細胞死亡機制在肝纖維化中的研究進展*

沈 炎 許文聰 代海洋 李 媛 黃古葉△

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) (廣西 南寧, 530023) 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

肝纖維化是由多種病因?qū)е碌母闻K炎癥反應(yīng)進而引起的肝臟慢性損害,其關(guān)鍵點在于肝星狀細胞(HSC)的活化及肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)的過度增生和沉積,瘢痕組織的不斷生成最終將發(fā)展成為肝硬化,甚至肝癌[1]。研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化是可逆的,細胞可以通過不同的死亡機制介導(dǎo)炎性小體或信號通路促進肝纖維化的發(fā)展[2]。因此,如何通過阻斷細胞死亡通路從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化,成為目前研究熱點。

1 細胞死亡機制

1.1 細胞焦亡 細胞焦亡,又稱為細胞炎性壞死,是發(fā)生在機體的天然免疫反應(yīng),由半胱天冬酶1(caspase-1)誘導(dǎo)的經(jīng)典通路及半胱天冬酶4/5/11(caspase-4/5/11)誘導(dǎo)的非經(jīng)典通路組成。細胞焦亡是機體對病原微生物入侵采取的自體免疫保護反應(yīng),當過度發(fā)生時可導(dǎo)致細胞因子釋放綜合征(CRS)、敗血癥、嚴重炎癥等。

焦亡經(jīng)典通路由細菌、病毒等危險信號刺激,機體的病原相關(guān)分子模式(PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)觸發(fā),以先天免疫受體,即模式識別受體( PRR)作為感受器,通過炎性復(fù)合小體組裝、介導(dǎo)去激活caspase-1前體(pro-caspase-1)。炎性小體是一種蛋白復(fù)合物,目前研究發(fā)現(xiàn)5個經(jīng)典炎性小體(NLRP1、NLRP3、NLRC4、TPAF、AIM2),其中以NLRP3炎性小體研究最為深入[3]。NLRP3炎性小體作為靶點,募集后裂解pro-caspase-1,激活caspase-1?；罨蟮腸aspase-1作為P10～P20復(fù)合物的二聚體,一方面切割執(zhí)行蛋白Gasdermin D(GSDMD)在N端和C端結(jié)構(gòu)域的鏈接區(qū),釋放具有結(jié)合膜磷脂上膜打孔活性的N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT),形成10～14 nm的孔道,造成滲透壓改變,細胞內(nèi)容物釋放、水內(nèi)流等使細胞破裂,引起炎癥反應(yīng);另一方面刺激活化的caspase-1促進白細胞介素IL-1β、IL-18的分泌和激活,募集更多炎癥細胞,擴大炎癥反應(yīng)[4-6]。

焦亡的非經(jīng)典通路則是由脂多糖(LPS)等病原體刺激,使caspase-4/5/11活化后對GSDMD切割,釋放具有膜穿孔活性的GSDMD-NT,使細胞膜破裂產(chǎn)生焦亡;同時誘導(dǎo)NLRP3激活caspase-1,進而激活I(lǐng)L-1β、IL-18,誘發(fā)焦亡;除此之外,細胞膜上的Pannexin-1通道與活化的caspase-4/5/11結(jié)合后可使P2X7受體通道打開,激活NLRP3釋放促炎細胞因子,加速細胞焦亡[7,8]。不論經(jīng)典途徑還是非經(jīng)典途徑,GSDMD是觸發(fā)細胞焦亡的關(guān)鍵[9]。因此,caspase-1和GSDMD是抑制焦亡的重要調(diào)控靶點,可阻止肝纖維化進展。

1.2 鐵死亡 鐵死亡是不同于焦亡的一類新的細胞死亡途徑,不需要半胱天冬酶的參與和調(diào)控。鐵死亡在細胞學(xué)上表現(xiàn)為細胞膜破裂,線粒體發(fā)生萎縮性改變,而細胞核仍保持完整形態(tài);其實質(zhì)是具有細胞膜毒性的脂質(zhì)活性氧(ROS)堆積,細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡[10]。調(diào)控鐵死亡的途徑主要有鐵代謝途徑、脂代謝途徑和谷胱甘肽過氧化物酶4/谷胱甘肽(GPX4/GSH)途徑等。

鐵元素是人體必需的微量元素,多以正價鐵離子(Fe3+)和二價亞鐵離子(Fe2+)存在人體內(nèi)。鐵死亡中的鐵代謝途徑主要依靠于鐵離子和亞鐵離子的轉(zhuǎn)換。Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)結(jié)合,在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的介導(dǎo)下,進入細胞內(nèi),一部分被細胞內(nèi)的二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1)還原生成Fe2+,形成鐵池(LIP);另一部分儲存在鐵蛋白中,在核受體輔助因子4(NCOA4)的介導(dǎo)下發(fā)生鐵自噬,釋放游離鐵離子,鐵池中的Fe2+與過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生芬頓反應(yīng),釋放羧基自由基,促進脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生大量脂質(zhì)活性氧(ROS),破壞細胞膜結(jié)構(gòu),發(fā)生鐵死亡[11,12]。另外,人體攝入的多不飽和脂肪酸(PUFA)可參與鐵死亡的另一代謝途徑——脂質(zhì)代謝途徑,PUFA在合成酶調(diào)控下,主要是乙酰輔酶A合成酶長鏈家族4(ACSL4)、溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3(LPCAT3)和脂肪氧合酶(LOX),生成有毒的磷脂氫過氧化物,最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,造成細胞膜破壞[13]。而GPX4/GSH途徑則是在胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體(system XC-)的誘導(dǎo)下發(fā)生[14]。system Xc-是一種具有Na+依賴性的轉(zhuǎn)運體,分為輕鏈xCT(SLC7A11)和重鏈CD98hc(SLC3A2),其中輕鏈SLC7A11對胱氨酸和谷氨酸的轉(zhuǎn)運具有高度特異性[15]。Xc-系統(tǒng)以1∶1的比例將胱氨酸攝入、谷氨酸排出,還原成半胱氨酸,參與到谷胱甘肽(GSH)的合成中。合成后的谷胱甘肽作為GPX4的重要輔助因子,與GPX4協(xié)同作用,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),阻止脂質(zhì)活性氧的聚集。目前發(fā)現(xiàn),system Xc-抑制誘導(dǎo)GSH耗損、GPX4的失活、抑癌基因P53、CoQ10的消耗、Erastin、ROS等均可誘導(dǎo)鐵死亡[16,17]。

1.3 細胞凋亡 細胞凋亡是由細胞內(nèi)外微環(huán)境擾動引起的。其特點是細胞皺縮、細胞膜起泡、核染色質(zhì)濃縮、凋亡小體形成,不伴隨細胞內(nèi)容物的外泄和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18]。凋亡發(fā)生主要依靠兩條途徑：一是死亡受體引發(fā)的外源途徑,二是線粒體引發(fā)的內(nèi)源途徑,且兩條途徑都與半胱天冬酶(caspase)的調(diào)控密切相關(guān)[19]。

凋亡的外源途徑是自然殺傷細胞(NK)和巨噬細胞產(chǎn)生的死亡信號(FASL)與細胞膜上的死亡受體(FAS)結(jié)合,發(fā)生構(gòu)象,將帶有FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(FADD)募集至胞內(nèi)的配體結(jié)構(gòu)域上,死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)募集caspase-8蛋白酶原,與FADD構(gòu)象形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC),使caspase-8切割活化,激活下游caspase-3,誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[20,21]。線粒體作為細胞內(nèi)最大的能量轉(zhuǎn)換器,內(nèi)源性途徑則是通過線粒體釋放抗體實現(xiàn)。凋亡信號或者促生存信號出現(xiàn),促凋亡蛋白Bax/Bak活化后發(fā)生寡聚化,線粒體外膜通透性發(fā)生改變,在B細胞淋巴瘤2(BCL-2)家族蛋白的調(diào)控下形成過渡孔[22],細胞色素C(Cyt-c)與基質(zhì)中的凋亡蛋白酶活化因子1(APAF-1)結(jié)合,APAF-1暴露出的CARD結(jié)構(gòu)域募集caspase-9蛋白酶原,caspase-9蛋白酶原在凋亡復(fù)合體中活化,進一步切割激活caspase-3,觸發(fā)凋亡[8,23]。線粒體外膜通透性升高后還可釋放促凋亡蛋白SMAC,SMAC結(jié)合凋亡蛋白酶抑制因子(IAP),解除對caspase酶的抑制,也可引發(fā)凋亡[24]。

2 細胞死亡在肝纖維化中的研究

2.1 細胞焦亡與肝纖維化的聯(lián)系 肝臟作為最大的實質(zhì)器官,主要由嗜酸粒細胞、肝星狀細胞(HSC)、庫普弗細胞及肝實質(zhì)細胞等組成,而這些細胞均可發(fā)生焦亡,加速肝纖維化的進展。Palacios-Macapagal等[25]通過建立肝壞死細胞模型,并從血吸蟲小鼠中分離出嗜酸粒細胞,發(fā)現(xiàn)壞死細胞可誘導(dǎo)嗜酸粒細胞分泌IL-1β、IL-18,從而證實了在細胞焦亡中,調(diào)節(jié)嗜酸粒細胞反應(yīng),可減少纖維化的產(chǎn)生。Meng等[26]和Inzaugarat等[5]研究發(fā)現(xiàn),NLRP3作為Nod樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域中的重要炎性小體,可以激活caspase-1,調(diào)控促炎細胞因子IL-1β、IL-18的分泌,活化肝星狀細胞(HSC),轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞,與肝臟炎癥反應(yīng)及纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。值得注意的是,肝星狀細胞還可由肝免疫細胞以NF-kB依賴性的方式激活,導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積[27]。而庫普弗細胞(KC)作為肝免疫細胞,通過實驗建模,注射炎性小體NLRP3抑制劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NLRP3在庫普弗細胞中的表達明顯高于肝星狀細胞,且NF-kB受炎性小體NLRP3調(diào)節(jié)[28]。實驗將IL-1受體拮抗劑處理NLRP3 CreZ敲入小鼠,經(jīng)過細胞染色和免疫印跡分析等操作[29],發(fā)現(xiàn)NLRP3 CreZ小鼠肝實質(zhì)細胞中的caspase-1和PI雙陽性細胞數(shù)量明顯增加,且活化的caspase-1增加了8倍。由此可知,肝實質(zhì)細胞也可發(fā)生焦亡,引起纖維化改變。

2.2 鐵死亡與肝纖維化的聯(lián)系 鐵死亡的實質(zhì)在于有毒的脂質(zhì)活性氧(ROS)的聚集,因此,清除ROS成為抑制鐵死亡的關(guān)鍵。GPX4/GSH代謝途徑作為鐵死亡代謝途徑之一,在清除ROS中發(fā)揮著巨大作用。GPX4作為抗氧化酶,過表達時可抑制脂質(zhì)過氧化,影響L02細胞中ROS堆積,抑制鐵死亡[30]。反之,則會加速死亡。Matsushita等[31]提出脂質(zhì)過氧化可導(dǎo)致GPX4缺失的T細胞活化后死亡,并實驗得出鐵螯合劑和鐵死亡抑制劑可消除T細胞死亡,延緩纖維化進展,證明了此過程涉及鐵死亡,且GPX4缺失和纖維化的發(fā)展呈正相關(guān)。而胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體(system XC-)是GPX4/GSH代謝途徑中重要的調(diào)控靶點,若抑制system XC-,則可減少谷胱甘肽(GSH)合成,使ROS聚集,加速纖維化[32]。具體來說,鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin可通過抑制XC-系統(tǒng),加速還原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的消耗,導(dǎo)致ROS堆積,增加纖維基因表達,誘導(dǎo)生成肌成纖維細胞[16,33]。另外,藥物也可通過調(diào)節(jié)信號因子及通路調(diào)節(jié)ROS。Sui等[34]建立CCl4致大鼠肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)異甘草酸鎂(MgIG)可降低肌成纖維標志物,如α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原蛋白、纖連蛋白等的表達,還可調(diào)節(jié)TGF-β信號通路、PDGF-β信號通路、EGF信號通路及MMP/TIMP系統(tǒng),清除ROS,抑制鐵死亡,減輕CCl4導(dǎo)致的纖維化。Wang等[35]發(fā)現(xiàn)蒿甲醚(ART)可阻止ROS聚集,抑制鐵死亡,一方面是調(diào)節(jié)TGF-β、PDGF-β和EGF信號通路直接作用于HCS;另一方面是抑制上游抑癌因子P53間接阻斷HCS活化標志物表達,減輕CCl4誘導(dǎo)的肝細胞損害和肝纖維化。

2.3 細胞凋亡與肝纖維化的聯(lián)系 細胞凋亡發(fā)生的過程中,線粒體膜通透性的改變及caspase酶的活化是加速凋亡、介導(dǎo)纖維化的重要環(huán)節(jié),而這兩個環(huán)節(jié)都與BCL-2蛋白的調(diào)控密不可分。Bax亞族作為BCL-2家族蛋白中的促凋亡蛋白,Bax/Bak使線粒體膜(MOM)通透化,cBid激活的Bax和BakΔC21形成大小隨蛋白質(zhì)濃度而改變的彈性蛋白滲透孔,使線粒體膜改變,誘發(fā)凋亡[22,36]。為了證實這一過程,An等[37]通過建立慢性肝毒素誘導(dǎo)纖維化模型,發(fā)現(xiàn)受損肝細胞線粒體可釋放線粒體衍生危險信號(mito-DAPM),其主要活性成分是mtDNA,可與BCL-2家族蛋白產(chǎn)生一系列寡聚化反應(yīng),刺激線粒體膜通透性升高,激活肝星狀細胞發(fā)生α-SMA上調(diào)、細胞增殖、促纖維化轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致瘢痕形成;同時還發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞和Gr-1+髓細胞在抗纖維化中的重要作用。Caspase酶作為凋亡的另一重要靶點,它的激活需要BCL-2蛋白調(diào)控被釋放的線粒體蛋白而實現(xiàn),并進一步誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[38,39]。有學(xué)者提出,丹參的水溶性提取物丹酚酸A(SA-A)可抑制纖維化,于是Wang等[40]建立CCl4誘導(dǎo)肝損害的動物實驗,分別予不同劑量SA-A處理小鼠,發(fā)現(xiàn)高劑量的SA-A對肝臟細胞纖維化的抑制作用更明顯,進一步免疫化學(xué)分析后得出,SA-A組中BCL-2蛋白表達增強,caspase酶表達減弱,印證了SA-A可通過調(diào)控BCL-2蛋白和caspase酶誘導(dǎo)凋亡,抑制肝臟纖維化。

3 總結(jié)與展望

在肝臟疾病的發(fā)展過程中,肝纖維化作為疾病發(fā)展的中間階段,可由病毒性肝炎、藥物性肝損害、酒精、血吸蟲等多種病因?qū)е隆Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的病理性過程,為防止疾病進一步進展成肝硬化、肝癌,逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為研究的重中之重。肝纖維化的產(chǎn)生與肝星狀細胞的活化和瘢痕組織的累積密切相關(guān),因此調(diào)控肝星狀細胞的活化成為抑制肝纖維化的靶點[41]。大量研究表明,細胞可以通過不同的死亡機制誘導(dǎo)纖維化。如何調(diào)控相關(guān)信號通路,阻斷細胞死亡對纖維化的影響,成為當代研究熱點。調(diào)控細胞死亡靶點成為治療肝纖維化的新思路。