高脂飲食條件下極長鏈飽和脂肪酸對大鼠認(rèn)知功能的影響及相關(guān)機制*

趙舒祥， 楊磊， 張李娟， 王若溪， 韓琪， 陳路路， 張偉，高璐璐， 李文強， 石如玲6，△

高脂飲食條件下極長鏈飽和脂肪酸對大鼠認(rèn)知功能的影響及相關(guān)機制*

趙舒祥1， 楊磊2， 張李娟3， 王若溪1， 韓琪1， 陳路路1， 張偉4，高璐璐1， 李文強5， 石如玲6，5△

（1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)護(hù)理學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3新鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；4新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；5新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453002；6新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

探討高脂飲食條件下極長鏈飽和脂肪酸（VLCSFA）對大鼠認(rèn)知功能的影響及相關(guān)機制。將50只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組10只，即空白對照組組（飼喂基礎(chǔ)飼料）、低含量對照（L-CON）組（飼喂20%對照用油）、低含量VLCSFA（L-VLC）組（飼喂20%實驗用油）、高含量對照（H-CON）組（飼喂30%對照用油）和高含量VLCSFA（H-VLC）組（飼喂30%實驗用油），飼喂12周。Morris水迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；氣相色譜法檢測腦皮質(zhì)脂肪酸組成及含量；生化法檢測腦氧化應(yīng)激水平；ELISA法檢測腦促炎因子水平；Western blot法檢測腦中β-分泌酶（BACE1）、α-分泌酶（ADAM10）、磷酸化tau蛋白及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的水平。與L-CON組相比，L-VLC組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少（<0.05），腦皮質(zhì)C21：0、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量顯著增加（<0.05或<0.01），ADAM10蛋白水平顯著下降（<0.01），BACE1和p-tau396蛋白水平顯著升高（<0.05），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著降低（<0.01），丙二醛（MDA）水平顯著升高（<0.05），白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）水平顯著升高（<0.01）；與H-CON組相比，H-VLC組大鼠逃避潛伏期顯著延長（<0.05），腦皮質(zhì)C20：0、C21：0、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量均顯著升高（<0.05或<0.01），ADAM10蛋白水平顯著下降（<0.01），BACE1、p-tau396和p-tau404蛋白水平顯著升高（<0.01），超氧化物歧化酶（SOD）和GSH-Px活性顯著降低（<0.05或<0.01），MDA水平顯著升高（<0.05），IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高（<0.01），B細(xì)胞淋巴瘤/白血病蛋白2（Bcl-2）水平顯著降低（<0.05），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高（<0.05或<0.01）。通過高脂飲食大量攝入VLCSFA會損害大腦認(rèn)知功能，其機制可能與腦組織VLCSFA積累增多、淀粉樣前體蛋白代謝、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

阿爾茨海默?。粯O長鏈飽和脂肪酸；tau蛋白過度磷酸化；氧化應(yīng)激；神經(jīng)炎癥；細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）是一種退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)。目前較為公認(rèn)的AD發(fā)病機制主要包括β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）沉積、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥及凋亡等［1］。Aβ來源于β-淀粉樣蛋白前體（amyloid β-protein precursor， APP）的裂解，而APP經(jīng)β-分泌酶（β-site APP-cleaving enzyme 1， BACE1）和γ-分泌酶順序裂解產(chǎn)生Aβ，增多的Aβ聚集形成寡聚體具有神經(jīng)毒性，α-分泌酶（即去整合素金屬蛋白酶10， a disintegrin and metalloproteinase 10， ADAM10）在Aβ序列內(nèi)切割A(yù)PP可阻止Aβ形成［2］。另一方面，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白發(fā)生過度磷酸化，導(dǎo)致微管解體，同時磷酸化tau蛋白逐步聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles， NFT），具有神經(jīng)毒性［3］。Aβ和NFT均可引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等系列級聯(lián)反應(yīng)，引起神經(jīng)元功能損傷，導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展［3-4］。盡管圍繞AD發(fā)病機制研究已較為深入，但引起AD的確切病因尚不明確。

極長鏈飽和脂肪酸（very-long-chain saturated fatty acid， VLCSFA；碳原子數(shù)超過20）與AD發(fā)病機制的關(guān)系受到關(guān)注［5］。AD患者或AD模型動物體內(nèi)VLCSFA積累增多［6-8］。應(yīng)用VLCSFA體外處理細(xì)胞后氧化應(yīng)激水平增高，tau蛋白磷酸化增強［9］，Aβ分泌增多［10］。盡管以上研究提示VLCSFA可能與AD發(fā)病機制有關(guān)，但是在整體水平上尚缺乏飲食攝入VLCSFA引起AD相關(guān)病理生理學(xué)變化的實驗證據(jù)。因此，本項工作以大鼠為研究對象，利用不同食用油VLCSFA含量的差異，配制出VLCSFA含量不同的高脂飼料飼喂大鼠，觀察高脂飲食條件下VLCSFA對大鼠認(rèn)知功能的影響，并從腦組織脂肪酸成分、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡等角度探討VLCSFA損傷大鼠認(rèn)知功能的相關(guān)機制，以期在整體水平上探明VLCSFA對腦功能的損傷作用，為探索AD病因和防治途徑提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1　實驗試劑與儀器

脂肪酸甲酯混標(biāo)（GLC-617-25MG）購自Nu-Chek；丙二醛（malondialdehyde， MDA）試劑盒（A003-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）試劑盒（A005-1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）試劑盒（A001-3）均購自南京建成有限公司；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒（E-EL-R0012c）、IL-6 ELISA試劑盒（E-EL-R0015c）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒（E-EL-R2856c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；ADAM10兔單克隆抗體（ab124695）和p-tau396兔單克隆抗體（ab109390）購自Abcam；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病蛋白2（B-cell lymphoma/leukemia-2， Bcl-2）兔單克隆抗體（AF0355）購自伊萊瑞特生物科技有限公司；BACE1兔單克隆抗體（BM5148）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax）兔單克隆抗體（BM3964）均購自武漢博士德生物工程有限公司；p-tau404兔單克隆抗體（D2Z4G）和cleaved caspase-3兔單克隆抗體（5A1E）購自Cell Signaling Technology；GAPDH兔多克隆抗體（AB-P-R001）購自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（S0001）購自Affinity Biosciences；魯花花生油、魯花亞麻籽油、歐麗薇蘭橄欖油和晟麥葡萄籽油均為常見食用油，購自本地超市；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。氣相色譜儀為Agilent產(chǎn)品；水迷宮跟蹤系統(tǒng)為Noldus產(chǎn)品；電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品；超靈敏成像儀（Amersham ImageQuant 800）為GE產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為PerkinElmer產(chǎn)品。

2　實驗方法

2.1高脂飼料的配制利用花生油VLCSFA含量遠(yuǎn)高出其他食用油的特點，選擇合適的食用油進(jìn)行配比，配制出對照用油和實驗用油，二者的差異主要是VLCSFA含量不同。本實驗中，對照用油為橄欖油和葡萄籽油按照1.5∶1質(zhì)量比混合，實驗用油為花生油與亞麻籽油按照125∶1質(zhì)量比混合。氣相色譜分析顯示，實驗用油中總VLCSFA含量為6.06%，對照用油總VLCSFA含量為0.37%，二者的多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量處于同一水平（數(shù)據(jù)未列）。將對照用油和實驗用油分別與基礎(chǔ)飼料加工制成20%或30%高脂飼料，飼料加工由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心完成。

2.2動物分組及處理SPF級雄性SD大鼠50只，14月齡，530～550 g。由鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場提供，動物許可證編號：SCXK（豫）2019-0002。將大鼠按照體重隨機分為5組，每組10只，即空白對照（blank control， BLK）組（飼喂基礎(chǔ)飼料）、低含量對照（low control oil， L-CON）組（飼喂20%對照用油高脂飼料）、低含量VLCSFA（low VLCSFA， L-VLC）組（飼喂20%實驗用油高脂飼料）、高含量對照（high control oil， H-CON）組（飼喂30%對照用油高脂飼料）和高含量VLCSFA（high VLCSFA， H-VLC）組（飼喂30%實驗用油高脂飼料）。大鼠先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再飼喂相應(yīng)飼料。大鼠喂養(yǎng)期間自由攝食飲水，每周記錄體重，溫度（23±2） ℃，相對濕度50%～65%，光照/黑暗12 h/12 h。大鼠飼養(yǎng)12周，進(jìn)行Morris水迷宮實驗，結(jié)束后禁食12 h，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清；處死大鼠，快速剝腦、分離腦皮質(zhì)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力參考文獻(xiàn)中提到的方法［11］，將平臺置于第三象限（目標(biāo)象限）中央水面以下1 cm，水溫（22±0.5） ℃，進(jìn)行定位航行試驗和空間探索實驗。定位航行實驗：為期5天，每天在同一時間段，將大鼠分別從3個象限中央面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠爬上平臺的時間為逃避潛伏期，并在平臺上停留15 s，如果120 s內(nèi)未找到平臺，則將大鼠放在平臺15 s，記逃避潛伏期為120 s。空間探索實驗：第6天撤去水下平臺，將大鼠從目標(biāo)象限對側(cè)放入池中，使大鼠自由游泳120 s，記錄其穿越平臺位置的次數(shù)。

3.4氣相色譜法檢測腦皮質(zhì)脂肪酸組成及含量根據(jù)以往研究［12］中提到的方法，先提取腦皮質(zhì)脂肪酸，再采用甲醇/乙酰氯法進(jìn)行脂肪酸甲酯化。取各組相同部位腦皮質(zhì)50 mg加入甲醇+二氯甲烷混合液（體積比3∶1）2 mL，冰浴勻漿3 min后移至玻璃管中，加入無水硫酸鈉1 g，混勻后1 500×離心10 min。將上清1.5 mL移至帶聚四氟乙烯帽的玻璃管中，緩慢加入乙酰氯150 μL混勻，80 ℃水浴3 h；取出冷卻后，加入7%的K2CO34 mL，混勻；加入正己烷2 mL，混勻10 min；1 500×離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移至另一玻璃管中，加入2 mL乙腈，混勻5 min，1 500×離心10 min；取上清液置于尖底磨口玻璃管中氮氣吹干，加入正庚烷50 μL溶解，用于氣相色譜分析。色譜柱為DB-23毛細(xì)色譜柱（60 m×0.25 mm×0.15 μm），分流比是100∶1；升溫程序：初始柱溫45 ℃保持3 min，以13 ℃/min的速率升溫至175 ℃，保持20 min；然后以2 ℃/min的速率升溫至210 ℃，再以1 ℃/min的速率升溫至170 ℃，保持10 min；最后以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持10 min。參照混標(biāo)色譜峰并根據(jù)出峰時間定性，采用峰面積歸一化法分析。

3.5腦組織氧化應(yīng)激水平測定按照說明書樣本用量稱取大鼠腦組織后，以重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加9倍體積的生理鹽水，冰浴勻漿，1 500×離心10 min，取上清分別按照試劑盒按說明書對SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量進(jìn)行檢測，分別在450、405和532 nm處讀取吸光度，計算結(jié)果。

3.6ELISA法測定腦組織炎癥因子水平取各組相同部位腦皮質(zhì)30 mg加入9倍體積PBS，同時加入蛋白酶抑制劑，冰浴勻漿，上清用于IL-1β、IL-6和TNF-α檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔（加入100 μL不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品）、空白孔（加入100 μL稀釋液）和樣本孔（加入100 μL待測樣本），37 ℃孵育90 min，棄掉板內(nèi)液體，加100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板3次；加100 μL辣根過氧化物酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板5次；加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min；然后加入50 μL終止液，立即在450 nm波長處讀取吸光度，計算結(jié)果。

3.7Western blot檢測腦組織蛋白表達(dá)水平取各組相同部位腦皮質(zhì)30 mg，加入裂解液冰浴勻漿，取上清測定蛋白濃度。上清加上樣緩沖液煮沸5 min變性，每孔上樣20μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃下轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；分別加入BACE1（1∶500）、ADAM10（1∶1 000）、p-tau396（1∶1 000）、p-tau404（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶4000），室溫孵育1 h，洗膜。加入化學(xué)發(fā)光液下顯影，應(yīng)用超靈敏成像儀采集圖像，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參照蛋白灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用重復(fù)測量方差分析的方法分析Morris水迷宮的逃避潛伏期；其他數(shù)據(jù)正態(tài)分布資料若方差齊采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布用非參數(shù)秩和檢驗，組間數(shù)據(jù)比較方差齊采用最小顯著性差異（LSD）法，方差不齊用Games-Howell檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

定位航行實驗中，各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短，與BLK組和H-CON組相比，H-VLC組大鼠第4和5天逃避潛伏期均顯著延長（<0.01或<0.05）；空間探索實驗中，與BLK組相比，L-CON組大鼠穿臺次數(shù)顯著增多（<0.01），與L-CON組相比，L-VLC組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少（<0.01），其他各組間無顯著差異（>0.05），見表1。

表1　大鼠逃避潛伏期和穿臺次數(shù)比較

△△<0.01BLK group；#<0.05，##<0.01L-CON group；*<0.05H-CON group.

2　大鼠腦皮質(zhì)脂肪酸組成及含量

與BLK組相比，L-CON組C12：0含量顯著降低（<0.05），C22：5n6和Σn6PUFA含量顯著升高（<0.01或<0.05），H-CON組C16：1含量顯著降低（<0.01），C18：2n6、C22：5n6和Σn6PUFA含量顯著升高（<0.01），L-VLC組C12：0、C16：1和C18：1含量顯著降低（<0.05），C22：5n6、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量顯著升高（<0.01），H-VLC組C12：0、C16：1和C18：1含量顯著降低（<0.01或<0.05），C18：2n6、C22：5n6、Σn6PUFA、C20：0、C21：0、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量升高（<0.01或<0.05），其他脂肪酸變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與L-CON組相比，L-VLC組C21：0、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量顯著升高（<0.01或<0.05），其他脂肪酸變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與H-CON組相比，H-VLC組C20：0、C21：0、C22：0、C23：0、C24：0、C26：0和ΣVLCSFA含量均升高（<0.05或<0.01），其他脂肪酸變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05），見表2。

表2　大鼠腦皮質(zhì)脂肪酸百分含量

△<0.05，△△<0.01BLK group；##<0.01L-CON group；*<0.05，**<0.01H-CON group.

3　大鼠腦皮質(zhì)BACE1、ADAM10、p-tau396和p-tau404蛋白水平

如圖1所示，與BLK組相比，L-VLC組和H-VLC組ADAM10水平顯著降低（<0.01），BACE1水平顯著升高（<0.01），H-VLC組p-tau396和p-tau404水平顯著升高（<0.01），其他組指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與L-CON組相比，L-VLC組ADAM10蛋白水平顯著降低（<0.01），BACE1和p-tau396蛋白水平顯著升高（<0.05），p-tau404水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與H-CON組相比，H-VLC組ADAM10水平顯著降低（<0.01），BACE1、p-tau396和p-tau404水平顯著升高（<0.01）。

Figure 1. The protein levels of ADAM10， BACE1， p-tau396 and p-tau404 in the cerebral cortex of rats. Mean±SD. n=6. △P<0.05， △△P<0.01 vs BLK group； #P<0.05 vs L-CON group； **P<0.01 vs H-CON group.

4　大鼠腦皮質(zhì)SOD、GSH-Px和MDA水平

如圖2所示，與BLK組相比，L-VLC組GSH-Px活性顯著降低（<0.01），H-VLC組SOD和GSH-Px活性顯著降低（<0.01），MDA水平顯著升高（<0.01），L-CON組和H-CON組指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與L-CON組相比，L-VLC組GSH-Px活性顯著降低（<0.01），MDA水平顯著升高（<0.05），SOD活性的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與H-CON組相比，H-VLC組SOD和GSH-Px活性顯著降低（<0.05或<0.01），MDA水平顯著升高（<0.05）。

Figure 2. The levels of SOD （A）， GSH-Px （B） and MDA （C） in the cerebral cortex of rats. Mean±SD. n=10. △P<0.05， △△P<0.01 vs BLK group； #P<0.05， ##P<0.01 vs L-CON group； *P<0.05， **P<0.01 vs H-CON group.

5　大鼠腦皮質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α水平

如圖3所示，與BLK組相比，L-VLC組和H-VLC組IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高（<0.01或<0.05），L-CON組和H-CON組指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與L-CON組相比，L-VLC組IL-6、TNF-α水平均顯著升高（<0.01），IL-1β水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與H-CON組相比，H-VLC組IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高（<0.01）。

Figure 3. The levels of IL-1β （A）， IL-6 （B） and TNF-α （C） in the cerebral cortex of rats. Mean±SD. n=8. △P<0.05， △△P<0.01 vs BLK group； ##P<0.01 vs L-CON group； **P<0.01 vs H-CON group.

6　大鼠腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白水平

如圖4所示，與BLK組相比，L-VLC組和H-VLC組Bcl-2蛋白水平顯著降低（<0.01），H-VLC組Bax和caspase-3蛋白水平顯著升高（<0.01），L-CON組和H-CON組指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與L-CON相比，L-VLC組指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（0.05）；與H-CON組相比，H-VLC組Bcl-2蛋白水平顯著降低（<0.05），Bax和caspase-3蛋白水平顯著升高（<0.05或<0.01）。

Figure 4. The protein levels of Bcl-2， Bax and cleaved caspase-3 in the cerebral cortex of rats. Mean±SD. n=5. △△P<0.01 vs BLK group； *P<0.05， **P<0.01 vs H-CON group.

討論

本研究利用花生油VLCSFA含量較高的特點，將不同食用油按一定比例配比，配制出主要在VLCSFA含量上存在顯著差異的對照用油和實驗用油并制成高脂飼料飼喂大鼠，首次實現(xiàn)了在整體水平上通過飲食攝入途徑研究VLCSFA對機體的作用。

機體脂肪酸的來源包括膳食攝入和自身合成，膳食脂肪酸成分會影響機體脂肪酸組成。本實驗中攝入VLCSFA高脂飼料的2組大鼠，腦皮質(zhì)VLCSFA含量均較相應(yīng)對照組增加，分別是相應(yīng)對照組的2倍和2.79倍，表明食物VLCSFA成分影響腦組織VLCSFA含量，食物VLCSFA含量越高，腦組織VLCSFA含量增加越顯著。同時與相應(yīng)對照組相比，飼喂實驗用油大鼠腦脂肪酸發(fā)生顯著變化的均為VLCSFA，與預(yù)期一致，表明本研究實驗用油和對照用油的選擇和配比是合理的。另外，與攝入基礎(chǔ)飼料大鼠相比，攝入高脂飼料的4組大鼠腦內(nèi)一些脂肪酸成分（除VLCSFA外）也有顯著變化，如C18：2n6和C22：5n6含量升高，C12：0、C16：1和C18：1含量下降。本研究所用高脂飼料中C18：2n6含量豐富［13］，這可能是大鼠腦內(nèi)n6 PUFA增加的主要原因。需要說明的是，本研究采用面積歸一化法定量脂肪酸，計算的是樣品中各組分相對含量，并非脂肪酸實際含量，故攝入高脂飼料后一些脂肪酸含量降低可能與定量方法有關(guān)。

近年研究提示，AD發(fā)病機制可能與腦內(nèi)VLCSFA增多有關(guān)［14-15］。AD患者腦內(nèi)及外周血均存在VLCSFA積累［7， 16］，/轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦皮質(zhì)VLCSFA含量較野生型小鼠升高［8］。本研究結(jié)果表明，飲食攝入較多VLCSFA會導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，損害認(rèn)知功能。這是首次采用動物實驗從整體水平上證實過量攝入VLCSFA會損害大腦認(rèn)知功能。結(jié)合大鼠腦內(nèi)脂肪酸的改變，提示腦內(nèi)VLCSFA的累積增多可能是引起大腦認(rèn)知功能下降的重要原因。

APP裂解產(chǎn)生的Aβ在腦內(nèi)沉積是AD發(fā)生的重要機制［3］。APP裂解的關(guān)鍵酶分別是ADAM10和BACE1，ADAM10活性增高時抑制Aβ產(chǎn)生，BACE1活性增高時增加Aβ生成［2］。本課題組前期研究顯示，SH-SY5Y細(xì)胞用C20：0和C26：0處理后，BACE1表達(dá)升高，ADAM10表達(dá)降低，Aβ分泌增多［10］。本研究中大鼠攝入過量VLCSFA后，腦內(nèi)BACE1表達(dá)增多，ADAM10表達(dá)減少，從整體水平上證明了飲食攝入過量VLCSFA可增強APP的β-分泌酶裂解途徑，促進(jìn)Aβ生成。

tau蛋白過度磷酸化是AD發(fā)病的另一重要機制［17］。tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常情況下腦內(nèi)tau蛋白上的一些絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）殘基處于低水平磷酸化狀態(tài)，致病因素下tau蛋白發(fā)生過度磷酸化而導(dǎo)致構(gòu)象改變，失去微管結(jié)合能力，導(dǎo)致微管解聚，神經(jīng)細(xì)胞功能受損；而且過度磷酸化的tau蛋白逐步聚集，最終形成NFT，具有神經(jīng)毒性。前期細(xì)胞實驗顯示，C22：0、C24：0和C26：0處理SH-SY5Y細(xì)胞可提高tau蛋白磷酸化水平［9］。本研究中大鼠攝入過量VLCSFA后，腦內(nèi)tau蛋白Ser396和Ser404位點磷酸化水平顯著升高，提示在整體水平上VLCSFA可通過促進(jìn)tau蛋白過度磷酸化進(jìn)而引起神經(jīng)功能損傷。

氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥貫穿AD發(fā)病全程且二者相互促進(jìn)，在AD發(fā)病過程中均起著重要作用［18］。研究表明，體內(nèi)VLCSFA升高的過氧化物酶體病患者存在氧化應(yīng)激和炎癥損傷［19］，體外實驗顯示C22：0、C24：0和C26：0引起SK-N-BE細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［20］，C26：0可導(dǎo)致C6膠質(zhì)細(xì)胞DNA氧化損傷和IL-1β釋放［21］。本研究中大鼠飲食攝入過量VLCSFA后腦內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高，促炎因子IL-1β、IL-6和TNFα水平升高，進(jìn)一步從整體水平上證實了VLCSFA在腦內(nèi)累積能誘發(fā)氧化損傷和神經(jīng)炎癥。另外，研究表明多種致病因素如外源性化學(xué)物質(zhì)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Aβ、NFT等可觸發(fā)異常的細(xì)胞凋亡級聯(lián)，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失，進(jìn)而引起腦功能障礙［22-23］。以往有體外實驗表明C20：0和C22：0可誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡，發(fā)生DNA梯狀斷裂［24］。本研究中大鼠攝入高劑量VLCSFA后腦內(nèi)促凋亡因子Bax和caspase-3表達(dá)增多，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)減少，從整體水平上證明了飲食攝入過多VLCSFA可誘發(fā)大腦細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過高脂飲食使大鼠攝入大量VLCSFA引起大腦認(rèn)知功能降低，其機制可能與腦組織VLCSFA積累增多、淀粉樣前體蛋白代謝、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究通過動物實驗實現(xiàn)了在整體水平上研究VLCSFA對大腦功能的損傷作用，上述損傷機制之間的內(nèi)在因果聯(lián)系及在AD發(fā)病機制中的確切作用尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of very-long-chain saturated fatty acids on cognitive function of rats under high-fat diet and its related mechanisms

ZHAO Shuxiang1， YANG Lei2， ZHANG Lijuan3， HAN Qi1， CHEN Lulu1， WANG Ruoxi1， ZHANG Wei4， GAO Lulu1， LI Wenqiang5， SHI Ruling6，5△

（1，，453003，；2，，453003，；3，453003，；4，，453003，；5，453002，；6，，453003，）

To examine the effects of very-long-chain saturated fatty acids （VLCSFA） on cognitive function of rats having high-fat diet and the underlying mechanisms.Fifty male SD rats were randomly divided into 5 groups （=10） and had the following feed for 12 weeks： blank control group （basic feed）， low control oil （L-CON） group （20% control oil）， low VLCSFA （L-VLC） group （20% test oil）， high control oil （H-CON） group （30% control oil） and high VLCSFA （H-VLC） group （30% test oil）. Morris water maze test was used to evaluate the learning and memory impairment of rats. The composition and content of fatty acids in cerebral cortex were determined by gas chromatography. The levels of oxidative stress and inflammatory factor biomarkers were measured using biochemical assay and ELISA kits， respectively. In addition， Western blot was used to determine the levels of β-secretase （beta-site amyloid protein precursor-cleaving enzyme 1， BACE1）， α-secretase （a disintegrin and metalloproteinase 10， ADAM10）， phosphorylated tau protein and apoptosis factors in brains.Compared with L-CON group， the rats in L-VLC group exhibited fewer platform crossings （<0.05）， and higher levels of C21：0， C22：0， C23：0， C24：0， C26：0 and ΣVLCSFA in the cerebral cortex （<0.05 or<0.01）. The levels of BACE1 and p-tau396 were increased （<0.05）， while the expression of ADAM10 decreased （<0.01）. The activity of antioxidant glutathione peroxidase （GSH-Px） was decreased （<0.01）， while the level of malonaldehyde （MDA） increased （<0.05）. The levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were increased （<0.01）. Compared with H-CON group， the rats in H-VLC group had longer escape latency （<0.05）， and higher levels of C20：0， C21：0， C22：0， C24：0， C26：0 and ΣVLCSFA in the cerebral cortex （<0.05 or<0.01）. The levels of BACE1， p-tau396 and p-tau404 were increased （<0.01）， while the expression of ADAM10 decreased （<0.01）. The activity of superoxide dismutase （SOD） and GSH-Px were decreased （<0.05 or<0.01）， while the level of MDA increased （<0.05）. The levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α were increased （<0.01）. Additionally， the level of B-cell lymphoma/leukemia-2 （Bcl-2） was decreased （<0.05）， and the levels of Bcl-2-associated X protein （Bax） and cleaved caspase-3 were increased （<0.05 or<0.01）.Intake of excessive VLCSFA in high-fat diet impairs cognitive function probably through induction of VLCSFA accumulation， amyloid precursor protein metabolism disorders， tau protein hyperphosphorylation， oxidative stress， neuroinflammation， and apoptosis.

Alzheimer disease； very-long-chain saturated fatty acids； tau protein hyperphosphorylation； oxidative stress； neuroinflammation； apoptosis

1000-4718（2023）07-1209-09

2023-03-16

2023-06-07

0373-3831188； E-mail： shrl1970@163.com

R363； R742； Q547

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.007

［基金項目］河南省科技攻關(guān)計劃項目（No. 202102310404； No. 232102310514）；河南省生物精神病學(xué)重點實驗室開放課題（No. ZDSYS2019004）；新鄉(xiāng)市科技攻關(guān)計劃項目（No. GG2019006）

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）