對肥胖小鼠血漿外泌體miRNA表達譜的分析及聯(lián)合超聲生物顯微鏡評價肥胖小鼠左室心肌收縮功能障礙的效果

馬 鑫，徐 靜，劉羅娜，王 琴*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心功能檢查部，寧夏 銀川 750004 ；2.山東省立第三醫(yī)院，山東 濟南 250000；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004）

肥胖是冠心病等心血管疾病的重大獨立危險因素，是全球性的公共健康問題，已經(jīng)給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)[1]。防治肥胖引起的心臟病已經(jīng)成為亟待解決的重大健康問題[2]。有研究指出，肥胖患者在早期就會表現(xiàn)出心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[3]。然而常規(guī)超聲技術(shù)常常無法檢測出肥胖早期左室心肌功能的亞臨床改變，不能精確評估肥胖心臟功能障礙，并且臨床上對于肥胖所致心臟功能改變的機制尚不清楚，因此對肥胖早期心肌損傷尚無良好的診斷方法與治療方案。外泌體(Exosomes) 是機體被激發(fā)或發(fā)生損傷時產(chǎn)生的30 ～150 nm 的囊泡狀物質(zhì)，其中包含多種蛋白質(zhì)、非編碼RNA 等[4]。有研究指出，外泌體內(nèi)含有大量的microRNA、lncRNA、circRNA 等非編碼RNA，并且可以傳送到受體細(xì)胞，進而發(fā)揮一定的生物學(xué)效用[5]。因此探究外泌體在心血管疾病發(fā)展過程中的作用具有重要的臨床意義。本文主要是采用超聲顯微鏡心肌應(yīng)變技術(shù)檢測肥胖小鼠左心室收縮功能的亞臨床改變，應(yīng)用芯片測序等方法觀察肥胖小鼠與正常小鼠心臟miRNA 表達的差異，探討差異表達miRNA在肥胖心肌受損發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇20 只6 周大的雄性C57BL/6 小鼠（體重20 ～30 g），喂食高脂肪飲食。選擇10 只體重和Lee指數(shù)大于對照組平均值±1.5 倍標(biāo)準(zhǔn)差的肥胖小鼠模型作為肥胖組，將其余10 只與肥胖組年齡和性別相同的C57BL/6 小鼠作為對照組。涉及這些動物的操作得到了寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 超聲生物顯微鏡檢測

將小鼠用2% 異氟醚麻醉，仰臥位固定在恒溫平臺上，四肢固定在ECG 電極上進行ECG 記錄。在成像前使用化學(xué)脫毛劑去除胸毛，并在麻醉開始后和心率穩(wěn)定時收集超聲心動圖數(shù)據(jù)。采用超聲生物顯微鏡動態(tài)觀察小鼠的左心室超聲生物學(xué)變化，包括形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)、功能和應(yīng)變的變化。形態(tài)學(xué)改變包括左室間隔厚度和左室內(nèi)徑，以M 型超聲測量左室間隔厚度、左室后壁厚度、左室收縮末期內(nèi)徑（Ds）和左室舒張末期內(nèi)徑（Dd），用Teichholtz 校正公式計算左室射血分?jǐn)?shù)（EF）。在乳頭肌的短軸部分測量徑向和周向應(yīng)變，用軟件自動跟蹤心內(nèi)膜以生成整體心肌應(yīng)變曲線，進而導(dǎo)出每個部分的心肌應(yīng)變參數(shù)。

1.3 外泌體提取與鑒定

取兩組小鼠的血液10 ～15 mL，加入15 mL 無酶離心管中，以3000 rpm 室溫離心10 min ；將上清液倒入50 mL 的離心瓶中，放入落地式離心機中，在4 ℃下以16 000 g 離心30 min ；最后在冰上用50 μL的甲基纖維素液處理10 min。調(diào)節(jié)合適的焦距及亮度并拍照。使用納米顆粒跟蹤分析儀對外泌體顆粒的直徑進行測量。

1.4 miRNA 測序

對于外泌體的miRNA 進行測序（miRNA-seq），采用LC Sciences（美國）進行標(biāo)記miRNA-seq 文庫的制備、測序和下一代測序（NGS）數(shù)據(jù)的分析。利用Illumina Hiseq 2500 SE50 平臺對該文庫進行測序。使用讀取次數(shù)高于數(shù)據(jù)集平均拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)來篩選高水平miRNA。將R 軟件包multiMiR（版本3.12）用于miRNA 靶掃描和預(yù)測，并使用R 軟件包clusterProfiler 對靶基因進行聚類分析?？俁NA用TRIzol 試劑（日本Takara 9109）進行分離。該文 庫 用Illumina NovaSeq 6000 PE150 測 序。應(yīng) 用|logFC| ＞1 和P＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達的基因?；虮倔w論（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）的分析采用R 軟件包clusterProfiler 進行。結(jié)果用GO plot 進行可視化。

1.5 心肌冰凍切片免疫熒光染色

進行冷凍切片復(fù)溫，以4% 多聚甲醛進行固定。固定后，切片可在4 ℃的PBS 中儲存3 個月。使用封閉溶液封閉細(xì)胞。進行一級抗體結(jié)合，在室溫下培養(yǎng)過夜。以PBST 沖洗3 次。進行二級抗體結(jié)合，在室溫下避光培養(yǎng)。以PBST 沖洗3 次。加入1 滴封閉劑，密封載玻片，并用熒光顯微鏡檢查。

2 結(jié)果

2.1 超聲生物顯微鏡檢查結(jié)果

二維超聲參數(shù)比較：對照組與肥胖組的左室收縮末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；肥胖組的左室間隔厚度、左室后壁厚度、左室舒張末期內(nèi)徑均大于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。超聲生物顯微鏡二維斑點追蹤技術(shù)測量結(jié)果顯示，對照組和肥胖組的長軸應(yīng)變、徑向應(yīng)變、圓周應(yīng)變參數(shù)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肥胖組的長軸應(yīng)變、徑向應(yīng)變參數(shù)均低于對照組，肥胖組的圓周應(yīng)變參數(shù)高于對照組。見表2。

表1 一般資料與二維超聲參數(shù)的分析（± s）

表1 一般資料與二維超聲參數(shù)的分析（± s）

注：*相較于對照組，P ＜0.05。

參數(shù) 對照組 肥胖組初始體重(g) 21.93±1.20 21.46±1.14最終體重(g) 31.15±2.17 36.19±3.66*左室間隔厚度(mm) 0.60±0.037 0.71±0.044*左室后壁厚度(mm) 0.62±0.053 0.72±0.033*左室舒張末期內(nèi)徑(mm) 4.3±0.30 4.6±0.31*左室收縮末期內(nèi)徑 (mm) 2.8±0.30 2.8±0.29左室射血分?jǐn)?shù)(%) 70.05±4.75 70.15±4.55

表2 二維斑點追蹤技術(shù)數(shù)據(jù)分析（± s）

表2 二維斑點追蹤技術(shù)數(shù)據(jù)分析（± s）

注：*相較于對照組，P ＜0.05。

應(yīng)變參數(shù) 對照組 肥胖組長軸應(yīng)變 22.04±2.89 7.35±1.3*徑向應(yīng)變 23.49±3.08 16.00±2.11*圓周應(yīng)變 20.10±2.00 29.84±2.67*

2.2 心肌冰凍切片免疫熒光染色

NLRP3 抗體免疫熒光染色顯示，肥胖組NLRP3的表達明顯增多。

2.3 血漿外泌體miRNA 的測序和生物信息學(xué)分析

對原始數(shù)據(jù)進行過濾和質(zhì)檢后，對并集差異miRNA 進行層次聚類分析。兩組樣本間共檢測到455 個差異表達的miRNA，肥胖小鼠與正常小鼠相比有124 個下調(diào)，331 個上調(diào)。為了繼續(xù)探究肥胖小鼠與正常小鼠差異miRNA 的功能，使用GO 和KEGG數(shù)據(jù)庫對這些靶基因進行了功能和通路富集分析，有效富集的篩選標(biāo)準(zhǔn)為Q value ≤0.05。對靶基因的GO 富集分析分為細(xì)胞組分、分子功能和生物進程三類。在生物過程富集中，這些基因主要參與細(xì)胞代謝、增殖和死亡等過程。它們的分子功能富集在轉(zhuǎn)錄活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性調(diào)節(jié)上。同時，對這些靶基因參與的信號通路進行了KEGG Pathway 注釋分類。在生物進程中，這些靶基因主要參與生物過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，調(diào)控細(xì)胞的生長和死亡，運輸和代謝。在細(xì)胞成分中，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)占主要部分。在分子功能上，主要功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合及核苷酸結(jié)合。另外，差異表達miRNA 靶基因在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多個系統(tǒng)都有富集。值得注意的是，NF-κB 是肥胖小鼠血漿外泌體中表達升高較為顯著的信號通路之一，其與炎癥小體NLRP3 的水平、肥胖心臟內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

3 討論

本項研究中，我們采用C57BL/6 小鼠建立了肥胖模型。C57BL/6 小鼠予以高脂喂養(yǎng)后，可導(dǎo)致肥胖相關(guān)代謝異常，引起心肌損傷，如果不及時進行干預(yù)可使其發(fā)展至心力衰竭階段，這與肥胖人群心肌疾病發(fā)生的規(guī)律十分相似。研究中發(fā)現(xiàn)肥胖組小鼠的心肌明顯增厚。有研究表明，室間隔明顯增厚是心臟發(fā)生重塑最為敏感的觀察指標(biāo)[6-10]。二維斑點追蹤技術(shù)克服了心肌角度依賴性，可以提供多方向的心肌形變信息。心肌應(yīng)變參數(shù)是評估心室整體或局部功能的有效指標(biāo)。與短軸應(yīng)變參數(shù)的變化相比，縱向應(yīng)變參數(shù)與血流動力學(xué)改善的關(guān)系更為密切。此指標(biāo)與心臟重塑密切相關(guān)。在本研究中，雖然肥胖小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)正常，但二維斑點追蹤超聲心動圖（2D-STE）已經(jīng)檢測到其早期的左室心肌收縮功能障礙。本試驗提取兩組血液進行測序發(fā)現(xiàn)，兩組樣本間有455 個差異表達的miRNA，肥胖小鼠與正常小鼠相比有124 個下調(diào)，331 個上調(diào)。使用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對這些靶基因進行功能和通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要參與細(xì)胞代謝、增殖和死亡等過程。它們的分子功能富集在轉(zhuǎn)錄活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性調(diào)節(jié)上。同時，對這些靶基因參與的信號通路進行了KEGG Pathway 注釋分類。其中NF-κB 信號通路是肥胖小鼠血漿外泌體中表達升高較為顯著的信號通路之一。有研究表明，NF-κB 是炎癥反應(yīng)的“總開關(guān)”，NLRP3 炎癥小體的激活受到NF-κB 的嚴(yán)格調(diào)控。在本研究中，與對照組小鼠相比，NLRP3 在肥胖組小鼠的左室心肌中的表達顯著增強。有研究指出，NLRP3 炎癥小體與細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺增加的脂毒性相關(guān)，其可在巨噬細(xì)胞和脂肪組織中誘導(dǎo)caspase-1 的裂解。在肥胖的嚙齒類動物模型中，caspase-1 信號通路和纖維化信號通路的顯著增強與左室功能的顯著降低相關(guān)。進一步明確心肌細(xì)胞NF-κB-NLRP3 調(diào)控通路在肥胖早期心肌損傷中的作用及其相關(guān)機制，并以此為靶標(biāo)研究肥胖所致代謝性疾病的防治具有重要的意義。