金絲桃苷對高脂飲食引起的肥胖伴胰島素抵抗小鼠的保護作用

楊 雪,魏 葉,朱心瑤,譚 偉,王曉燕,張志勇,王志榮,劉治國*

0 引言

肥胖和糖尿病的主要原因是脂質和葡萄糖代謝功能障礙。目前,全球肥胖人數(shù)超過7億人,約占全球人口的10%[1]。2021年全世界糖尿病患者共5.37億,我國約1.4億,是全球第一大糖尿病發(fā)病國家[2]。肥胖對機體胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)均有較大影響,越來越多的證據(jù)表明,肥胖會增加胰島素抵抗和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等患病風險[3-4]。治療胰島素抵抗的藥物較多,但均有一定的不良反應。因此,有必要去尋找能夠減輕體重、改善胰島素敏感性且安全性好的藥物或膳食補充劑。黃酮類天然膳食化合物因其在預防肥胖和糖尿病方面的潛力而受到關注[5]。金絲桃苷(Hyperoside,Hyp)是一種天然的、植物來源的黃酮醇苷類化合物,具有多種藥理學活性[6-8]。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠建立肥胖伴胰島素抵抗的動物模型,模擬體內高血糖、高血脂及胰島素抵抗狀態(tài)等,并觀察金絲桃苷對肥胖伴胰島素抵抗小鼠代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 普通飼料(D12450B)和高脂飼料(D12492)(Research Diets,USA);金絲桃苷(上海陶素生化科技有限公司,批號:142234);羧甲基纖維素鈉(CMC)(Sigma,USA);Merck Milliproe 液相芯片試劑盒(成都米利安生物科技有限公司);蘇木精、伊紅染液(碧云天生物技術研究所);FastQuant cDNA試劑盒與SYBR Green Master Mix(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 動物試驗 動物模型參照重慶醫(yī)科大學肖曉秋教授課題組方法[9-11]。30只健康6周齡的雄性C57BL/6小鼠[濟南朋悅試驗動物繁育有限公司,許可證號:SCXK(魯)2014-0007],適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、高脂組、金絲桃苷組,每周固定時間稱重。對照組給予普通飼料,高脂組及金絲桃苷組喂養(yǎng)高脂飼料,喂養(yǎng)14周后建模成功(n=10)。將金絲桃苷溶于0.5%CMC中制成混懸液,金絲桃苷組劑量為50 mg/(kg·d)進行灌胃,對照組和高脂組給予相應溶媒,灌胃時間為9周。動物實驗結束前1 d,小鼠過夜禁食后,腹腔注射10%水合氯醛后脫頸處死,收集血清和肝臟等組織。

1.3 血清生化及細胞因子檢測 取全血后靜置30 min,1 000 g 4 ℃離心10 min,采血清,用全自動生化分析儀檢測血糖、TC、TG、LDL、HDL等指標。使用Merck Milliplex液相芯片試劑盒檢測脂聯(lián)素和瘦素。

1.4 葡萄糖耐量實驗(GTT)和胰島素耐量試驗(ITT) 采用GTT檢測小鼠糖耐受能力。小鼠隔夜禁食8 h以上,取尾靜脈血測血糖值為G0,然后腹腔注射葡萄糖(2 mg/kg),分別在注射后15、30、60、120 min檢測血糖,計算曲線下面積(AUC)。實驗結束前1周,行ITT。小鼠禁食4 h,測得初始血糖后,按照0.5 U/kg注射胰島素,分別在注射后15、30、60、120 min時測量血糖,繪圖并計算AUC。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評估模型(HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×胰島素(μU/ml)/22.5。

1.5 實時熒光定量PCR 按照Trizol試劑盒提取總RNA,用FastQuant cDNA試劑盒獲得cDNA,用SYBR Green Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 HE染色 小鼠肝臟用4%的多聚甲醛固定后,再用石蠟包埋,切片后行蘇木精-伊紅染色(HE),在光學顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 動物模型 計算出各組小鼠的GTT曲線下面積和體重的平均值,并以對照組為基準,剔除高脂組和金絲桃苷組中低于平均值的小鼠。高脂組和金絲桃苷組小鼠GTT曲線下面積和體重均顯著高于對照組,表明動物模型建立成功。建模成功后灌胃9周。

2.2 金絲桃苷對高脂小鼠體重的影響 第14周開始給藥,給藥前高脂組和金絲桃苷組小鼠體重明顯高于對照組(P<0.05),高脂組和金絲桃苷組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。給藥1周后(第15周),金絲桃苷組小鼠體重略低于高脂組;給藥3周后(第17周),金絲桃苷組和高脂組小鼠體重比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給藥9周后(第23周),對照組和高脂組及金絲桃苷組小鼠體重差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且金絲桃苷組小鼠體重低于高脂組(P<0.05)。見表2。

表2 三組小鼠周體重比較(g)

2.3 金絲桃苷對小鼠血糖和胰島素抵抗狀態(tài)的影響 給藥5～7周后(第19～21周),GTT結果顯示,高脂組AUC高于對照組和金絲桃苷組(P<0.05),而對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1A、1B。ITT結果顯示,高脂組小鼠AUC高于對照組和金絲桃苷組(P<0.05),對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義,與空腹血糖和GTT結果一致。見圖1C、1D。給藥9周后(第23周),高脂組小鼠的空腹血糖(FBG)和胰島素抵抗(HOMA-IR)評分高于金絲桃苷組和對照組(P<0.05),而對照組與金絲桃苷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1E、21F。

圖1 金絲桃苷對小鼠血糖和胰島素抵抗狀態(tài)的影響注:A:葡萄糖耐量試驗(GTT);B:GTT曲線下面積;C:胰島素耐量試驗(ITT);D:ITT曲線下面積;E:空腹血糖;F:胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評估模型(HOMA-IR)評分。*P<0.05

2.4 金絲桃苷對肝臟脂質的影響 高脂組和金絲桃苷組小鼠的TC、TG、LDL、HDL均高于對照組(P<0.05),高脂組高于金絲桃苷組 (P<0.05)。見表3。分別取三組小鼠的肝臟進行HE染色,由圖2可見,高脂組和金絲桃苷組小鼠肝臟內脂質沉積多于對照組,而金絲桃苷組少于高脂組。

圖2 三組小鼠肝臟脂質沉積比較

表3 三組小鼠血脂指標比較(mmol/L)

2.5 金絲桃苷對脂聯(lián)素和瘦素分泌的影響 金絲桃苷組小鼠分泌的脂聯(lián)素高于對照組和高脂組(P<0.05),而高脂組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);金絲桃苷組和高脂組小鼠的瘦素高于對照組(P<0.05),金絲桃苷組高于高脂組 (P<0.05)。見表4。

表4 三組小鼠脂聯(lián)素和瘦素含量比較

2.6 金絲桃苷差異化調節(jié)肝臟內糖脂代謝相關基因 與對照組相比,高脂組小鼠肝臟內固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP1c)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)基因均明顯升高(P<0.05),而金絲桃苷組均低于對照組和高脂組(P<0.05)。高脂組腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達低于對照組(P<0.05),而金絲桃苷組AMPK基因表達高于其他組(P<0.05)。見圖3。

圖3 金絲桃苷差異化調節(jié)小鼠肝臟內基因表達注:*P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病的共同特征,且肥胖的2型糖尿病患者胰島素抵抗更明顯[12]。研究表明,肝臟脂質沉積與胰島素抵抗和葡萄糖代謝障礙密切相關[13],血脂異常的2型糖尿病患者發(fā)生血管相關并發(fā)癥的風險會進一步增加[14]。近年研究表明,天然產(chǎn)物可用于預防或治療代謝綜合征,如肥胖、2型糖尿病、血脂異常等,且安全性好[15-16]。因此,從天然產(chǎn)物中尋找藥物先導化合物或膳食補充劑來預防和治療代謝性疾病已成為目前的研究熱點。

金絲桃苷是一種天然的黃酮醇苷類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種活性。本研究顯示,高脂組小鼠體重、血糖、血脂等均明顯高于對照組,而給予金絲桃苷干預后,小鼠體重和空腹血糖明顯降低;此外,金絲桃苷可明顯降低高脂小鼠TC、TG、LDL、HDL水平;HE染色顯示,金絲桃苷能夠減輕肝臟內脂質沉積。結果表明,金絲桃苷能夠改善高脂飲食小鼠糖脂代謝紊亂狀態(tài)。

瘦素和脂聯(lián)素都是脂肪細胞分泌的脂肪因子。瘦素能夠提高胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,可通過激活AMPK來改善血脂異常[17-19]。研究表明,脂聯(lián)素是一種胰島素增敏劑,能夠促進機體對葡萄糖的利用,增加機體對胰島素的敏感性[20-21]。脂聯(lián)素可增加AMPK 的磷酸化和活化,從而促進脂肪氧化和葡萄糖轉運[22]。本研究顯示,金絲桃苷能夠降低高脂組小鼠的血糖,顯著降低小鼠HOMA-IR評分,且與GTT和ITT一致。進一步研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷能夠顯著增加脂聯(lián)素和瘦素的分泌,表明金絲桃苷可能是通過增加脂聯(lián)素和瘦素的分泌,增加葡萄糖的利用,降低血糖,改善高脂組小鼠胰島素抵抗,增強小鼠糖耐受能力。

AMPK是治療代謝性疾病的主要靶點[23]。AMPK低表達可減少脂肪酸的氧化,導致脂肪合成增加[24],而肝臟AMPK高表達可降低脂肪生成和肝臟TG含量,同時增加脂肪酸氧化相關基因的表達并促進脂肪酸的β-氧化[25]。結果顯示,金絲桃苷可促進高脂飲食小鼠AMPK的表達。SREBP1c是控制脂肪開始合成的最重要的轉錄調節(jié)因子之一[26]。酰基輔酶A羧化酶(ACC)是催化脂肪酸合成的第一個限速步驟,而脂肪酸合成酶(FAS)是負責脂肪酸從頭合成的酶,SREBP1c主要通過激活ACC和FAS來調節(jié)脂肪生成過程。研究表明,金絲桃苷能夠降低高脂飲食小鼠的TC、LDL、HDL。進一步研究顯示,金絲桃苷可抑制小鼠肝臟內SREBP1c、ACC、FAS的基因表達,表明金絲桃苷可通過減少SREBP1c、ACC和FAS的表達,抑制肝臟內的脂質合成。

綜上所述,金絲桃苷通過調節(jié)AMPK和脂質代謝相關基因,從而改善高脂飲食引起的肥胖小鼠的胰島素抵抗狀態(tài)和肝臟脂質積累,表明金絲桃苷可能是治療2型糖尿病的潛在藥物或膳食補充劑。