反向遺傳學(xué)在冠狀病毒疫苗研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用

汪夢俊 綜述，申碩 審校

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武漢 430207

冠狀病毒（coronaviruses，CoV）是人類生命健康的一大威脅，由其引起的大流行已暴發(fā)過多起，以2019 年暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）為例，因其具備極高的傳染性、致病性及變異性，對全球各國經(jīng)濟(jì)及公共衛(wèi)生安全造成了沉重的打擊，截至2023 年5 月10 日，全球由SARS-CoV-2 導(dǎo)致的死亡人數(shù)已近700萬人，與此同時，超過19種引起關(guān)切的變異株正在全球傳播，包括α、β、γ及ο等［1］。

目前，應(yīng)對SARS-CoV-2 疫情最有效的方式是通過疫苗接種建立群體免疫，阻斷或減緩病毒在人群中的傳播，降低發(fā)病率、重癥率和病死率，進(jìn)而結(jié)束病毒流行。但隨著SARS-CoV-2 變異株的不斷涌現(xiàn)而發(fā)生免疫逃逸，現(xiàn)有上市疫苗的保護(hù)效力正面臨巨大挑戰(zhàn)。新的、能夠針對變異株的疫苗急需被研發(fā)。但現(xiàn)有的疫苗研發(fā)策略均存在一些問題。以滅活疫苗為例，盡管滅活疫苗具有安全、有效、免疫原性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但疫苗的生產(chǎn)條件要求較高，且合適候選疫苗株的獲取較困難［2］。

針對目前SARS-CoV-2 疫苗研發(fā)過程中面臨的一些問題，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)是一個極具潛力的工具，與經(jīng)典遺傳學(xué)相比，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)能夠通過基因組修飾產(chǎn)生變異及重組病毒，快速、高效、定向地研究CoV 基因組不同區(qū)域或位點(diǎn)的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，獲得特定性狀的重組毒株。了解病毒的致病機(jī)理及入侵機(jī)制，可以研究特定的疫苗接種方式，從而更高效地發(fā)揮疫苗的保護(hù)效力。在對SARS-CoV-2致病機(jī)理的研究中，實驗人員利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)將SARS-CoV-2的開放閱讀框（open reading frame，ORF）7 替換為GFP 及GFP-nLuc 報告基因，通過重組病毒感染，證明了鼻腔對于SARS-CoV-2 的易感性，并推測鼻腔是介導(dǎo)病毒感染肺部的初始部位［3］，意味著鼻內(nèi)給藥可能是一種預(yù)防SARS-CoV-2 感染較為有效的方式。在另一項對貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）的研究中，實驗人員通過S 蛋白（spike protein）的替換方式構(gòu)建1 個基于血清型Ⅰ型FECV的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，拯救得到了能夠?qū)е仑埉a(chǎn)生持續(xù)性感染的重組病毒［4］，為FIPV 基因型轉(zhuǎn)換的研究提供了一個強(qiáng)有力的工具。本文現(xiàn)就目前應(yīng)用于CoV 研究中的幾種反向遺傳學(xué)技術(shù)及其可能在CoV疫苗研發(fā)中的應(yīng)用作一綜述。

1 CoV中常用的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

CoV是一種有包膜的正義RNA病毒，屬于網(wǎng)巢病毒目、CoV科病毒，具有已知RNA 病毒中最大的基因組。由于正鏈RNA 病毒基因組可直接啟動病毒蛋白翻譯以及病毒負(fù)鏈RNA 的轉(zhuǎn)錄，啟動病毒生命周期［5］。當(dāng)將包含病毒基因組全長的cDNA 修飾，制備正鏈RNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，即可獲得完整的、具有感染性的病毒顆粒，因此，CoV 是反向遺傳學(xué)研究的重要平臺。利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，能夠?qū)oV基因組進(jìn)行特定的修改，從而更好地研究病毒不同基因的生物學(xué)功能，獲得各種帶有特定性狀的重組毒株，為疫苗的研發(fā)提供更多安全、高效的途徑［6］。目前，應(yīng)用于CoV基因組的反向遺傳學(xué)技術(shù)主要有：靶向RNA重組、體外連接、細(xì)菌人工染色體系統(tǒng)（bacterial artificial chromosome，BAC）、痘病毒載體以及基于酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）的轉(zhuǎn)化相關(guān)重組（transformation-associated recombination，TAR）技術(shù)等。以下主要對這些常用技術(shù)路線進(jìn)行簡單介紹。

1.1 基于病毒RNA的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 靶向RNA重組是第一個應(yīng)用于CoV 研究的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)［7］，其主要利用在RNA 病毒復(fù)制過程中，RNA 聚合酶表現(xiàn)出的一種模板轉(zhuǎn)移機(jī)制［8］，能夠在沒有病毒感染性全長cDNA 的情況下，對CoV ORF1ab 區(qū)域以外的基因進(jìn)行操作。主要包括2 個步驟：首先，構(gòu)建1 個帶有篩選標(biāo)記的重組嵌合病毒；其次，構(gòu)建1 條帶有篩選基因的野生型對應(yīng)片段及病毒基因組中需要操作區(qū)域的片段的RNA，將其轉(zhuǎn)染至感染有嵌合病毒的細(xì)胞中，通過負(fù)篩選的方式得到引入目標(biāo)突變的重組病毒。該方案首先應(yīng)用于小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的反向遺傳學(xué)改造，后又被應(yīng)用于豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、FIPV等其他CoV的全長cDNA構(gòu)建［9-10］。但該方案在應(yīng)用時，需保留病毒本身的復(fù)制能力，因此并不能對病毒復(fù)制酶相關(guān)基因，即ORF1ab進(jìn)行操作，因此，極大地限制了其在病毒復(fù)制、毒性等研究方面的應(yīng)用［11］。有研究人員利用基于RNA 重組的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，將FIPV 的S 蛋白基因替換至MHV相應(yīng)部位，使構(gòu)建得到的重組CoV 在新的宿主細(xì)胞增殖，為減毒活疫苗及滅活疫苗的毒種研發(fā)提供了參考［12］。

1.2 基于病毒全長cDNA的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

1.2.1 基于體外線性化的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 該方案最早由ALMAZAN 等［13］在對黃熱病病毒的研究中提出，主要通過體外連接病毒基因組cDNA片段來生成全長的病毒cDNA，再以其作為模板，轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組RNA。在應(yīng)用時，通常會先分析CoV 基因組上特異的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)附近設(shè)計引物，獲得1 組覆蓋CoV 基因組全長的基因片段。同時，在5'端基因片段前端，添加連接T7 RNA聚合酶啟動子的酶切位點(diǎn)，3'端添加引入poly-A 尾巴的酶切位點(diǎn)。構(gòu)建片段時，通常會先將其克隆至不同質(zhì)粒中，以方便大量擴(kuò)增目的片段。得到目的片段后，利用限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生特異性末端，通過酶連獲得1 條包含CoV 全部基因組以及T7啟動子、poly-A 尾巴的全長cDNA［14-15］，以全長cDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出病毒基因組RNA 后轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞，即可拯救獲得目標(biāo)毒株，后續(xù)重組病毒的構(gòu)建僅需對相應(yīng)基因片段的特定位點(diǎn)進(jìn)行修改即可。另外，一項關(guān)于MHV 的研究表明，若將表達(dá)待拯救毒株N蛋白的mRNA與體外轉(zhuǎn)錄出的全長病毒RNA一同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠顯著增強(qiáng)病毒RNA 基因組的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄能力，從而有利于病毒的拯救［16］。近年來，隨著環(huán)狀聚合酶延伸反應(yīng)（circular polymerase extension reaction，CPER）技術(shù)的發(fā)展，可將帶有CMV啟動子序列片段與包含CoV 基因組的1 組片段在體外合成環(huán)狀cDNA，更快速、高效、簡便地實現(xiàn)CoV的拯救［17］。

該方案不需依賴細(xì)菌系統(tǒng)構(gòu)建病毒全長cDNA，與依賴細(xì)菌系統(tǒng)的cDNA構(gòu)建方法相比，可有效解決病毒全長cDNA 在細(xì)菌中的不穩(wěn)定性和毒性問題。同時，病毒cDNA 片段可在質(zhì)粒上進(jìn)行操作和制備，一定程度上降低了工作量及工作難度。目前，已在引起SARS-CoV、中東呼吸綜合征的冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、PEDV 和SARS-CoV-2 等冠狀病毒的感染性cDNA 的構(gòu)建中得到應(yīng)用［18-20］。以SARS-CoV-2為例，在SARS-CoV-2 暴發(fā)的第一時間，WAND 等［21］利用體外連接的策略快速獲得了病毒基因組全長cDNA，經(jīng)病毒拯救后，獲得與原始親本株有相似感染及增殖特性的拯救毒株，在通過插入nLuc以及mNeonGreen等報告基因后，作為藥物篩選及疫苗評價平臺，極大地促進(jìn)了SARS-CoV-2抗病毒藥物以及疫苗的研發(fā)。

1.2.2 基于BAC 的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 與基于體外線性化的反向遺傳學(xué)技術(shù)相比，基于BAC 的反向遺傳學(xué)技術(shù)是將獲得的包含CoV 基因組全長的DNA 片段連接至DNA 載體上。由于CoV 基因組較大，使得病毒全長cDNA在一般質(zhì)粒中難以穩(wěn)定存在，但PENZES 等［22］于2000 年在構(gòu)建TGEV 全長cDNA 的過程中即克服了這一問題。同時，通過添加大腸埃希菌F因子（fertility-factor），可嚴(yán)格控制BAC 在大腸埃希菌中的拷貝數(shù)，使得宿主細(xì)胞增殖期間，每個細(xì)胞僅保留1 ～2 個人工染色體的拷貝，極大地保證了病毒基因組全長cDNA 的穩(wěn)定性及其序列相關(guān)的宿主細(xì)胞毒性。其構(gòu)建策略主要如下：首先，通過RT-PCR 或化學(xué)合成獲得幾段帶有同源序列的DNA 片段。在病毒基因組5'端的DNA 片段通過PCR 連接添加與啟動子以及與載體質(zhì)粒連接所需的同源臂序列，3'端DNA 片段包含poly-A 尾巴以及與ABC 連接所需的同源臂序列。然后，將所有DNA 片段按特定順序連接至選定的ABC 上。最后，在T7 或CMV 啟動子的作用下，通過體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染（T7 啟動子）或直接轉(zhuǎn)染（CMV啟動子）細(xì)胞即可獲得相應(yīng)的重組病毒。

該方案的主要優(yōu)勢在于能夠穩(wěn)定插入較大DNA片段，同時，通過F 因子、獨(dú)特克隆位點(diǎn)、合適啟動子、抗性篩選標(biāo)記等的修飾，可極大地優(yōu)化病毒全長cDNA 構(gòu)建、修改、篩選以及病毒拯救的流程。構(gòu)建至相應(yīng)的質(zhì)粒載體上后，可大量獲得包含病毒全長cDNA 的載體，且后續(xù)基因修飾均可在質(zhì)粒上進(jìn)行，可加快重組病毒全長cDNA 的構(gòu)建過程。利用該方案，研究人員將PEDV 的S 蛋白進(jìn)行異源替代，產(chǎn)生的重組病毒具備與原PEDV 不同的中和特性，提示了構(gòu)建異源S 蛋白的重組腺病毒作為減毒候選疫苗株的可能性［23］。

1.2.3 基于痘病毒載體的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 基于痘病毒載體的反向遺傳學(xué)技術(shù)的主要特點(diǎn)在于選擇了痘病毒基因組作為承載病毒基因組全長cDNA 的載體。痘病毒載體是一種反向遺傳學(xué)研究的通用載體，在不影響病毒復(fù)制的前提下，能夠插入大片段的外源基因（26 000 ～31 000 bp），同時，牛痘病毒基因組穩(wěn)定，具有傳染性，可在組織培養(yǎng)中高效復(fù)制，容易得到滴度較高的毒株［13］。該方案在應(yīng)用時，首先要對痘病毒的基因組序列進(jìn)行分析，尋找可供外源cDNA 插入的限制性酶切位點(diǎn)。當(dāng)將包含CoV 全長基因組的cDNA片段插入至痘病毒基因組中后，線性化轉(zhuǎn)染BHK 細(xì)胞中，即可拯救出相應(yīng)的病毒顆粒。該方案首先應(yīng)用于HCoV-229E 全長cDNA 的構(gòu)建，隨后又在雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、MHV、SARS-CoV 和FIPV 等CoV 中得到應(yīng)用［24］。以痘病毒載體作為CoV 的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，一方面，可研究CoV 的遺傳表征，為CoV 減毒及滅活疫苗的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)；另一方面，去除CoV 必需基因后，構(gòu)建的重組痘病毒可作為候選的病毒載體疫苗，具有極廣泛的應(yīng)用前景［25］。

1.2.4 基于多質(zhì)粒載體的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 基于多質(zhì)粒載體的反向遺傳學(xué)技術(shù)主要解決了CoV 反向遺傳學(xué)研究中，由于CoV 龐大的基因組導(dǎo)致全長cDNA難以獲得以及體外轉(zhuǎn)錄相對困難的問題。其構(gòu)建步驟主要如下：首先，根據(jù)CoV 基因組特征，將其劃分為3 或多個主要片段，通過逆轉(zhuǎn)錄或體外合成等方式獲得相應(yīng)的DNA 片段；其次，將得到的片段分別連接至不同質(zhì)粒上；最后，將包含CoV 基因組不同部分的全部質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中，即可獲得相應(yīng)的病毒顆粒［26］。

該方案的主要優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)粒的構(gòu)建相對簡單，可快速獲得目標(biāo)重組病毒。且由于病毒基因組cDNA存在于不同質(zhì)粒上，操作也相對簡單。但由于無法產(chǎn)生包含病毒基因組全長的RNA，只能形成病毒顆?？諝?，無法進(jìn)行連續(xù)傳代。該方案目前已在SARSCoV-2 中成功得到應(yīng)用［27］。在對PEDV 的細(xì)胞嗜性的研究中，研究人員通過多質(zhì)粒載體的反向遺傳學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了其S 蛋白上3 個與PEDV 的Vero 細(xì)胞嗜性相關(guān)的位點(diǎn)，提示PEDV 的細(xì)胞嗜性可能與其S2亞基的剪切位點(diǎn)或RBD 的結(jié)構(gòu)有關(guān)，為CoV Vero 細(xì)胞適應(yīng)的疫苗候選株提供了理論指導(dǎo)［26］。

1.2.5 基于YAC 的TAR 克隆的反向遺傳學(xué)系統(tǒng) 病毒序列的大小限制以及不穩(wěn)定性是將CoV 基因組全長cDNA克隆至可復(fù)制載體中的主要障礙，盡管基于BAC 的策略一定程度上克服了這些問題，但部分病毒序列對于細(xì)菌的細(xì)胞毒性依然限制了部分CoV 基因組全長cDNA的構(gòu)建。與細(xì)菌相比，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對于病毒序列的細(xì)胞毒性敏感度更低［28］。此外，通過TAR 克隆技術(shù)，能夠簡單、快捷地進(jìn)行大DNA 片段的操作［29］。因此，YAC 已經(jīng)成為CoV 反向遺傳學(xué)研究中較為常用的手段。其構(gòu)建流程與基于BAC 的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)相似。首先，將待構(gòu)建的CoV 基因組劃分為幾個彼此帶有重疊區(qū)域的片段，并以病毒基因組為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR 獲得相應(yīng)的cDNA 片段。將帶有同源末端的1組cDNA片段及線性化的載體片段導(dǎo)入釀酒酵母后，通過TAR克隆即可制備包含病毒基因組全長cDNA 的人工染色體［28］。

相較于以上提到的幾種反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，基于YAC系統(tǒng)的反向遺傳學(xué)技術(shù)主要優(yōu)勢在于以下2點(diǎn)：首先，YAC 基因載量大，能夠攜帶高達(dá)300 kb的插入片段；其次，基于酵母的TAR克隆在組裝組分片段方面具有更高的效率。全長克隆可在酵母系統(tǒng)中擴(kuò)增，為進(jìn)一步研究提供了充足的材料，節(jié)省了制備體外連接片段的大量時間，并且與基于體外連接的策略相比，能夠進(jìn)行更多重組片段間的重組［30］。在大流行初期，ISENI 等［31］就基于YAC 的反向遺傳學(xué)平臺，在1 個月內(nèi)制備了SARS-CoV-2 的毒株，同時構(gòu)建了帶有標(biāo)記基因GFP的SARS-CoV-2-GFP和synSARSCoV-2-GFP，極大地推動了SARS-CoV-2 疫苗的研究進(jìn)展。

2 反向遺傳學(xué)技術(shù)在疫苗研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用

反向遺傳學(xué)能通過對CoV 基因組的定向改變，來研究相關(guān)基因的功能及其對于病毒表型、性狀的影響。通過反向遺傳學(xué)操作，可快速獲得大量的病毒資源，極大地推動CoV 重要毒力位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及對病毒作用機(jī)制的研究，從而獲得理想的減毒株來研制疫苗。與此同時，通過給病毒添加GFP 等可視化標(biāo)記，還可實現(xiàn)病毒感染的實時監(jiān)控，從而優(yōu)化病毒的細(xì)胞及動物感染模型，為相關(guān)疫苗的快速測評提供一個更為直觀、精準(zhǔn)的途徑。

2.1 減毒位點(diǎn)及Vero 細(xì)胞適應(yīng)性位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn) 首先，在對CoV 復(fù)制及致病機(jī)理有一定了解的基礎(chǔ)上，能夠?qū)oV 基因組復(fù)制或致病關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造，在不影響其免疫原性的基礎(chǔ)上，得到相應(yīng)的減毒毒株，解決疫苗生產(chǎn)過程中的安全性問題。同時，針對新出現(xiàn)的CoV 突變株，可通過相應(yīng)突變位點(diǎn)的改造，快速得到突變株的減毒毒株，應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)。其次，在減毒株骨架基礎(chǔ)上，進(jìn)一步獲得人用疫苗細(xì)胞基質(zhì)適應(yīng)性更好、滴度和產(chǎn)量更高骨架，引入新變異株的S 蛋白或與免疫逃逸相關(guān)的中和位點(diǎn)，克服新變異株適應(yīng)性弱、滴度和抗原產(chǎn)量低的困難。進(jìn)一步，利用反向遺傳學(xué)平臺，能夠?qū)oV 基因功能、蛋白結(jié)構(gòu)、免疫逃逸及致病機(jī)理等進(jìn)行更深入研究，預(yù)測未來可能出現(xiàn)的CoV 大流行，利用反向遺傳學(xué)手段，提前獲得相應(yīng)的減毒疫苗株，為CoV 的大流行做好準(zhǔn)備。

2.1.1 非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structure protein，NSP）NSP1是CoV（α 及β-CoV）感染細(xì)胞后編碼的第1 個蛋白，能夠抑制感染細(xì)胞中干擾素表達(dá)，進(jìn)而抑制機(jī)體對病毒的免疫應(yīng)答。因此，NSP1 是研究CoV 感染、復(fù)制的重要位點(diǎn)。反向遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明，當(dāng)敲除SARS-CoV-2 NSP1 的141 ～143 位氨基酸KSF 后，病毒毒力就會減弱。同時，感染細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答也會恢復(fù)［32］。

NSP2 同樣被報道與病毒復(fù)制相關(guān)。當(dāng)將MHV和SARS-CoV 中NSP2 敲除后，病毒的生長和復(fù)制將會減弱。但不同CoV NSP2 同宿主細(xì)胞的作用機(jī)制有所差異［33］。

NSP3是CoV復(fù)制／轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（replication／transcription complex，RTC）的重要組成成分，同時也是CoV中最大的多功能域蛋白。其中，木瓜樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域（papain-like protease，PLpro）、泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domains）和ADP 核酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域（ADPribose-phosphatase domains）在不同CoV 中均高度保守［34］。反向遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明，當(dāng)NSP3的環(huán)ADP酸糖蛋白水解酶活性降低后，SARS-CoV 在小鼠中的致病性將會減弱，并顯著增強(qiáng)小鼠的固有免疫反應(yīng)。同時，MHV NSP3的V787S突變也會導(dǎo)致病毒毒力減弱，并增強(qiáng)宿主的免疫保護(hù)。PEDV 和TGEV NSP3的590 ～1 215位氨基酸殘基也被證明與病毒免疫逃逸相關(guān)。NSP4 是一種與雙膜囊泡（double-membrane vesicles，DMV）形成有關(guān)的跨膜蛋白，當(dāng)研究人員將其C-末端的結(jié)構(gòu)域去除后，病毒的復(fù)制將受到影響［35］。

NSP5也稱為3CLpro（3C-like protease）或Mpro（motrypsin protease），是CoV 復(fù)制過程中1 個至關(guān)重要的酶，負(fù)責(zé)pp1a／ab上11個位點(diǎn)的酶切，由此形成12個成熟的NSPs。反向遺傳學(xué)研究表明，MHV NSP5 的T26I 和D65G 突變會使得病毒對3CL-like 蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抗性［36］。

CoV 的NSP6 與宿主細(xì)胞自噬相關(guān)，具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域。當(dāng)敲除SARS-CoV 基因組中的NSP6 后，病毒無法形成復(fù)制所必需的DMV。研究人員利用反向遺傳學(xué)驗證了MHVNSP7、NSP8 的缺失均可使得病毒無法復(fù)制，NSP9 和NSP10 缺失也會對病毒的復(fù)制產(chǎn)生影響［37］。

NSP12和NSP13是CoV RTC最核心部分，分別起到RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）和解旋酶的作用，對于病毒的復(fù)制不可或缺。CoV NSP14 具有5'→3'端的核糖核酸酶（ExoN）和N7 甲基轉(zhuǎn)移酶（N7 MTase）活性。前者與RAN聚合酶的保真性有關(guān)，被認(rèn)為是CoV保持其龐大基因組的關(guān)鍵［38-39］。

CoV 編碼的NSP15 具有核酸內(nèi)切酶活性，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。被認(rèn)為是CoV 減毒株制備的1 個關(guān)鍵位點(diǎn)。當(dāng)MHV NSP15 發(fā)生H262A突變后，NSP15 將會失活，其在小鼠模型上的致病性也大大降低，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。在PEDV中，NSP15同樣也是1個關(guān)鍵的毒力因子［40］。

NSP16具有2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性（2'-O-MTase），在CoV 中高度保守，是1 個值得注意的減毒靶點(diǎn)［41］。反向遺傳學(xué)研究證明，MHV 的D129A、SARS-CoV 的D130A、MERS-CoV的D130A和PEDV（KDKEK-AAAA）能夠使得NSP16 失活降低病毒毒力，并刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的Ⅰ型和Ⅲ型干擾素反應(yīng)。同時，NSP16 的突變體還能夠與NSP1、NSP14 或S 蛋白中的另一個突變位點(diǎn)協(xié)同作用，產(chǎn)生更穩(wěn)定的減毒株［42］。

2.1.2 主要結(jié)構(gòu)蛋白 CoV 的S 蛋白是位于病毒顆粒表面的Ⅰ類融合蛋白，由S1 和S2 2 個亞基構(gòu)成，是亞單位疫苗開發(fā)的核心分子。有研究人員構(gòu)建了2株相互交換了S基因的嵌合病毒，發(fā)現(xiàn)其中1株毒力較高，另一株無毒，證明了S基因是CoV 毒力所必需的，但不是與CoV 相關(guān)的唯一因素［43］。而另一項反向遺傳學(xué)研究以同樣的方式研究了S基因在不同代毒株P(guān)EDV 發(fā)病機(jī)制中的作用，結(jié)果表明，除S基因外，其他基因同樣會對病毒毒力造成影響［44］。而對SARS-CoV、TGEV、IBV和PEDV等CoV的研究表明，病毒顆粒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間隔室上的聚集與S 蛋白上2 個保守基序（YxxΦ 和KxHxx／KKxx）有關(guān)，研究人員將PEDV 中這2 個保守基序缺失或突變后發(fā)現(xiàn)，YxxΦ 基序（YEVF 或YEAF）觸發(fā)S 蛋白的內(nèi)吞作用，KVHVQ 基序參與了病毒復(fù)制過程中，S 蛋白與宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的相互作用；這2個基序的缺失顯著增強(qiáng)了Vero 細(xì)胞中合胞體的形成，并降低了毒株的毒力［45］。

CoV 的E 蛋白是CoV 主要結(jié)構(gòu)蛋白中最小的蛋白質(zhì)，參與了CoV 的組裝、出芽和致病等過程。E 蛋白的缺失會使得病毒的復(fù)制效率和毒力顯著降低，但仍能形成具有感染性的病毒顆粒。而對MERSCoV 和TGEV 的反向遺傳學(xué)研究表明，E基因缺失后，在正常細(xì)胞中不能拯救病毒的全長cDNA，但能夠在E蛋白表達(dá)的細(xì)胞間傳播［46-48］。

M 蛋白也是病毒顆粒組裝所需的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可與E蛋白和S蛋白共同形成完整的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）。SARS-CoV M 蛋白的兩端多肽均具有免疫原性［26］，但其所引起的免疫保護(hù)效力還有待進(jìn)一步探討。有研究表明，CoV 的M 蛋白也能夠抑制宿主細(xì)胞干擾素的產(chǎn)生。而MERS-CoV的M 蛋白能夠通過抑制RF3的BK1依賴的磷酸化來抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生［49］。

CoV 的N 蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮著多種功能，包括調(diào)節(jié)病毒RNA合成、核衣殼形成以及病毒組裝等。N 蛋白的表達(dá)對于從感染性cDNA 中回收病毒是必要的。N 蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)研究人員利用重組病毒MVA-MERS-N 免疫小鼠后，小鼠能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的T 細(xì)胞免疫，保護(hù)小鼠免受MHV 致命感染［50］。而SARS-CoV N 蛋白的1 ～422 位氨基酸殘基片段和110 ～422 位氨基酸殘基片段能夠在小鼠中產(chǎn)生特異性抗原，并與SARS康復(fù)患者血清發(fā)生反應(yīng)［51］。SARS-CoV 的N 蛋白還是一種干擾素拮抗劑，通過抑制IRF-3和NF-κB抑制干擾素合成，干擾TRIM25介導(dǎo)的RIG-I泛素化或減弱PTAC介導(dǎo)的RIG-I／MDA5激活［24］。

2.1.3 輔助蛋白 CoV 的輔助蛋白在病毒致病過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，從MERS-CoV 中刪除ORF3 和ORF5、從SARS-CoV 中刪除ORF8 均不會影響病毒復(fù)制，但會減弱病毒毒力［52-53］。由于CoV 的輔助蛋白不會影響病毒復(fù)制，也常作為外源基因插入的靶點(diǎn)。值得注意的是，一些輔助蛋白被認(rèn)為具有離子通道活性，并與宿主細(xì)胞的固有免疫相關(guān)，可能能夠幫助病毒逃避宿主細(xì)胞的免疫監(jiān)視，并增強(qiáng)病毒毒力［54-55］。因此，輔助蛋白缺陷的CoV 被認(rèn)為是CoV減毒株制備的重要策略。

2.2 其他 反向遺傳學(xué)技術(shù)還能夠應(yīng)用于建立病毒感染模型以及疫苗評價。有研究人員利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將PEDV 基因組中的ORF3替換為紅色熒光素蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因，獲得1 株能夠在體內(nèi)外有效復(fù)制，并介導(dǎo)仔豬發(fā)病的重組毒株icPEDV-ΔORF3-RFP，為對該病毒發(fā)病機(jī)制、嗜性、中和抗體以及疫苗保護(hù)評估的研究提供了一個安全、高效的平臺［56］。

3 小結(jié)與展望

CoV 已經(jīng)多次跨越物種屏障，其中一些獲得了人際間傳播的能力，其中對人類生命健康具有嚴(yán)重威脅的主要包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。此外，已知其他4 種CoV 會感染人類導(dǎo)致輕微疾病，包括人CoV-229E（HCoV-229E）、人CoV-NL63（HCoVNL63）、人CoV-OC43（HCoV-OC43）、人CoV-HKU1（HCoV-HKU1）。蝙蝠通常被認(rèn)為是一系列CoV 的天然宿主［56］。一些蝙蝠CoV 也有可能出現(xiàn)在人類群體中，如馬蹄蝠中的SARS-like病毒SHC014-CoV［57-58］。反向遺傳學(xué)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對CoV 基因組的直接操作，通過相關(guān)位點(diǎn)突變、敲除或重排等，均有可能獲得理想的、用于CoV 疫苗生產(chǎn)的疫苗株，與此同時，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，還能夠?qū)oV-宿主相互作用、宿主免疫反應(yīng)和病原體免疫逃避策略進(jìn)行更深入的研究。如探究CoV 感染期間受影響的宿主細(xì)胞途徑，確定能夠抑制宿主先天免疫的CoV 蛋白和特定的信號途徑等。將反向遺傳學(xué)與基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)相結(jié)合，有助于描述出目前的CoV 種群，預(yù)測可能出現(xiàn)的人畜共患病CoV，為未來的CoV暴發(fā)做好準(zhǔn)備，促進(jìn)針對CoV感染的防治策略的發(fā)展。