褪黑素對去勢小鼠椎體生物力學(xué)性能影響的研究

周永富 徐海英

骨質(zhì)疏松癥是一種由于骨代謝失衡, 致使以骨組織顯微結(jié)構(gòu)異常和骨密度降低為特征, 從而導(dǎo)致骨骼脆性增加, 并容易引發(fā)骨折的一種全身性骨代謝性疾病。骨質(zhì)疏松癥也是中老年的常見病和多發(fā)病, 根據(jù)發(fā)病性質(zhì)分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。它的防護和治療不僅需要巨大的人力和物力, 還會給家庭乃至整個社會帶來沉重的負擔［1］。據(jù)統(tǒng)計, 2010 年內(nèi), 美國50 歲以上的人群中>1/10 患有骨質(zhì)疏松癥［2］。若不采取干預(yù)措施, 未來25 年內(nèi), 全球范圍內(nèi)骨質(zhì)疏松癥患者的數(shù)量預(yù)估將增加兩倍［3］。全球每年約有8900 萬人確診有骨質(zhì)疏松性骨折, 這意味著每3 秒鐘則有一例骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生［4］。而現(xiàn)在對骨質(zhì)疏松性骨折的治療仍有諸多困難, 其總體療效難讓醫(yī)生和患者滿意。隨著全球老齡化進程加劇, 由骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折,不僅嚴重影響患者個人, 還會給醫(yī)療系統(tǒng), 甚至整個社會造成沉重負擔［5］。有研究已證明, 褪黑素能通過促進成骨細胞增殖分化, 抑制破骨細胞形成從而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用［6］。本實驗從生物力學(xué)的角度, 觀察褪黑素干預(yù)措施對去勢小鼠L3椎體生物力學(xué)性能的影響, 旨在探討并驗證褪黑素防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的療效, 報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供, 48 只9 周齡SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境：環(huán)境溫度20～25℃(恒溫), 濕度40～60%(恒濕), 光照每12 小時明暗交替。小鼠分籠飼養(yǎng), 4 只/籠, 自由飲食, 干燥飼料均按照國家嚙齒類動物喂養(yǎng)標準。

1.1.2 藥品與試劑 己烯雌酚(純度99%, 上海信誼藥業(yè)有限公司)；褪黑素(純度99%, 美國Sigma 公司),乙醇(濃度2%, 上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器 lnstron 萬能材料試驗機(美國lnstron公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及手術(shù)造模 48 只9 周齡的雌性C57BL/6J 小鼠在SPF 動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 周至12 周齡,到達性成熟后使用隨機數(shù)字表法將48 只小鼠分為假手術(shù)組(Sham 組, 12 只)和去卵巢組(36 只)。去卵巢組小鼠采取背側(cè)切口行雙側(cè)卵巢切除術(shù), 而Sham 組小鼠行雙側(cè)卵巢周圍少量脂肪組織切除術(shù)。術(shù)后更換墊料,注意保暖, 保持籠內(nèi)清潔, 觀察所有小鼠至麻醉完全清醒。所有小鼠均采用頸部皮下注射0.1%氨芐西林溶液0.2 ml/d, 術(shù)后連續(xù)給藥3 d, 并預(yù)防感染。飼養(yǎng)期間及時觀察小鼠的傷口愈合、進食和活動情況。

1.2.2 分組及藥物干預(yù) 術(shù)后1 周, 將去卵巢組36 只小鼠按體重隨機分為模型組(Control 組)、己烯雌酚組(DES 組)和褪黑素組(Melatonin 組), 每組12 只。所有小鼠自由飲食, 飼養(yǎng)標準均由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心保證。Melatonin 組小鼠以褪黑素溶液灌胃,褪黑素使用前需要溶于2%的乙醇溶液中, 按40 mg/kg的量給藥, 1 次/d；DES 組小鼠以己烯雌酚溶液灌胃,按22.5 μg/kg 的量給藥, 1 次/d；Control 組小鼠以等體積的2%乙醇溶液灌胃, 1 次/d；Sham 組以等體積的蒸餾水灌胃, 1 次/d。

1.2.3 取材 所有小鼠經(jīng)過不同方式干預(yù)后, 分別于第4、8、12 周末應(yīng)用CO2氣體窒息方法, 每組小鼠隨機處死3 只, 完整取出各組小鼠的L3椎體。用剪刀剪除L3椎體棘突及附件, 并用細砂紙將其打磨成與縱軸垂直, 并上下平面平行的高度約為5 mm 三棱柱體。制取過程中, 各標本均用生理鹽水紗布包裹, 處理結(jié)束的L3椎體標本均置于-20℃冰箱保存, 在生物力學(xué)測試前晚取出解凍。

1.2.4 椎體生物力學(xué)測試 利用Instron 萬能材料試驗機進行椎體壓縮試驗, 將4 組小鼠的L3椎體置于試驗機上, 取加載速度1 mm/min 進行測試, 增大負載至椎體破裂, 觀察受力峰值分布并記錄最大壓力負荷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷的變化分析 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷隨時間的變化均呈現(xiàn)下降的趨勢, 其中Sham 組和DES 組最大壓力負荷高于Control 組和Melatonin 組, 且曲線變化幅度稍??；Melatonin 組最大壓力負荷高于Control 組。見圖1。

圖1 各組小鼠L3 椎體最大壓力負荷的變化

2.2 第4 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第4 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為31.67 N, 小于Sham 組的35.67 N 和DES 組的36.67 N,但顯著高于Control 組的27.00 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 第4 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

2.3 第8 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第8 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為28.00 N, 小于Sham 組的32.67 N 和DES 組的33.33 N,但顯著高于Control 組的23.33 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 第8 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

2.4 第12 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第12 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為23.33 N, 小于Sham 組的29.00 N 和DES 組的29.33 N,但顯著高于Control 組的18.67 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 第12 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

3 討論

褪黑素是一種主要由腦部松果體分泌的吲哚雜環(huán)類激素, 又稱為松果體素, 在神經(jīng)保護、睡眠、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶、情緒調(diào)控和多種癌癥中發(fā)揮著有益的作用［7,8］。褪黑素主要儲存在松果體中, 但研究發(fā)現(xiàn), 如胸腺、脾臟、胃腸、睪丸、卵巢和骨髓等其他組織,也可合成并分泌褪黑素［8］。褪黑素的分泌具有晝夜節(jié)律性, 夜間高于白天, 約凌晨2:00 達到峰值；骨重建受多種激素及細胞因子調(diào)節(jié)的影響, 在骨細胞方面也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性, 夜間骨髓的褪黑素分泌水平是血漿2 倍, 骨組織在夜間生長速度最快, 進一步提示褪黑素的分泌可能與骨代謝有關(guān)聯(lián)［9］。隨著年齡增長, 褪黑素夜間分泌濃度下降, 晝夜節(jié)律變緩, 女性絕經(jīng)后夜間血漿褪黑素分泌濃度及時長均低于絕經(jīng)前［6］。

有研究報道, 骨折發(fā)生的風(fēng)險程度與夜晚工作存在相關(guān)性, Feskanich 等［10］發(fā)現(xiàn)夜晚工作經(jīng)歷超過20 年的人群, 其手腕和髖部骨折風(fēng)險程度在未來8 年中顯著升高, 推測其可能的機制是由于夜晚工作影響褪黑素分泌水平, 進而影響骨生長, 增加骨折風(fēng)險。Amstrup 等［11］通過對81 例絕經(jīng)后女性進行為期一年的高低劑量褪黑素或安慰劑治療后, 發(fā)現(xiàn)褪黑素有助于提升患者睡眠質(zhì)量, 且未影響肌肉功能, 且低劑量褪黑素治療組女性的股骨頸的骨密度增加, 高劑量治療組女性的股骨頸和脊柱骨密度增加, 提示保證良好的睡眠及褪黑素的夜間分泌水平, 有減緩骨丟失和骨質(zhì)疏松的可能。Kotlarczyk 等［12］通過對18 名圍絕經(jīng)期女性進行褪黑素和安慰劑治療半年后, 用超聲評估發(fā)現(xiàn)兩組跟骨骨密度無顯著變化和差異, 但測定骨形成標志物血清骨鈣素(OC)和骨吸收標志物尿Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基末端肽(NTX)后發(fā)現(xiàn), 褪黑素組OC/NTX 比值顯著升高, 而安慰劑組OC/NTX 比值則無顯著變化, 提示褪黑素有維持成骨細胞和破骨細胞之間的平衡的作用。

骨重建的持續(xù)及其礦化平衡的維持是維持骨骼自身結(jié)構(gòu)完整的前提, 而成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡和調(diào)節(jié), 是實現(xiàn)骨形成和骨吸收平衡的基礎(chǔ)。褪黑素不僅能通過誘導(dǎo)成骨細胞的增殖與分化, 從而促進骨形成, 而且能通過多種途徑直接或間接抑制破骨細胞的生成與活化, 減少骨質(zhì)的溶解［6］。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠通過增加骨鈣素的表達, 促進骨生成, 抑制骨質(zhì)流失, 而且能通過上調(diào)神經(jīng)肽Y 和神經(jīng)肽Y 受體Y1的表達, 促進間充質(zhì)干細胞的增殖和遷移, 從而促進骨折愈合［13］。Maria 等［14］研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對成骨細胞的誘導(dǎo)作用、骨增強作用和生活質(zhì)量的改善表明,褪黑素是一種安全有效的骨丟失治療方法。Koyama等［15］研究發(fā)現(xiàn), 藥用劑量的褪黑素能夠通過抑制破骨細胞的生成和活化, 抑制骨吸收水平, 從而提高骨量。此外, 劉俊華等［16］研究發(fā)現(xiàn), 褪黑素能夠通過Nrf-2途徑, 降低成骨細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平, 進而降低高鐵引起的成骨細胞凋亡。

本實驗中, 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷隨時間的變化均呈現(xiàn)下降的趨勢, 其中Sham 組和DES 組最大壓力負荷高于Control 組和Melatonin 組, 且曲線變化幅度稍?。籑elatonin 組最大壓力負荷高于Control 組。第4 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為31.67 N,小于Sham 組的35.67 N 和DES 組的36.67 N, 但顯著高于Control 組的27.00 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第8 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為28.00 N,小于Sham 組的32.67 N 和DES 組的33.33 N, 但顯著高于Control 組的23.33 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第12周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為23.33 N,小于Sham 組的29.00 N 和DES 組的29.33 N, 但顯著高于Control 組的18.67 N, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從生物力學(xué)的角度驗證了褪黑素對去勢小鼠骨質(zhì)疏松癥椎體能生物力學(xué)性能的影響。

綜上所述, 褪黑素能通過多種不同途徑促進成骨細胞增殖分化, 抑制破骨細胞生成活化, 從而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài), 并發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用。但目前可能需要更多的轉(zhuǎn)化研究以及實驗研究提供更多的證據(jù)支持, 以推進褪黑素在骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域的臨床應(yīng)用, 為臨床上防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥探索更優(yōu)的新方法。