基于lncRNA DGCR5介導(dǎo)miR-1180/SFRP1/Wnt通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響*

陳茂良，單漢國(guó)

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 胃腸外科，湖南 衡陽 421001）

結(jié)直腸癌（CRC），是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率隨著人們生活方式的改變而出現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)［1］。CRC 是指發(fā)生在結(jié)腸與直腸任意部位的癌癥，但多以直腸與乙狀結(jié)腸這兩個(gè)部位常見［2-3］。由于民眾體檢意識(shí)不強(qiáng)、早期臨床表現(xiàn)不明顯等，目前確診的CRC 多為中晚期，此時(shí)的癌癥細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲能力，CRC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一［4-5］。目前CRC 西醫(yī)治療以手術(shù)切除+輔助化療為主，具有較好的效果，但化療為長(zhǎng)期治療，藥物毒副作用長(zhǎng)期累加致使患者生活質(zhì)量與治療依從性明顯降低。有研究證明［6-7］經(jīng)治療后的患者仍有20%～30%的可能出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)的情況，且患者5 年內(nèi)死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率較高。因此，針對(duì)CRC 早期的診斷、尋找新的治療方法或藥物一直是臨床工作的重點(diǎn)。

目前多項(xiàng)研究證明了SFRP1/Wnt 通路、miR-1180 和lncRNA DGCR5 參與多種腫瘤的病理過程，并且SFRP1/Wnt 通路已被證明與CRC 具有相關(guān)性［8］。而miR-1180 與lncRNA DGCR5 在CRC 中雖無相關(guān)研究，但是已被證明在其他多種腫瘤細(xì)胞中具有重要的作用［9-10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)lncRNA DGCR5 能夠靶向miR-1180，而miR-1180 能夠調(diào)節(jié)SFRP1/Wnt 通路影響腫瘤病理進(jìn)程。因此，本研究探析lncRNA DGCR5 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的影響，并分析lncRNA DGCR5 是否通過調(diào)控miR-1180/SFRP1/Wnt 通路來發(fā)揮作用，以為臨床診治CRC 提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

選取人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480，使用RPMI 1640+10%FBS+1% 雙抗培養(yǎng)，于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。將載體DGCR5 NC、DGCR5 mimic 及DGCR5 inhibitor 和轉(zhuǎn)染試劑如Lipofectamine 2000分別加入Opti-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基互相混合，靜置15 min。靜置時(shí)間內(nèi)細(xì)胞吸去含血清培養(yǎng)基，PBS清洗一遍，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將載體和轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入細(xì)胞，饑餓培養(yǎng)6 h。細(xì)胞更換成完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染情況將SW480細(xì)胞分為對(duì)照組（C 組，正常培養(yǎng)SW480 細(xì)胞）、DGCR5 NC 組（SW480 細(xì)胞+轉(zhuǎn)染DGCR5 NC 載體）、DGCR5 mimic 組（SW480 細(xì)胞+轉(zhuǎn)染DGCR5 mimic 載體）以及DGCR5 inhibitor 組（SW480 細(xì)胞+轉(zhuǎn)染DGCR5 inhibitor 載體）。

1.2 qPCR 檢測(cè)DGCR5 表達(dá)水平

Trizol 法提取SW480 細(xì)胞RNA，RNA 沉淀使用適量的RNase-free 水溶解，通過儀器檢測(cè)RNA濃度和純度（OD260/OD280），然后使用甲醛變性膠電泳觀察RNA 的降解情況，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)DGCR5 引物，最后按照qPCR 試劑盒說明書，配置反應(yīng)體系，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞增殖

1.3.1 CCK8 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，消化離心后培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至5×103/100 μL，96 孔板每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，24 h 后每孔加入10 μL CCK8 孵育4 h，搖床低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀OD450 nm 檢測(cè)各孔的吸光值。

1.3.2 克隆形成試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，消化離心后培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后，分別在培養(yǎng)皿中以50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度密度接種，培養(yǎng)3 周左右。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，使用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，吸去固定液，加適量Giemsa 染液染色10～30 min，流水緩慢沖洗。干燥后將平皿倒置，疊加帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計(jì)數(shù)克隆或低倍鏡計(jì)數(shù)大于10 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡

1.4.1 TUNEL 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染處理。細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定約1 h，PBS 清洗一遍，加入0.1% Triton X-100 冰浴2 min。PBS清洗兩遍，滴加TUNEL 檢測(cè)液37℃避光孵育1 h。PBS 清洗三遍，最后加抗熒光淬滅劑封片觀察。

1.4.2 Western Blot（WB）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染處理后，吸去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS 清洗一遍。加入蛋白裂解液冰上充分裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，超聲處理，離心取上清。BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，調(diào)整蛋白濃度一致，加入SDS 煮蛋白使其變性。取30 左右總蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，配置DGCR5、β-catenin 和Wnt 蛋白一抗，4 度孵育過夜。TBST 搖床洗膜3×10 min，使用對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1～1.5 h，TBST 搖床洗膜3×10 min，ECL 曝光，根據(jù)目的蛋白/內(nèi)參蛋白評(píng)價(jià)蛋白的表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞遷移

1.5.1 劃痕實(shí)驗(yàn) SW480 細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理后，使用槍頭在6 孔板底部進(jìn)行“十”字型劃痕。吸去培養(yǎng)基，PBS 沖洗劃痕時(shí)脫落的細(xì)胞，重新加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每6 小時(shí)拍照，根據(jù)劃痕區(qū)域的細(xì)胞面積判斷遷移能力。

1.5.2 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 配置BD Matrigel TM基質(zhì)膠，使用無血清培養(yǎng)基稀釋，后將稀釋液加入Transwell 小室插件中，使其均勻分布在上室底面。待基質(zhì)膠凝固后，在上室加入細(xì)胞懸液，在下室中加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后取出小室插件，棉簽輕輕擦去Transwell 小室內(nèi)側(cè)面細(xì)胞，PBS 清洗兩遍。使用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色，PBS 液洗去多余結(jié)晶紫，自然干燥后小室插件在顯微鏡下拍照，進(jìn)入下室的細(xì)胞量可以反映細(xì)胞穿過基質(zhì)膠（細(xì)胞外基質(zhì)）的能力，即侵襲能力。

1.6 lncRNA DGCR5 與miR-1180 的靶向關(guān)系

1.6.1 預(yù)測(cè)靶向關(guān)系 通過miRanda、Targetscan等生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)lncRNA DGCR5 與miR-1180 的靶向關(guān)系。

1.6.2 熒光素酶報(bào)告基因 設(shè)計(jì)miR-1180 野生型和突變體引物。提取SW480 細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴(kuò)增miR-1180-wt/mut 片段。膠回收目的基因片段，構(gòu)建miR-1180-wt/mut 載體。將miR-1180-wt/mut 載體分別與DGCR5 過表達(dá)和干擾載體及空載體共轉(zhuǎn)染6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.6.3 qPCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，經(jīng)DGCR5 過表達(dá)和干擾載體及空載體轉(zhuǎn)染處理后，收集細(xì)胞。Trizol 法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)miR-1180 引物，qPCR 檢測(cè)miR-1180 的表達(dá)，方法同上。

1.7 SFRP1/Wnt 通路檢測(cè)

1.7.1 WB 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染處理后，提取蛋白。通過WB 檢測(cè)Wnt、β-catenin和SFRP1 蛋白表達(dá)水平，方法同上。

1.7.2 qPCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染處理后，收集細(xì)胞。Trizol 法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)miR-1180 引物，qPCR 檢測(cè)SFRP1的表達(dá)，方法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與畫圖。多組間計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后lncRNA DGCR5 的表達(dá)（qPCR）

qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與DGCR5 NC 組比較，DGCR5 inhibitor 組細(xì)胞的lncRNA DGCR5 表達(dá)水平下降（P＜0.05）；DGCR5 mimic 組細(xì)胞的lncRNA DGCR5 表達(dá)水平顯著高于DGCR5 NC 組與DGCR5 inhibitor 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組SW480 細(xì)胞的lncRNA DGCR5 表達(dá)水平

2.2 lncRNA DGCR5 對(duì)SW480 細(xì)胞活力及增殖的影響

2.2.1 CCK8 法檢測(cè)lncRNA DGCR5 對(duì)SW480細(xì)胞活力 CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與DGCR5 NC 組比較，DGCR5 mimic 組細(xì)胞相對(duì)增值率顯著降低；DGCR5 inhibitor 組細(xì)胞相對(duì)增值率顯著高于DGCR5 NC 組與DGCR5 mimic 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組SW480 細(xì)胞增值能力的比較

2.2.2 克隆形成檢測(cè)lncRNA DGCR5 對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響 克隆形成檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)lncRNA DGCR5 后SW480 細(xì)胞的克隆數(shù)目顯著低于C 組與DGCR5 NC 組，下調(diào)lncRNA DGCR5 后SW480 細(xì)胞的克隆數(shù)目顯著高于C 組與DGCR5 NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此推測(cè)lncRNA DGCR5 在體外具有抑制CRC 細(xì)胞增殖的能力。見圖3。

圖3 上調(diào)或下調(diào)lncRNA DGCR5 對(duì)SW480 細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 lncRNA DGCR5 對(duì)SW480 細(xì)胞遷移及侵襲的影響

2.3.1 各組SW480 細(xì)胞遷移能力比較 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力結(jié)果顯示，與C 組、DGCR5 NC組比較，DGCR5 mimic 組細(xì)胞愈合率顯著降低，DGCR5 inhibitor 組細(xì)胞愈合率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組SW480 細(xì)胞遷移能力對(duì)比

2.3.2 Transwell 法檢測(cè) lncRNA DGCR5 對(duì)SW480 細(xì)胞侵襲的影響 Transwell 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與C 組、DGCR5 NC 組比較，DGCR5 mimic組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低，DGCR5 inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)量提高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組SW480 細(xì)胞侵襲能力比較

3 lncRNA DGCR5 與miR-1180 的靶向關(guān)系

熒光酶素報(bào)告結(jié)果顯示，SW480 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-1180-wt 和DGCR5 mimic 后細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-1180-wt 與DGCR5 NC的細(xì)胞組（P＜0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-1180-wt 與DGCR5 inhibitor 的SW480 細(xì)胞組相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于共轉(zhuǎn)染miR-1180-wt 與DGCR5 NC 的細(xì)胞組（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染miR-1180-mut 和DGCR5 NC、共轉(zhuǎn)染miR-1180-mut 和DGCR5 mimic 與共轉(zhuǎn)染miR-1180-mut 與DGCR5 inhibitor 的三組W480細(xì)胞組間相對(duì)熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 熒光酶素報(bào)告驗(yàn)證lncRNA DGCR5 與miR-1180 的靶向關(guān)系

4 lncRNA DGCR5 可介導(dǎo) miR-1180/SFRP1/Wnt 通路的表達(dá)

qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，上調(diào)SW480 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DGCR5 的表達(dá)可使miR-1180、Wnt 表達(dá)水平明顯降低，SFRP1 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；下調(diào)SW480 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DGCR5 的表達(dá)可使miR-1180 及Wnt 表達(dá)水平明顯升高；SFRP1 水平降低（P＜0.05）。進(jìn)一步WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)lncRNA DGCR5 后Wnt 及β-catenin 蛋白的表達(dá)均明顯下降，SFRP1 蛋白表達(dá)上升（P＜0.05）；下調(diào)lncRNA DGCR5 后Wnt 及β-catenin 蛋白的表達(dá)均明顯上升，SFRP1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。由此筆者推測(cè)lncRNA DGCR5 在CRC 細(xì)胞中能夠通過調(diào)控miR-1180/SFRP1/Wnt 通路的表達(dá)，來抑制癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。見圖7。

圖7 lncRNA DGCR5 介導(dǎo)miR-1180/SFRP1/Wnt 通路

5 討論

有數(shù)據(jù)調(diào)查顯示［12］，得益于CRC 診治、預(yù)防技術(shù)的發(fā)展，近年來早期CRC 患者的生存率有了明顯的提高，但晚期CRC 患者由于多數(shù)存在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，其10 年及以上的生存率仍相當(dāng)不理想。因而尋找新的CRC 生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

lncRNAs 已被證實(shí)在癌癥細(xì)胞的增殖、自噬、轉(zhuǎn)移、侵襲等致病過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［13］。lncRNA DGCR5 是一種腫瘤抑制因子，有研究表明其與肺癌［14］、甲狀腺癌［15］、肝癌［16］、膀胱癌［17］等多種癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。但lncRNA DGCR5 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示上調(diào)lncRNA DGCR5 的表達(dá)后，CRC 細(xì)胞的增殖能力降低，下調(diào)lncRNA DGCR5 的表達(dá)后，CRC 細(xì)胞的增殖能力升高（P＜0.05）。而上調(diào)lncRNA DGCR5 后，細(xì)胞的愈合率及侵襲能力均明顯下降，而下調(diào)后細(xì)胞的愈合率及侵襲能力提高（P＜0.05）。這提示CRC 細(xì)胞內(nèi)lncRNA DGCR5 的表達(dá)能夠影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲能力。

lncRNA 通常作為內(nèi)源性RNA 與微小RNA（miRNA）結(jié)合，通過降低組織細(xì)胞中miRNA 豐度來抑制mRNA 翻譯及兩者的結(jié)合，提高miRNA靶蛋白的表達(dá)，從而在癌癥細(xì)胞的致病過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［18-19］。如lncRNA DGCR5 可通過靶向抑制miR-22-3p 來促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展［20］；lncRNA DGCR5 還可通過調(diào)控miR-21 來促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖、轉(zhuǎn)移［21］。Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在癌癥細(xì)胞的生存與增殖中具有重要作用，有研究［22］表明，在90%以上的CRC 中存在著Wnt/β-catenin 通路的異常激活。此外，另有研究證明lncRNA DGCR5 亦可靶向miR-1180 參與調(diào)節(jié)肺癌的增殖、遷移和侵襲，而miR-1180 已被證明能夠調(diào)節(jié) SFRP1/Wnt 途徑。目前關(guān)于lncRNADGCR5 與CRC 的研究尚無報(bào)道，因此，筆者猜測(cè)lncRNA DGCR5 可能通過靶向miR-1180調(diào)控SFRP1/Wnt 通路影響CRC 的病理變化。

本研究通過熒光酶素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-1180 是lncRNA DGCR5 的靶向基因，上調(diào)lncRNA DGCR5 的表達(dá)能夠抑制miR-1180 的表達(dá)，而抑制lncRNA DGCR5 后，SW480 細(xì)胞中miR-1180 的表達(dá)量明顯提高。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lncRNA DGCR5 表達(dá)致使miR-1180 表達(dá)量下降之后，miR-1180 調(diào)節(jié)的SFRP1/Wnt 途徑的相關(guān)基因的表達(dá)量亦有所變化，其對(duì)應(yīng)的SFRP1 mRNA與蛋白表達(dá)量明顯升高，Wnt mRNA 與蛋白表達(dá)量和β-catenin 蛋白表達(dá)降低。反之下調(diào)lncRNA DGCR5 可使miR-1180 的表達(dá)量升高，其對(duì)應(yīng)的SFRP1 mRNA 與蛋白表達(dá)降低，Wnt mRNA 與蛋白表達(dá)量和β-catenin 蛋白表達(dá)升高。進(jìn)一步說明調(diào)控lncRNA DGCR5 表達(dá)能夠有效地抑制CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)，還可通過抑制Wnt/β-catenin 通路來阻斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上，miR-1180 是DGCR5 的靶基因，抑制或促進(jìn)DGCR5 的表達(dá)能夠有效地降低或提高miR-1180 的表達(dá)水平。DGCR5 可通過靶向miR-1180調(diào)控SFRP1/Wnt 通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲的抑制或促進(jìn)。這提示DGCR5/miR-1180有望成為治療CRC 的潛在靶點(diǎn)。