基于UPLC-Q-TOF-MS/MS代謝組學(xué)研究土霉素和穿心蓮內(nèi)酯對雞代謝的影響

王芮杰,洪志楷,董英嬌,陳 瑤,王晉宇,王冠華*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.廣東廣墾畜牧工程研究院有限公司,廣州 510612)

雞的代謝受多種因素的影響,包括品種差異、飲食結(jié)構(gòu)以及各種環(huán)境應(yīng)激等,這些影響因素體現(xiàn)在各個器官和組織的代謝過程中,如葉酸可能影響雞肝細(xì)胞脂肪代謝[1]。除此之外,一些藥物對雞的代謝有顯著的影響,Хomehko和謝敏康[2]發(fā)現(xiàn)在呋喃唑酮的影響下游離氨基酸生理學(xué)比例會失調(diào),從而影響雞的代謝。腸道是雞營養(yǎng)轉(zhuǎn)化和吸收的重要場所,腸道菌群參與調(diào)節(jié)宿主的多種代謝途徑,健康的腸道菌群是維持機(jī)體免疫系統(tǒng)和腸道內(nèi)環(huán)境平衡的一個關(guān)鍵因素,而腸道內(nèi)環(huán)境的平衡對發(fā)揮疫苗的最佳性能,提高機(jī)體對病原微生物的免疫力至關(guān)重要[3]。雞腸道菌群失調(diào)是指腸道各菌群之間及各菌群與機(jī)體間相互依存、相互制約的動態(tài)平衡被打破,會引發(fā)出一定的臨床癥狀,如腸毒綜合癥、壞死性腸炎、球蟲等多種與腸道有關(guān)的疾病[4]。

在養(yǎng)殖過程中,人們通常會使用抗生素、益生菌制劑以及一些中藥來預(yù)防或治療禽類疾病,其中,土霉素(oxytetracycline,OTC)是一種廣譜抑菌素,價格低廉,在畜牧上廣泛應(yīng)用于雞白痢、傷寒、禽霍亂等傳染病的防治[5],但是抗生素濫用會造成雛雞胃腸道損傷,抑制生長[6],因此臨床當(dāng)中開始選擇用中藥治療。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,AG)是二萜類內(nèi)酯化合物,AG作為傳統(tǒng)中草藥穿心蓮的主要有效成分,因其無明顯的毒副作用而在臨床上廣泛使用。它對雛雞胃腸道疾病具有較好的治療效果,價格低廉,能夠大規(guī)模用于養(yǎng)雞場,有研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯在提高機(jī)體抵抗力、抗病毒和清熱解毒等方面有較好的效果[7]。代謝組學(xué)是一種研究范圍較全面、動態(tài)且連續(xù)的研究方式,通過系統(tǒng)地研究維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)并參與其新陳代謝的所有內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物,分析機(jī)體的整體代謝狀況[8]。近年來,人們對腸道菌群的研究較多,由于腸道微生物的代謝過程與宿主的新陳代謝存在相通與互補(bǔ)的情況,菌群與宿主間也存在著積極的交換代謝及“共代謝”過程。因此,為了進(jìn)一步了解腸道微生物在機(jī)體健康與疾病發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)的作用,理解腸道微生物和宿主之間的互利共生關(guān)系是十分有必要的[9]。

代謝組學(xué)通過與元基因組學(xué)、微生態(tài)學(xué)及多維統(tǒng)計的分析方法綜合利用,深入地研究腸道微生物與其宿主間的相互作用,成為揭示腸道菌與機(jī)體健康和疾病關(guān)系的突破口[10]。為了研究土霉素和穿心蓮內(nèi)酯對雞腸道代謝的影響以及調(diào)控代謝的差異性,本文以仔雞為模型,用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)采用非靶向代謝組學(xué)方法對穿心蓮內(nèi)酯和土霉素干預(yù)后的排泄代謝物進(jìn)行研究,分別對兩種藥物干預(yù)后的差異性代謝物進(jìn)行篩選鑒定并探討可能受其影響的代謝途徑,為臨床應(yīng)用穿心蓮內(nèi)酯和土霉素對雞代謝的干預(yù)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

于廣州市晉邦禽業(yè)有限公司購入30只黃羽肉雞,2周齡,體重(250±20)g;飼養(yǎng)條件:溫度23～25 ℃,濕度(45%±5%),光照12 h,自由飲水。

1.2 主要試劑和儀器

藥品與試劑:穿心蓮內(nèi)酯(98%)、土霉素(97%)、L-2-氯苯丙氨酸(97%)均購自上海阿拉丁公司;甲醇(質(zhì)譜級)、乙腈(質(zhì)譜級)均購自美國Fisher公司;甲酸(質(zhì)譜級,美國Waters公司);甲醇(分析級,廣州化學(xué)試劑公司);蒸餾水(廣州屈臣氏公司)。

主要儀器與設(shè)備:XEVO G2-XS Q-TOF 超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國,Waters公司);Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);KH-100SPV型超聲波清洗儀(江蘇,昆山超聲儀器有限公司);5804 R型高速離心機(jī)(德國,Eppendorf公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥物的制備 稱取適量藥物溶于生理鹽水中,超聲15 min,配制成濃度為0.2 mmol· L-1的穿心蓮內(nèi)酯和土霉素溶液。

1.3.2 分組及樣本采集 將30只2周齡黃羽肉雞適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d(溫度23～25 ℃,相對濕度 45%±5%,12 h光/暗循環(huán),光循環(huán)從早上 7∶00 開始),隨機(jī)分為空白對照組(normal control,NC),穿心蓮內(nèi)酯組(AG),土霉素組(OTC),每組10只,共3組。試驗雞3周齡時,以灌胃方式給藥,每次給藥前 8 h禁食并稱重,空白對照組給予生理鹽水,給藥組每天給藥1次,劑量為1 mL,連續(xù)5 d,整個試驗期間自由飲食和飲水。末次給藥后,禁食禁水12 h,籠下鋪設(shè)薄膜,并在24 h收集糞便混合物,將所收集排泄物中加入 0.5 mL 10 g·L-1疊氮鈉(NaN3)溶液做防腐劑。收集NC組排泄物作為空白對照樣。迅速稱量并分裝,置于-80 ℃ 冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣本前處理 每組稱取10份自然解凍的排泄物樣本0.1 g,分別標(biāo)記為NC組,OTC組,AG組;稱量后每份加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸(300 mg·L-1,甲醇配制)作為內(nèi)標(biāo)物,加入700 μL提取液(乙腈、水體積比1∶1混合液),研磨后勻漿渦旋混合1 min,超聲提取20 min;樣本用Eppendorf-5430 R低溫高速離心機(jī)在10 000 r·min-1,4 ℃ 條件下離心15 min;取上清液于-80 ℃凍存1 h,重復(fù)操作,10 000 r·min-1,4 ℃ 離心15 min,收集上清液分裝于-20 ℃ 保存;所有樣本經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后吸取上清液至進(jìn)樣小瓶中用于UPLC-Q-TOF-MS/MS測定。同時,從所有已處理樣本中取等量上清液混勻,作為質(zhì)控(QC)樣本,上機(jī)時每10針的試驗樣本中插入1針質(zhì)控樣本,以評價系統(tǒng)重復(fù)性。

1.3.4 色譜和質(zhì)譜條件 色譜分離條件:色譜柱使用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);柱溫設(shè)置為40 ℃,進(jìn)樣器溫度為4 ℃;流動相A為0.1 mL·L-1甲酸-水,流動相B:0.1 mL· L-1甲酸-乙腈;進(jìn)樣器流速為0.3 mL· min-1;進(jìn)樣量設(shè)置為2 μL;梯度洗脫條件:0～7 min,B: 5%～40%;7～11 min,B: 40%～90%;11～12 min,B: 90%～100%;12～13 min,B: 100%;13～13.1 min,B: 100%～5%;13.1～15 min,B: 5%。

質(zhì)譜檢測條件:在電噴霧電離模式(ESI)下進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)采集采用Centroid(棒狀圖數(shù)據(jù))模式,掃描范圍為m/z=50～1 200,毛細(xì)管電壓設(shè)置為3 000 V,脫溶劑溫度設(shè)置為350 ℃,脫溶劑氣體流速為650 L· h-1,離子源溫度設(shè)置為120 ℃,錐孔氣體流量為600 L·h-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 質(zhì)量評估 根據(jù)正負(fù)離子的掃描模式,得到所有代謝物的二維數(shù)據(jù)陣,并對QC樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,如果其決定系數(shù)R2值>0.95,則認(rèn)為達(dá)到了質(zhì)控要求。

1.4.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 使用UPLC-Q-TOF-MS/MS進(jìn)行測試,在MassLynx XS工作站MSE模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,采集一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)(保留時間、質(zhì)荷比、峰面積),之后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件,采用內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸)進(jìn)行歸一化處理。

1.4.3 差異性代謝物的篩選及鑒定 利用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)文件分別進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)及雙尾Student’sT檢驗等,以VIP>1,P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異代謝物,通過檢索HDMB、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性。將差異代謝物進(jìn)行KEGG 通路注釋并用MetaboAnalyst 進(jìn)行代謝通路富集和分析,以氣泡圖的形式可視化。再將代謝物按通路分類,整理出某一通路中所有差異代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 PCA分析

正離子模式下雞排泄物樣本的總離子流圖見圖1,QC 樣品的PCA得分圖見圖2。如圖2A、B所示,QC 樣品在正離子模式下相對于負(fù)離子模式聚集得更緊密,顯示本研究中正離子模式下的采集方法更穩(wěn)定,更具有重復(fù)性。因此下文在對差異代謝物及其通路進(jìn)行分析時多采用正離子模式下數(shù)據(jù)分析。如圖3所示,正負(fù)離子模式下根據(jù)排泄物中代謝物的主成分可以將對照組和OTC組明顯區(qū)分開,兩組間代謝物存在顯著差異,為下一步研究其差異組分奠定理論基礎(chǔ),然而對照組與AG組間成分區(qū)分不十分顯著,正離子模式下尤其明顯,兩組分未區(qū)分開。并且,OTC組和AG組的PCA圖也可看出同組內(nèi)不同樣本間分布比較分散,聚類不明顯。

圖1 ESI+模式下雞排泄物樣本的 UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS total ion flow diagram of chicken fecal urine samples in ESI+ mode

圖2 3組QC樣本PCA得分圖Fig.2 PCA scores graphs for three groups of QC samples

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+); C.NC-OTC (ESI-); D.NC-AG (ESI-)圖3 ESI+、ESI-模式PCA得分圖Fig.3 PCA scores diagrams in ESI+ and ESI- mode

ESI+模式下空白組與AG組樣本分布交叉,兩組樣本區(qū)別不顯著,可以得出AG組與空白組樣本代謝組學(xué)研究變化不明顯,AG對雞代謝影響不顯著。但OTC組與空白對照組排泄物樣本分布距離明顯,說明OTC可顯著引起雞代謝的變化。

2.2 OPLS-DA分析

利用SIMCA軟件,對NC-OTC組、NC-AG組樣本進(jìn)行OPLS-DA分析,結(jié)果見圖4。

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+); C.NC-OTC (ESI-); D.NC-AG (ESI-)圖4 ESI+、ESI-模式OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores diagrams in ESI+ and ESI- model

結(jié)果表明:NC-OTC組在ESI+模式下,R2Y=0.991,R2X=0.831,Q2=0.974;ESI—模式下,R2Y=0.975,R2X=0.663,Q2=0.958。在正負(fù)模式下,NC-OTC組區(qū)分相當(dāng)明顯,提示內(nèi)源性代謝產(chǎn)物存在一定差異,說明土霉素對于雞腸道菌群的代謝有影響。

NC-AG組在ESI+模式下,R2Y=0.902,R2X=0.931,Q2=0.753;ESI—模式下,R2Y=0.955,R2X=0.478,Q2=0.89。正負(fù)模式下,NC-AG組區(qū)分明顯,但不如OTC組,說明穿心蓮內(nèi)酯對雞代謝也有一定作用。

OPLS-DA分析結(jié)果顯示,各樣本組間區(qū)分明顯,所有樣本均在95%置信區(qū)間內(nèi)。經(jīng)過200次置換檢驗,ESI+模式下,與空白組相比,土霉素組:R2=0.524,Q2=-1.32;穿心蓮內(nèi)酯組:R2=0.401,Q2=-0.794;ESI-模式下,與空白組相比,土霉素組:R2=0.334,Q2=-0.65;穿心蓮內(nèi)酯組:R2=0.494,Q2=-0.422,兩組數(shù)據(jù)的Q2均為負(fù)數(shù),說明沒有過擬合且模型相對可靠,能夠很好地解釋組間差異,其模型驗證圖見圖5。NC-OTC組區(qū)分明顯,提示內(nèi)源性的代謝產(chǎn)物存在一定差異,說明穿心蓮內(nèi)酯和土霉素對于雞的腸道代謝均有作用。

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+);C.NC-OTC (ESI-); D. NC-AG (ESI-)圖5 ESI+、ESI-模式OPLS-DA模型驗證圖Fig.5 OPLS-DA model validation diagrams in ESI+ and ESI- model

2.3 差異代謝物的篩選

對各組雞排泄物中代謝物樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析和t檢驗,以 “VIP>1、P<0.05”(差異顯著)為篩選條件,結(jié)合這兩種統(tǒng)計方法及閾值來篩選差異代謝物,可以增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可靠性(圖6、表1～4)。

表1 NC-OTC組排泄物樣本代謝途徑分析列表Table 1 List of metabolic pathways analysis on the differential metabolites of fecal and urinary samples in NC-OTC group

A.NC-OTC; B.NC-AG圖6 ESI+模式火山圖Fig.6 Volcano diagrams in ESI+ model

2.4 差異代謝物的代謝通路分析

利用MetaboAnalyst 在線分析網(wǎng)站對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析和拓?fù)浞治?以拓?fù)浞治龅膇mpact值為依據(jù)會使結(jié)果更加具有可信度,其分析所得差異代謝物層次聚類分析熱力圖及代謝通路分析圖如圖7所示。

A.NC-OTC; B.NC-AG圖7 ESI+模式下差異代謝物層次聚類分析熱力圖(A、B)及排泄物代謝通路分析(C、D)Fig.7 Heatmap from hierarchical clustering analysis of differential metabolites (A, B) and fecal and urinary metabolic pathway analysis (C, D) in ESI+ model

結(jié)果顯示:表1中OTC組與空白組相比,有15條存在差異的代謝通路,以表3中差異代謝物存在的通路為標(biāo)準(zhǔn),篩選出最相關(guān)代謝通路。OTC組存在2條最相關(guān)通路,即影響甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)和亞油酸代謝(linoleic acid metabolism)的通路。該結(jié)果提示:土霉素可能通過這15條代謝通路對雞的腸道代謝產(chǎn)生影響。

表2中AG組與空白組相比,有17條存在差異的代謝通路,以表4中差異代謝物存在的通路為標(biāo)準(zhǔn),篩選出最相關(guān)代謝通路。AG組存在5條最相關(guān)通路,即影響甘油磷脂的代謝(glycerophospholipid metabolism)、鞘磷脂代謝(sphingolipid metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(cysteine and methionine metabolism)、不飽和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝(glycine, serine and threonine metabolism)通路。該結(jié)果提示:穿心蓮內(nèi)酯可能通過這17條代謝通路對雞代謝產(chǎn)生影響。其中兩組通路分析中有12條共有通路,說明土霉素和穿心蓮內(nèi)酯對雞的腸道代謝產(chǎn)生的影響途徑相似。

表2 NC-AG組排泄物樣本代謝途徑分析列表Table 2 List of metabolic pathways analysis on the differential metabolites of fecal and urinary samples in NC-AG group

3 討 論

本試驗以非靶向代謝組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ),以多元和單變量統(tǒng)計分析為數(shù)據(jù)處理方式,探究等濃度的土霉素和穿心蓮內(nèi)酯給藥后對雞腸道代謝物的影響。為研究差異代謝物在代謝通路中的位置和作用,探究土霉素和穿心蓮內(nèi)酯對雞的生理功能和代謝的影響,對用藥后排泄物中有顯著變化的化合物進(jìn)行分析,并與HMDB、KEGG等線上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。通過對比表1、2發(fā)現(xiàn)兩組通路分析中有12條共有通路,聯(lián)系表3、4找出最相關(guān)的代謝通路,OTC組為亞油酸代謝和甘油磷脂代謝通路,AG組為甘油磷脂的代謝、鞘磷脂代謝、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、不飽和脂肪酸的生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝通路,最后通過分析這些最相關(guān)代謝通路的作用,將其劃分為磷脂代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝三部分。

表3 NC-OTC組排泄物樣本差異代謝物列表Table 3 List of differential metabolites in fecal and urine samples of NC-OTC group

3.1 磷脂代謝

磷脂根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同分為甘油磷脂(phosphoglyceride)和鞘氨醇磷脂,本試驗結(jié)果證明OTC和AG都可以通過這兩種物質(zhì)的代謝影響雞的生理狀況。磷脂被磷脂酶A1或A2水解后生成溶血磷脂(lysophospholipid,LP),比較重要的LP有溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、溶血磷脂酸和某些鞘磷脂,這些溶血磷脂在用藥后雞的代謝中起重要作用。有研究表明,LP可以激活PPARγ(peroxisome proliferators activated receptor,PPAR),參與血管性癡呆、脊髓損傷和動脈粥樣硬化等疾病進(jìn)程[12],其對此類疾病的參與作用可能是通過被水解為甘油、堿基和磷酸后,參與糖代謝,磷脂再合成等代謝過程實(shí)現(xiàn)。LysoPC是一種氧化低密度脂蛋白成分,對腸屏障具有破壞作用,并具有促炎特性[13],LysoPC作為OTC組的重要差異代謝物,OTC對腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝的破壞作用可能與LysoPC這種對腸道屏障的刺激相關(guān)。本次經(jīng)篩選所得差異代謝物L(fēng)ysoPC(18∶1)、LysoPC(18∶2)都是溶血卵磷脂家族中重要的化合物,在多種肝疾病、心血管疾病及脂類代謝紊亂引起的疾病中起重要作用。所有LysoPCs不僅影響磷脂代謝,在動物機(jī)體脂肪酸代謝中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-16],多種代謝過程相互影響并相互轉(zhuǎn)化。本研究中,與NC組相比,用藥后,藥物處理組雞的上述磷脂水平下降,反映OTC和AG可能通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝途徑干預(yù)雞代謝。

鞘脂(sphingolipids)是一個在代謝中相互關(guān)聯(lián)的大家族,包括神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)、鞘磷脂(sphingomyelin, SM)和鞘糖脂等,根據(jù)表4 可以看出鞘脂類為AG處理組的重要差異代謝物。鞘氨醇(Sph)屬于鞘脂類,鞘脂可以轉(zhuǎn)化為Sph,再被催化生成1-磷酸鞘氨醇(S1P),S1P也屬于LP,起調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。Cer是合成和降解鞘脂的代謝中心,是最簡單的鞘脂,也是合成更復(fù)雜的鞘脂的通用前體[17]。絲氨酸和軟脂酰輔酶A經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)可以生成Cer,其經(jīng)神經(jīng)酰胺酶水解后又可以生成鞘氨醇。由于鞘氨醇的生成依賴于飽和脂肪酸,因此飽和脂肪酸氧化途徑減弱或飽和脂肪酸攝入過多都可能引起組織中鞘脂積累,并導(dǎo)致一系列脂類代謝疾病,根據(jù)這一代謝過程,研究證明可以通過抑制和控制鞘脂合成酶來治療動脈粥樣硬化、心肌病和糖尿病等脂質(zhì)代謝異常引起的疾病[18]。LysoPC的磷脂酰膽堿可以通過SM合成酶轉(zhuǎn)移到神經(jīng)酰胺中[19-20],Cer能夠介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,通過直接損傷血管內(nèi)皮促進(jìn)動脈粥樣硬化的作用已被證實(shí)[18,21],機(jī)體內(nèi)Cer水平與高血壓等血管疾病的嚴(yán)重程度成正比,對應(yīng)AG處理組鞘脂生物標(biāo)志物Cer上調(diào)與LysoPCs下調(diào),提示鞘脂代謝的整體異常。表4中差異代謝物Phytosphingosine即鞘氨醇的上調(diào)也證明磷脂代謝在AG對雞代謝的調(diào)控中起重要參與作用。

表4 NC-AG組排泄物樣本差異代謝物列表Table 4 List of differential metabolites in fecal and urine samples of NC-AG group

3.2 脂肪酸類代謝

亞油酸(linoleic acid,LA)學(xué)名十八碳二烯酸,是一種ω-6多不飽和脂肪酸,亞油酸的代謝是OTC和AG干擾雞正常代謝的重要途徑。LA能被腸道微生物代謝為共軛亞油酸[22],從而改善糖脂代謝[23]。根據(jù)多元統(tǒng)計學(xué)分析,篩選出一種參與不飽和脂肪酸生物合成的差異代謝物為腎上腺酸(adrenic acid),是由花生四烯酸的2碳鏈延長形成的天然多不飽和脂肪酸,其在雞排泄物代謝組中下調(diào)可能是AG引起亞油酸脂質(zhì)過氧化造成。脂質(zhì)氧化過程中,LA經(jīng)自由基誘導(dǎo)自動氧化或脂肪氧合酶催化,生成羥基十八碳二烯酸(hydroxyoctadecaenoic acids,HODEs),又名alpha-dimorphecolic acid,參與亞油酸代謝通路,其在表3中的上調(diào)趨勢可能由于LA的代謝引起。研究表明[24-26],內(nèi)源性HODEs具有病理生理學(xué)意義,脂質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的tHODE以及9-HODE、13-HODE與LA之間的相互關(guān)系可能導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生發(fā)展,將來可能成為診斷某些疾病的新的標(biāo)志物。9-HODE 是過氧化物酶體增殖劑活化受體 γ(PPARγ)的天然激動劑[27],參與磷脂代謝的LysoPCs也可以激活PPARγ,兩者都可以通過激活 PPARγ,調(diào)控糖代謝,改變脂肪細(xì)胞分化[28],改善脂質(zhì)代謝。LysoPCs參與的磷脂代謝通路與HODEs參與的脂肪酸類代謝相互影響,共同作用于雞的代謝。

3.3 氨基酸代謝

氨基酸是生物體的基本物質(zhì),氨基酸可以通過進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA cycle)進(jìn)行有氧代謝,為機(jī)體提供能量,在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用。本次代謝分析所得甘氨酸(Gly),絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr),半胱氨酸-蛋氨酸的代謝通路是根據(jù)富集得到最重要的氧化還原和代謝相關(guān)的途徑。其中,甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸由丙酮酸生成乙酰輔酶A,以乙酰輔酶A途徑進(jìn)入TCA循環(huán),甲硫氨酸(蛋氨酸)則以琥珀酰輔酶A途徑進(jìn)入TCA循環(huán)。生化中3-磷酸甘油酸經(jīng)氧化和轉(zhuǎn)氨作用生成3-磷酸絲氨酸,最后水解形成絲氨酸。分析顯示,Gly-Ser-Thr間的相互作用代表了一個主要的代謝交叉點(diǎn),與幾種非常重要的生物路徑相關(guān)聯(lián)。Gly-Ser-Thr可以通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和蘇氨酸醛縮酶可逆性相互轉(zhuǎn)化,各種氨基酸的轉(zhuǎn)化途徑如圖8A、B所示。其中,Ser是核苷酸合成的一個碳庫的來源,在圖8B的蛋氨酸循環(huán)中,可以明顯看出Ser與蛋氨酸循環(huán)直接相關(guān)[11]。動物通常以蛋氨酸降解路徑合成半胱氨酸,Ser和高半胱氨酸合成胱硫醚后經(jīng)分解生成α-酮丁酸和半胱氨酸。另外,參與Gly-Ser-Thr代謝的Ser還可以通過合成磷脂酰絲氨酸參與磷脂代謝。丙酮酸是氨基酸代謝途徑的重要代謝產(chǎn)物,其在排泄物中含量顯著上調(diào)可以推斷OTC和AG干預(yù)后可調(diào)節(jié)雞氨基酸代謝。

圖8 幾種重要的生物學(xué)通路[11]Fig.8 Main pathways of lifespan[11]

在實(shí)驗藥物方面:穿心蓮內(nèi)酯具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽、保護(hù)心血管系統(tǒng)等。穿心蓮內(nèi)酯抗炎活性作用涉及多個炎癥有關(guān)靶點(diǎn),可以通過降低炎癥介質(zhì)的合成和釋放、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激等方式完成。其抗腫瘤的效果可通過調(diào)控不同的細(xì)胞信號通路,阻滯腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式實(shí)現(xiàn)。本研究表明,AG具有一定的調(diào)節(jié)糖代謝的能力,表現(xiàn)為通過干擾甘油磷脂的代謝、不飽和脂肪酸的生物合成等發(fā)揮降糖作用。AG調(diào)節(jié)糖代謝的作用機(jī)制與阻抑炎癥反應(yīng)、降低腸道通透性有關(guān),通過改善腸道微生物群結(jié)構(gòu),維持脂蛋白密度和脂質(zhì)代謝的平衡[29]。另外,NC-OTC組結(jié)果表明,連續(xù)攝入土霉素可對雞機(jī)體正常的代謝功能產(chǎn)生影響,主要表現(xiàn)在通過影響甘油磷脂的代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝等引起機(jī)體脂肪酸代謝的變化。

4 結(jié) 論

以雞為試驗對象,研究等劑量土霉素和穿心蓮內(nèi)酯影響機(jī)體代謝的途徑,結(jié)果表明,兩者都能夠顯著調(diào)節(jié)動物內(nèi)源性代謝,其中,共有的12條代謝通路說明土霉素和穿心蓮內(nèi)酯對雞的腸道代謝影響途徑十分相似,作用機(jī)制或與調(diào)節(jié)磷脂代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝等重要內(nèi)源性代謝通路有關(guān),且土霉素作用較穿心蓮內(nèi)酯顯著。同時,本研究經(jīng)代謝組學(xué)分析進(jìn)一步揭示了穿心蓮內(nèi)酯具有一定的類抗生素效用,為其代謝機(jī)制的推理提供參考。