庫普弗細(xì)胞與肝缺血/再灌注損傷的研究進(jìn)展

賈德功，李慧源，賈志興，程穎（.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，河南衛(wèi)輝 4500；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科重癥科，河南 衛(wèi)輝 4500；.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植科，遼寧 沈陽 000）

肝移植是目前治療終末期肝病、限值標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)的肝癌、以及急性肝衰竭的最有效方法。隨著外科技術(shù)的持續(xù)改進(jìn)、器官保護(hù)和免疫抑制規(guī)范管理以及重癥監(jiān)護(hù)的完善，使得肝移植術(shù)后患者1 年生存率可達(dá)到90%以上［1］。但仍有一些問題是無法徹底解決的，如缺血/再灌注損傷（ischemia and reperfusion injury，IRI）。肝IRI 是血流及氧氣被剝奪后重新恢復(fù)的一種自相矛盾的組織反應(yīng)［2］。主要包括兩個階段的病理生理過程：分別是以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、糖原耗竭和線粒體功能障礙引起的細(xì)胞損傷為特征的缺血期，及血流及氧供恢復(fù)后以組織損傷加重為特征的再灌注期［3-4］。肝IRI 是導(dǎo)致移植物功能障礙和移植后肝功能衰竭的主要原因，是肝移植臨床實踐中急需解決的主要問題［2，5］。減輕IRI 不僅可以改善肝移植臨床預(yù)后，還可以利用邊緣供肝移植，從而擴大供體庫。然而，目前缺乏有效減輕IRI 的方法。

IRI 早期特征為再灌注后庫普弗細(xì)胞（kupffer cell，KC）的快速活化，活化的KC 細(xì)胞釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子和過氧化氫，引起氧化應(yīng)激以及肝實質(zhì)和血管損傷。KC 是固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，在正常成年小鼠中，KC 約占肝細(xì)胞的35%，占全身巨噬細(xì)胞的80%～90%。KC 與肝前體細(xì)胞的分化、肝細(xì)胞脂質(zhì)和碳水化合物代謝的調(diào)節(jié)、肝纖維化以及肝癌等肝臟的一系列病理狀態(tài)密切相關(guān)［6］。KC 激活并發(fā)生極化被證明與肝IRI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。因此，通過干預(yù)KC 的激活與極化來減輕肝IRI 已成為肝移植領(lǐng)域重要的研究方向。

本文就KC 的活動及作用，KC 與肝IRI 的關(guān)聯(lián)，以及如何通過調(diào)控KC 干預(yù)肝IRI 進(jìn)行了綜述。

1 KC 的活動及作用

KC 是位于肝竇血管內(nèi)皮管腔側(cè)的肝巨噬細(xì)胞［8-9］。KC 具有清除病原體、吞噬細(xì)胞碎片和調(diào)節(jié)鐵代謝等功能，這些對維持肝臟穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［10］。在肝臟中，KC 是自我更新、靜止和不遷移的。當(dāng)然，當(dāng)肝損傷期間KC 數(shù)量減少時，其也能依靠單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞、以及招募腹膜巨噬細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞等得到補充［8，11］。

在各種因素的刺激下，巨噬細(xì)胞可分化成不同的表型，表現(xiàn)出不同的特性和作用，從而在機體的生理和病理活動中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能，這被稱為巨噬細(xì)胞的極化效應(yīng)［12］。一般情況下，巨噬細(xì)胞根據(jù)分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞表面標(biāo)志物的不同分為M1 型和M2 型，當(dāng)然也存在其他亞型，但是M1 型和M2 型是目前研究應(yīng)用最多的亞型。當(dāng)器官出現(xiàn)嚴(yán)重感染或炎癥反應(yīng)時，巨噬細(xì)胞首先極化為M1型，M1 型巨噬細(xì)胞也被稱為炎性巨噬細(xì)胞，因為它們可以分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synase，iNOS）等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并具有消除細(xì)菌、病毒和真菌等引起的感染的功能［13］。如果M1 型持續(xù)大量存在，將會導(dǎo)致組織損傷。此時大量KC 激活并極化成M2 型，M2 巨噬細(xì)胞被稱為抗炎巨噬細(xì)胞，因為M2 巨噬細(xì)胞主要產(chǎn)生抗炎因子，如IL-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1），抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑、血管生成，防止M1 型KC 極化所致過度損傷，維持體內(nèi)平衡［12］。巨噬細(xì)胞的極化主要與高遷移率族蛋白B/Toll 樣受體4、酪氨酸激酶/ 信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子、TGF-β/Smads、氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisomeproliferatorsactivatedrec eptors，PPAR-γ）、Notch、微小RNA （microRNA，miRNA）等信號通路有關(guān)。除此之外，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）、哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等其他信號通路也可能參與其中［14］。因此，靶向這些信號通路可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，從而改變巨噬細(xì)胞在肝臟疾病中的作用。

綜上所述，在生理狀態(tài)下，KC 主要發(fā)揮吞噬和清除作用，維持機體穩(wěn)態(tài)。在病理條件下，它們可以改變表型，在免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2 IRI 與KC

肝臟IRI 是一個動態(tài)的兩階段過程，涉及肝臟局部缺血應(yīng)激和炎癥介導(dǎo)的再灌注損傷［15］。其主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷和線粒體腫脹、血管收縮、白細(xì)胞浸潤和血小板聚集，最終導(dǎo)致微循環(huán)阻塞［16］。

在肝IRI 的最初階段，細(xì)胞因缺氧和代謝紊亂而損傷，受損的肝細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶產(chǎn)生ROS［14］。這些ROS 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度失衡，改變細(xì)胞PH 值，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和肝損傷，并釋放危險相關(guān)分子模式（dangerassociated molecular pattern，DAMP）。DAMP 通過不同的TLR 通路激活KC 極化至M1 表型，釋放TNF-α 等炎癥因子，進(jìn)一步釋放ROS，促進(jìn)肝損傷［17］。雖然現(xiàn)階段肝臟缺血/再灌注損傷程度較輕，但會引起一系列晚期損傷，包括產(chǎn)生一系列促炎因子，招募活化的白細(xì)胞，引起明顯的肝臟損傷［14，17］?？梢杂^察到，肝臟IRI 發(fā)生8 ～72 h 后，組織中M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，而肝臟IRI 發(fā)生48 ～72 h 后，肝臟中M2 型巨噬細(xì)胞增多，逐漸取代早期占主導(dǎo)地位的M1 型巨噬細(xì)胞［18］。M2 型巨噬細(xì)胞主要由IL-4/13 刺激巨噬細(xì)胞極化而來，極化后的M2 巨噬細(xì)胞可分泌IL-10、腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor，TNF-β）等抗炎因子，減輕肝IRI。其中，IL-10 可抑制抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa，NF-κB）的激活，并強烈抑制TNF-α、IL-1β、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2 和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2 （macrophage inflammatory ptotein -2，MIP-2）分泌［19］。IL-10不僅可以進(jìn)一步極化巨噬細(xì)胞為M2 型，還可以抑制TNF-α 和E 選擇素、細(xì)胞間黏附因子-1 等細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)。同時，這些黏附分子也需要TNF-α 的活化，這進(jìn)一步抑制了黏附分子的作用，減輕了肝臟IRI［20］。

由此可見，KC 在肝IRI 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，KC 可作為干預(yù)肝IRI 的靶點。

3 通過調(diào)節(jié)KC 干預(yù)IRI

目前，調(diào)節(jié)KC 功能已成為減輕IRI 的研究熱點，已發(fā)現(xiàn)了多種通過調(diào)節(jié)KC 激活及極化從而減輕肝IRI 的方法。

3.1 IRI 所導(dǎo)致的酸性微環(huán)境通過增加iNOS 和單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1 的表達(dá)，從而增強KC 向M1 的極化，促進(jìn)TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子釋放。研究表明通過注射NaHCO3進(jìn)行堿化可以減輕KC 向M1 的極化，降低TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子水平，減輕肝IRI［21］。Jinjin Peng 等通過高通量實驗篩選出了一種催化E1A 相關(guān)蛋白p300 / CREB 結(jié)合蛋白的高選擇性抑制劑A-485，發(fā)現(xiàn)其可減少病理性促炎基因的表達(dá)，導(dǎo)致急性肝損傷小鼠模型炎癥通路激活減少，M1型極化減少，和白細(xì)胞浸潤減少［22］。這種小分子抑制劑具有廣闊的治療前景，值得進(jìn)一步探討。

3.2 促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抑炎型M2 型極化：在缺氧條件下，TGF-β 表達(dá)上調(diào)，其可能通過受體酪氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶通路增加M2 極化從而減輕IRI［23］。PPAR-γ 是核受體家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，是一個龐大而多樣的蛋白群，介導(dǎo)配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活和抑制。該受體在巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，其激活與抗炎巨噬細(xì)胞表型的上調(diào)和促炎巨噬細(xì)胞表型的下調(diào)有關(guān)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的降低。在小鼠模型中，PPAR-γ 激動劑顯著改善了小鼠肝缺血/再灌注損傷。與對照組相比，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著降低，肝臟中M1 巨噬細(xì)胞比例降低，M2 巨噬細(xì)胞比例增加［24］。

3.3 MicroRNA：有研究表明，在MicroRNA-155（miR-155）敲除的小鼠IRI 動物模型中，敲除miR-155 會降低 IRI 后 KC 中 CD80、CD86 和主要組織相容性復(fù)合體 II 的表達(dá)，使得促炎細(xì)胞因子的分泌受到抑制，抗炎因子IL-10 增強，促進(jìn)KC 極化成M2 型，從而改善肝IRI，而這種保護(hù)作用可以被KC 滅活劑氯化釓所逆轉(zhuǎn)［25］。而Huang 等［26］發(fā)現(xiàn)miR-450b-5p 抑制了α 晶狀體球蛋白B 活性，使經(jīng)典的NF-κB 信號通路增強，促炎因子表達(dá)增加，從而促進(jìn)M1 極化，加重肝IRI。這些研究表明miRNA 通過調(diào)控KC 極化來干預(yù)肝IRI，具有可行性。miR-21、miR-34a、miR-99b 等多種miRNA 都被證明能調(diào)控KC 的極化［27-29］，但其在肝IRI 中的作用及機制未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，這值得我們進(jìn)一步探索及研究。

3.4 長鏈非編碼RNA：含有200 個堿基對的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本被稱為長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA），在多種分子機制中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)移［30］?；谝幌盗蠱2 巨噬細(xì)胞的極化模型，通過lncRNA 微陣列分析，共記錄了25 個表達(dá)改變的lncRNA。其中，lncRNA-MM2P是唯一可以在M2 巨噬細(xì)胞極化過程中上調(diào)，而在M1 巨噬細(xì)胞中下調(diào)的lncRNA。lncRNA-MM2P 的下調(diào)阻斷了細(xì)胞因子驅(qū)動的M2 巨噬細(xì)胞的極化，而且通過減少信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-6 的磷酸化減弱了M2 巨噬細(xì)胞的血管生成促進(jìn)功能［31］。尚未有研究表明其余l(xiāng)ncRNA 在巨噬細(xì)胞向M2 型分化中的作用。

3.5 其他：血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是IRI 應(yīng)激所誘導(dǎo)的熱休克蛋白32，是肝臟發(fā)揮保護(hù)機制的重要組成部分。研究表明：HO-1 和一氧化碳（carbonic oxide，CO）與KC 極化密切相關(guān)。當(dāng)炎癥發(fā)生時，HO-1 的表達(dá)增加，隨后產(chǎn)生的CO將誘導(dǎo)KC 極化為M2 型，通過產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10 發(fā)揮抗炎作用，減輕肝IRI［32］。而HO-1 抑制劑原卟啉（protoporphyrin，SnPP）的加入可促進(jìn)M1 型KC 的極化，但其在肝IRI 中是否發(fā)揮作用尚不清楚［33］。需肌醇酶1α（Inositol-requiring kinase 1α，IRE1α）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上駐留的跨膜信號傳感器，在未折疊蛋白反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，KC 細(xì)胞中IRE1α 的缺失不僅減弱了NLRP3 炎癥小體的激活和IL-1 的產(chǎn)生，而且還抑制了iNos 和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［34］。藥理抑制IRE1α’s RNase酶活性可以減弱KC 的炎癥小體激活和iNOS 表達(dá)，從而減輕小鼠肝IRI。這表明，IRE1α’s RNase 酶活性可能是治療缺血/再灌注相關(guān)的肝臟炎癥和功能障礙的一個有希望的靶點。

?；撬崛パ跄懰?、丹參酮IIA 等中成藥也可選擇性作用于肝巨噬細(xì)胞，將肝巨噬細(xì)胞極化為M2型，改善肝IRI［35-36］。這表明，中成藥在調(diào)控KC、減輕肝IRI 方面具有極高的潛力。在肝移植的設(shè)置中，IRI 發(fā)生的時間點是提前知道的，多種干預(yù)可在缺血損傷前通過供體在器官取出前處理實現(xiàn)。此外，離體肝臟灌注是一種新的器官保存技術(shù)，在體外肝臟灌注過程中使用藥物可誘導(dǎo)移植物在移植時抵抗再灌注損傷。研究表明在大鼠肝移植冷保存時，通過門靜脈灌注谷氨酰胺溶解產(chǎn)生的α-酮戊二酸或血管內(nèi)皮生長因子-c，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和改變KCs 從M1 到M2 的極化來保護(hù)移植肝免受IRI。其機制與上調(diào)磷酸化糖原合成酶激酶-3β 和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1 的表達(dá)，抑制NF-κB 活性有關(guān)［37-38］。

4 討論與展望

肝IRI 是影響肝移植術(shù)后移植物存活及患者生存質(zhì)量的重要因素，且嚴(yán)重限制了邊緣供肝的使用［39-40］。目前仍沒有預(yù)防或減輕肝IRI 的具體有效治療方法。因此，更好地了解肝IRI 的機制是十分重要，這也是許多臨床醫(yī)生關(guān)注的問題。肝臟IRI 是由缺血損傷引起的，缺血損傷通過氧化應(yīng)激和ROS 的產(chǎn)生導(dǎo)致肝細(xì)胞的細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡，觸發(fā)局部無菌免疫反應(yīng)，其特征是KC 和中性粒細(xì)胞的招募。在正常肝臟中，KC 被稱為肝臟的前哨細(xì)胞，位于肝竇內(nèi)，占肝巨噬細(xì)胞的大多數(shù)，并占主導(dǎo)地位，主要維持肝臟穩(wěn)態(tài)。KC 有能力改變表型，以響應(yīng)周圍微環(huán)境的變化，參與各種肝臟疾病和損傷，是抵抗細(xì)菌和病毒入侵的第一線防線。根據(jù)KC 表型及功能的不同，可以將KC 分為促炎性M1 型和抗炎性M2 型。M1 巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮抗原提呈功能，具有促炎、清除致病微生物和抗腫瘤作用，而M2 巨噬細(xì)胞具有抑制炎癥、促進(jìn)組織重塑、防止寄生蟲感染以及參與血管生成、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)功能。因此，它們通常在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。

在疾病的發(fā)生和消退過程中，KC 的極化似乎是一個中間過程，它首先被某些信號激活，產(chǎn)生不同的表型，從而通過作用于多種信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。KC 極化在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并對各種肝臟疾病具有雙重調(diào)節(jié)作用。在IRI 的早期，肝巨噬細(xì)胞以M1 型為主，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，而在IRI 的后期，肝巨噬細(xì)胞以M2 型為主，促進(jìn)組織修復(fù)。事實上，與KC 極化相關(guān)的機制是非常廣泛的，大多數(shù)因素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化涉及多個信號通路的共同調(diào)控，這可能是KC 極化在肝臟疾病中發(fā)揮多重作用的重要因素。

動物實驗表明，通過抑制M1 型巨噬細(xì)胞極化或者調(diào)節(jié)KC 極化為M2 型可以減輕肝IRI，但并未在大型動物及人類進(jìn)行相關(guān)研究報道。未來的研究將需要更加詳細(xì)分析肝KC 分化狀態(tài)及其功能特性，從而深入了解KC 的極化、招募、功能及作用機制，實現(xiàn)KC M1/M2 表型、數(shù)量和分布的可控性，為減輕肝IRI 提供新的方法。同時，由于大多數(shù)研究是在動物模型中進(jìn)行，下一步的關(guān)鍵挑戰(zhàn)將是將這些新的先天細(xì)胞功能概念整合到人類移植受者肝IRI和一般無菌炎癥的背景中。這種新穎的方法具有極高的應(yīng)用前景?？傊?，在肝IRI 中，KC 是一種十分具有吸引力的治療靶點，由于其具有改善肝IRI 的潛力，值得進(jìn)一步研究。