化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用

＊馮 淼

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 河南 451100）

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法為借助磁場(chǎng)分離抗體以及抗原的沉淀和游離部分，針對(duì)檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行定性及定量的一種檢測(cè)方式，在臨床上也可將其稱為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定法，當(dāng)前已經(jīng)可以在心臟疾病、病毒標(biāo)志物、臨床腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病的診斷和治療當(dāng)中廣泛應(yīng)用[1]，特別是在針對(duì)甲狀腺疾病進(jìn)行診斷時(shí)，檢測(cè)內(nèi)容重點(diǎn)之一即為甲狀腺球蛋白濃度，但若僅采用常規(guī)的檢測(cè)方式，不僅假陰性和假陽(yáng)性的檢出率較高，且難以為后續(xù)的臨床治療方案設(shè)計(jì)工作提供指導(dǎo)，所以有必要針對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行深入分析。

1.化學(xué)發(fā)光免疫概述

化學(xué)發(fā)光免疫分析即為發(fā)光分析和免疫反應(yīng)結(jié)合應(yīng)用所構(gòu)建起的微量抗原以及抗體新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)，其中經(jīng)典的標(biāo)記技術(shù)為熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)，在原子中的電子或是分析吸收能量以后，電子或是原子可以由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，之后再返回到基態(tài)中，并對(duì)光子進(jìn)行釋放，技能呈現(xiàn)出發(fā)光的現(xiàn)象。其中的基本原理為針對(duì)抗原或是抗體標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物或酶標(biāo)志物，其中產(chǎn)生免疫反應(yīng)以后，將復(fù)合物置入到氧化劑或者化學(xué)發(fā)光劑中，使其發(fā)光，并對(duì)其發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)計(jì)算待測(cè)濃度。一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)使用有機(jī)化合物作為化學(xué)發(fā)光物，并借助氧化反應(yīng)促使其發(fā)光[2]。

按照分子能量來(lái)源，可以將其劃分成為光照發(fā)光、生物發(fā)光以及化學(xué)發(fā)光，并且化學(xué)發(fā)光還可被劃分成為直接和間接兩個(gè)類型。在化學(xué)反應(yīng)可以釋放充足的能量促使參與反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)入到激發(fā)態(tài)時(shí)，如果被激發(fā)的對(duì)象為反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這一過(guò)程為直接化學(xué)發(fā)光，如果激發(fā)傳遞至另一未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，促使D分子進(jìn)入到激發(fā)態(tài)，即為間接化學(xué)發(fā)光[3]。該方法自20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于臨床，當(dāng)時(shí)主要作為示蹤信號(hào)，但是因?yàn)殪`敏度較差、發(fā)光時(shí)間較短，所以應(yīng)用過(guò)程中限制較多。目前我國(guó)醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)快速發(fā)展，在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的同時(shí)，化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)且信號(hào)強(qiáng)度提升，既往存在的不足之處已經(jīng)得到顯著改善。

2.化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法屬于當(dāng)代臨床生化檢驗(yàn)工作中應(yīng)用頻率較高的一類檢測(cè)方法，可以在病毒檢測(cè)、心臟病檢測(cè)等多個(gè)方面進(jìn)行應(yīng)用，具體情況如下：

（1）腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)：機(jī)體組織及細(xì)胞內(nèi)均存在蛋白質(zhì)、酶、激素等多種腫瘤標(biāo)志物，針對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，可以為患者的早期診斷以及預(yù)后水平的監(jiān)測(cè)提供重要依據(jù)，例如，檢測(cè)鱗狀細(xì)胞癌抗原以及細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段（cy-fra21-1）濃度即可為食管癌進(jìn)行診斷和觀察病情變化，且應(yīng)用效果較好。

（2）心臟疾病的檢測(cè)：心臟病的發(fā)生與發(fā)展均與肌紅蛋白以及心肌損傷標(biāo)志物之間具有密切關(guān)聯(lián)性，所以可以針對(duì)二者進(jìn)行檢測(cè)，可以準(zhǔn)確診斷心臟疾病患者，并能夠?qū)ζ渑R床癥狀變化情況進(jìn)行準(zhǔn)確、及時(shí)的監(jiān)測(cè)。

（3）乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)：既往針對(duì)乙型病毒性肝炎患者，主要使用ELISA法進(jìn)行定性檢測(cè)，但是無(wú)法滿足臨床上的定量要求，而當(dāng)前進(jìn)行病毒感染情況判斷時(shí)，可以選擇將乙肝表面抗原（HBsAg）作為主要標(biāo)志物，以能夠同時(shí)滿足定性和定量的要求，并且相應(yīng)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較高[4]。

（4）梅毒螺旋體檢測(cè)：針對(duì)患者機(jī)體內(nèi)的非密螺旋體特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，之后還需進(jìn)行一次確證檢測(cè)，將兩次檢測(cè)結(jié)果結(jié)合應(yīng)用方可確診，臨床上實(shí)際檢測(cè)梅毒螺旋體的過(guò)程中，如果采用人工檢測(cè)的方式，不僅效率較低，且操作過(guò)程復(fù)雜，無(wú)法滿足多項(xiàng)臨床要求，而在其中使用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法，可以應(yīng)用全自動(dòng)分析儀，有效降低其中的假陽(yáng)性率，也就可以提升臨床診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用

(1)快速化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

若采用傳統(tǒng)的免疫分析方法，不僅需要耗時(shí)數(shù)個(gè)小時(shí)，且在溫育過(guò)程中，免疫試劑極易吸附于管壁上，并導(dǎo)致不同類型的測(cè)定信號(hào)之間發(fā)生交叉，接著能夠使樣品檢測(cè)通量受到限制，同時(shí)免疫分析方法的實(shí)際使用效果也能受到影響。此時(shí)可以采用外場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的方式或是有效混合溶液的方式，促使抗體、抗原等不同的生物大分子提升傳質(zhì)速率，或是促使反應(yīng)體系溫度提升，以強(qiáng)化免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，也就可以實(shí)現(xiàn)免疫檢測(cè)效率的提升[5]。

在實(shí)際應(yīng)用快速化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的過(guò)程中，可以選擇使用超聲波驅(qū)動(dòng)、改變電滲流、電磁攪拌、電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)等多種方式提升傳質(zhì)速率，特別是采用磁場(chǎng)富集與電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)相結(jié)合的方式構(gòu)建起微流控器件，并將一定的電壓施加于流通池內(nèi)，促使包含電荷的待測(cè)物逐漸移向微陣列表面，且在進(jìn)行溫育時(shí)，因?yàn)榉肿犹结樦泻写胖?，所以可以借助磁鐵將其富集于微陣列表面，整體上來(lái)看，實(shí)現(xiàn)了雙重加速，且整個(gè)過(guò)程耗時(shí)最多3min。

在進(jìn)行外力驅(qū)動(dòng)過(guò)程中，需要借助附加設(shè)備實(shí)現(xiàn)加速，例如在進(jìn)行免疫反應(yīng)時(shí)，借助附加設(shè)備將氮?dú)鈩蛩偻ㄈ氲狡渲胁⑿纬晌馀?，可以縮短溫育時(shí)間約50%，并且微氣泡加速免疫反應(yīng)措施的成本低廉、過(guò)程簡(jiǎn)潔，分析流程整體僅需耗時(shí)16min，如圖1所示[6]。

圖1 微氣泡加速化學(xué)發(fā)光免疫分析法示意圖

(2)電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（ECLI）為最近幾年受到重視的一項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)，可在物質(zhì)分析工作中作為痕量分析手段，當(dāng)前已經(jīng)能夠在臨床疾病診療或是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，發(fā)展前景良好。目前ECLI的主要生產(chǎn)廠家為瑞士羅氏公司，其中的ROCHE/2010型電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)不僅功能齊全，且操作便捷、分析靈活、穩(wěn)定性良好，同時(shí)分析速度較快，十分適合在臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

從實(shí)際上來(lái)看，電化學(xué)發(fā)光免疫分析的過(guò)程包含電化學(xué)以及化學(xué)發(fā)光兩個(gè)部分。先由電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，以針對(duì)反應(yīng)實(shí)施精準(zhǔn)的控制，使用[Ru(bpy)3]2+作為標(biāo)記物，標(biāo)記物生物分子及配體發(fā)生具有特異性的結(jié)合反應(yīng)之后，共同進(jìn)入到流動(dòng)測(cè)量室當(dāng)中，電發(fā)光過(guò)程同時(shí)被啟動(dòng)。這一過(guò)程主要可以分為以下幾個(gè)部分：①含有三丙胺（TPA）緩沖液進(jìn)入測(cè)量室，電極針對(duì)其加電；②發(fā)光劑[Ru(bpy)3]2+以及電子供體TPA各在陽(yáng)極表面失去一個(gè)電子，并且失去時(shí)間相同；③二價(jià)[Ru(bpy)3]2+經(jīng)過(guò)氧化成為三價(jià)，TPA經(jīng)過(guò)氧化成為TPA+，因?yàn)殛?yáng)離子自由基穩(wěn)定性嚴(yán)重不足，所以自發(fā)失去質(zhì)子并轉(zhuǎn)變成為自由基TPA，其還原性較強(qiáng)，能夠?qū)ν忉尫烹娮尤齼r(jià)標(biāo)記物，接收電子后可形成激態(tài)Ru2+，在熒光機(jī)制的影響之下發(fā)生衰減，后續(xù)可發(fā)出光子，光子波長(zhǎng)為620mm，并再次形成基態(tài)Ru。后續(xù)只要出現(xiàn)加電現(xiàn)象，電極表面即能持續(xù)產(chǎn)生光子，Ru濃度與光強(qiáng)度之間具有線形關(guān)系[7]。

將該方法應(yīng)用于甲狀腺腫瘤檢測(cè)工作中，甲狀腺蛋白以甲狀腺球蛋白為主要表達(dá)形式，占蛋白總量的75%左右，可作為甲狀腺激素生物合成的基礎(chǔ)。并且，受到蛋白水解酶的影響，甲狀腺激素可以脫離TG，之后釋放至血液當(dāng)中。在通常情況下，循環(huán)血中含有微量甲狀腺球蛋白，甲狀腺疾病患者、特別是甲狀腺腫瘤患者，其血液甲狀腺球蛋白濃度相對(duì)較高，甲狀腺球蛋白的半衰期通常在4～60h之間。所以，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法時(shí)患者的甲狀腺球蛋白個(gè)數(shù)以及甲狀腺球蛋白水平明顯高于放射免疫分析法檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確率均較高，所以甲狀腺腫瘤患者有必要定期檢查甲狀腺球蛋白個(gè)數(shù)以及甲狀腺球蛋白水平，以及時(shí)根據(jù)其實(shí)際情況調(diào)整治療方案[8]。

(3)多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

將多組分檢測(cè)的方式應(yīng)用于單個(gè)分析流程之中，能夠呈現(xiàn)出所需時(shí)間段、分析通量高以及樣品消耗少等優(yōu)勢(shì)，且相對(duì)其他模式來(lái)說(shuō)，分析成本也相對(duì)更低。多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析中主要包含兩種不同的檢測(cè)模式，一種是多組分同時(shí)檢測(cè)模式，另一種是順序檢測(cè)模式，前者可與陣列檢測(cè)器或是空間分辨技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，從而同時(shí)針對(duì)數(shù)個(gè)待測(cè)物開展檢測(cè)工作，后者則可在移動(dòng)固定的時(shí)間之內(nèi)針對(duì)不同的組分進(jìn)行逐一的檢測(cè)。根據(jù)最近幾年的情況來(lái)看，目前在多組分免疫分析中應(yīng)用頻率較高的多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法為安培免疫傳感器陣列，該方法同時(shí)將多通道電化學(xué)工作站和電極陣列作為基礎(chǔ)，大幅度推動(dòng)了多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展，如圖2所示[9]。

圖2 通道底物二維分辨化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析方法

例如，在應(yīng)用底物區(qū)帶分辨化學(xué)發(fā)光多組分免疫傳感系統(tǒng)的過(guò)程中，可以應(yīng)用單個(gè)分析流程針對(duì)癌胚抗原（CEA）以及癌胚抗原125（CA125）兩種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，將二者的捕獲抗體固定在經(jīng)過(guò)醛基活化處理的UltraBind膜上，形成免疫反應(yīng)器之后，將樣品、ALP標(biāo)記CEA抗體、HRP標(biāo)記CA125抗體共同注入免疫體反應(yīng)器開展在線溫育工作，經(jīng)過(guò)夾心免疫反應(yīng)后，將ALP以及HRP的化學(xué)發(fā)光底物區(qū)帶逐一通入，即可同時(shí)針對(duì)二者進(jìn)行檢測(cè)。

4.結(jié)束語(yǔ)

進(jìn)行生化檢驗(yàn)工作的過(guò)程中，可以滿足疾病標(biāo)記需求的抗原類型較少，所以應(yīng)該積極優(yōu)化生化檢驗(yàn)方法的應(yīng)用情況，也就需要注重完善以下幾項(xiàng)重點(diǎn)：

（1）進(jìn)一步提升檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏度及準(zhǔn)確性，延長(zhǎng)檢驗(yàn)下限，提升分析結(jié)果放大倍數(shù)，以不斷拓展化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法的實(shí)用性及應(yīng)用范圍。

（2）優(yōu)化化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)相關(guān)的儀器設(shè)備，促使其進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)小型化和智能化，以能夠在整體上提升化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，從而在各類疾病的診療工作中發(fā)揮更加重要的作用。