)西雙版納黃瓜農(nóng)家種的白粉病抗性的遺傳改良結(jié)果，也再次驗(yàn)證了pm5.1和PM5.2是黃瓜主要的白粉病抗性基因，這兩個(gè)基因均是抗白粉病表型所必需的，且本研究進(jìn)一步確認(rèn)了抗白粉病基因型為pm5.1 pm5.1/PM5.2，其他基因型的植株葉片均會(huì)產(chǎn)生白粉病斑，白粉病抗性低于供體親本（pm5.1 pm5.1/PM5.2 PM5.2）。

對(duì)于黃瓜白粉病抗性和全雌性狀的MAS，前期的研究基礎(chǔ)很關(guān)鍵。黃瓜全雌基因F、白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2已經(jīng)克隆，而且這幾個(gè)基因在供試的西雙版納黃瓜材料中的基因型也已經(jīng)過(guò)相應(yīng)的測(cè)序確認(rèn)，均為pm5.1 pm 5.1/PM5.2 PM 5.2/ff。根據(jù)親本間的基因組DNA 序列差異，容易開(kāi)發(fā)出更合適的標(biāo)記用于MAS。這些先決條件促進(jìn)了相應(yīng)連鎖標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，保障了MAS 的成功。

已有研究顯示，黃瓜早花性狀受多個(gè)基因調(diào)控，主要與FLOWERING LOCUS T(FT)及其周邊序列差異密切相關(guān)[6-8]。由于本研究尚未確認(rèn)供試親本在早花基因上的差異，沒(méi)有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用相應(yīng)的連鎖標(biāo)記，這在一定程度上增加了回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中的田間工作量。

在表型分析時(shí)，遺傳改良自交系B N 5-1 R 和BN38R 的始花時(shí)間和雌花節(jié)數(shù)接近供體親本，但仍存在細(xì)微差異；同時(shí)，植株前1～2節(jié)的花芽生長(zhǎng)遲緩，這可能是受其他微效基因的影響，也有待進(jìn)一步的研究。

在田間，未改良的西雙版納黃瓜植株葉片有白粉病斑發(fā)生，但病斑的擴(kuò)展速度較慢，植株整體呈現(xiàn)耐病表型，而遺傳改良自交系BN5-1R 和BN38R均呈現(xiàn)很高的白粉病抗性，且同時(shí)具有歐洲溫室型黃瓜的早花、全雌性狀，這為黃瓜抗白粉病品種的選育與西雙版納黃瓜農(nóng)家種的有效利用提供了極大的便利。