2020—2022年湖北省生豬屠宰場偽狂犬病病毒的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

陳宏建,曹 艷,樊 杰,甘榮萱,宋文博,喻盛煒,楊 婷,趙艷霞,魏春燕,謝 銳,華 琳,彭 忠,3,吳 斌*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430070;3.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

豬偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種可感染多種哺乳動(dòng)物的病毒性傳染病[1-3]。PRV唯一的自然宿主是豬[4],其最主要的危害是引起母豬繁殖障礙,育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病,幼齡仔豬神經(jīng)癥狀甚至死亡[5-6],且PRV會(huì)在耐過豬的神經(jīng)系統(tǒng)中建立可重新激活的潛伏感染,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[7]。特別是自2017年以來在中國已經(jīng)報(bào)道了26例人感染PRV的病例,并在1起急性人類腦炎病例中分離出1株P(guān)RV,說明PRV已經(jīng)開始危害人類公共衛(wèi)生安全,凈化刻不容緩[8-10]。

PRV是屬于α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的雙鏈DNA病毒,核苷酸全長約143 kb,含有70多個(gè)開放閱讀框(ORF),可編碼100多種蛋白質(zhì),因其基因組平均G+C含量高達(dá)74%,所以很難進(jìn)行全基因組測序[11-12]。根據(jù)gC基因的差異,可將PRV分為基因Ⅰ型毒株和基因Ⅱ型毒株[13]。2011年以來,在免疫過Bartha-K61豬場再度暴發(fā)了變異PRV,與經(jīng)典毒株相比,其擁有更強(qiáng)的傳播能力和致病性,一些主要的毒力基因和抗原區(qū)域都發(fā)生了變異,因此很難通過疫苗免疫進(jìn)行有效控制[14-16]。2017年至今已有5例在自然選擇壓力下疫苗毒與野毒發(fā)生基因重組的報(bào)道,說明對(duì)PRV變異情況進(jìn)行長期監(jiān)測至關(guān)重要[17-20]。

雖然gE基因缺失疫苗及配套的野毒鑒別診斷方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[21-22],但是近幾年對(duì)中國PRV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示不同省份PRV抗體平均陽性率為29.52%(河南30.14%,河北46.27%,湖南23.55%,云南31.37%,黑龍江16.3%),病原平均陽性率為8.27%,提示PRV凈化一直沒有實(shí)現(xiàn)[23-27]。2018年ASFV在我國暴發(fā)以后,使中國養(yǎng)豬業(yè)布局重組,影響了生豬調(diào)運(yùn)和屠宰加工分布,同時(shí)也影響了對(duì)豬場其他疫病的免疫和監(jiān)測工作[28],因此在此情況下進(jìn)行PRV流行情況監(jiān)測非常困難。為解決此問題,本研究在2020—2022年湖北省不同地區(qū)的屠宰場分別采集血液和肺樣品,進(jìn)行PRV流行情況調(diào)查,同時(shí)對(duì)分離出的PRV進(jìn)行全基因組測序和系統(tǒng)發(fā)育分析,以了解PRV流行分布和遺傳變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2020—2022年,根據(jù)不同區(qū)域生豬養(yǎng)殖規(guī)模,從湖北省4個(gè)地理區(qū)域(鄂東:武漢市、鄂州市、黃岡市、咸寧市、黃石市;鄂北:襄陽市;鄂西:宜昌市;鄂中:孝感市、荊州市)不同規(guī)模的屠宰場按比例采集1 795份血液樣品和2 081份肺樣品(圖1)。血液樣品靜置后收集血清用于PRV-gE抗體檢測,肺組織樣品研磨后于-80 ℃凍融3次,取上清保存。

圖1 湖北省不同地理區(qū)域PRV檢測樣品采集Fig.1 Samples collection for PRV detection from different geographical regions in Hubei province.

1.2 血清學(xué)檢測

血清樣品恢復(fù)至室溫后使用商品化ELISA試劑盒(IDEXX,Westbrook,ME,USA)對(duì)野毒感染產(chǎn)生的PRV-gE抗體進(jìn)行檢測。根據(jù)說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判定,檢出的可疑值進(jìn)行重復(fù)測定。

1.3 病原檢測

使用商品化DNA/RNA提取試劑盒(Vazyme,Nanjing,China)提取組織上清液中的DNA。以此DNA為擴(kuò)增模板,按照偽狂犬病診斷方法國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18641—2018中規(guī)定的引物、體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳出現(xiàn)與預(yù)期條帶(368 bp)大小相符的即為陽性。

1.4 病毒分離培養(yǎng)和全基因組測序

將“1.3”中檢出的陽性樣品上清通過0.22 μm濾器(EMD Millipore,Billerica,MA,USA),再接種到長滿單層的PK-15細(xì)胞中。在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后更換為含2%胎牛血清(Gibco,USA),0.1%青鏈霉素的DMEM(Gibco,USA)培養(yǎng)基。每日觀察細(xì)胞狀態(tài),當(dāng)感染48 h左右或有80%細(xì)胞出現(xiàn)病變(CPE)時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)物。凍融3次后進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)。分離出的病毒進(jìn)行空斑純化,用Reed-Muench法測定病毒的TCID50,并用“1.3”的方法進(jìn)行鑒定。

繼續(xù)使用試劑盒提取純化后病毒的基因組并將樣品郵寄至武漢百易匯能生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.5 遺傳進(jìn)化分析

從NCBI GenBank 下載來自全球不同物種的PRV參考序列(表1),分別整理參考毒株和本研究分離毒株的gB、gC、gE基因序列。使用MEGA X中的Cluster W進(jìn)行序列對(duì)比,進(jìn)行model text后選擇最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000 bootstrap replications)[29]。使用DNAstar中的Megalign對(duì)參考毒株和分離株gB、gC、gE基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(Lasergene DNAStar)。

表1 本研究引用的PRV參考毒株序列Table 1 PRV strains referenced in this study

2 結(jié) 果

2.1 2020—2022年湖北省PRV血清學(xué)陽性率與病原檢出率分析

本研究在湖北省4個(gè)地理區(qū)域的屠宰場都進(jìn)行了采樣,共計(jì)21次。根據(jù)每批屠宰數(shù)量、屠宰場自動(dòng)化程度和豬來源將屠宰場分為了4個(gè)等級(jí),不同等級(jí)的屠宰場設(shè)置不同的抽樣比例(表2)。對(duì)屠宰場進(jìn)行豬來源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)除各別散養(yǎng)農(nóng)戶外,其余豬場都進(jìn)行了PRV弱毒疫苗或滅活疫苗的免疫。

表2 屠宰場等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)及抽樣比例Table 2 The classification standard of grade and sampling proportion of pig slaughterhouses

在本研究收集的1 795份血清中,共檢出PRV-gE抗體陽性104份,平均陽性檢出率為5.79%。在收集的2 081份組織樣品中,共檢出PRV-gE病原陽性82份,平均陽性檢出率為3.94%。對(duì)與PRV相關(guān)的季節(jié)、區(qū)域和屠宰場規(guī)模因素進(jìn)行評(píng)估(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本研究中PRV的感染率出現(xiàn)了季節(jié)差異,抗體和病原都在春季檢出率最高,分別為18.57%(57/307)和9.74%(37/380)?？贵w和病原分別在夏季(2.67%,13/486)和秋季(2.11%,16/757)檢出率最低,符合PRV的流行特征。湖北省不同區(qū)域的PRV感染率存在較大差異,湖北省東部的抗體檢出率最高,達(dá)到了10.77%(84/780),在西部未檢出抗體陽性。湖北省中部的病原檢出率最高,為4.93%(28/568),北部的病原檢出率最低,為1.54%(5/324)。從屠宰場規(guī)?？?A類小型屠宰場的PRV抗原和抗體檢出率都顯著高于其他3個(gè)類型,分別為16.28%(49/301)和6.01%(23/383)?？贵w和病原分別在B類(2.64%,12/454)和D類(0.82%,5/613)屠宰場中檢出率最低。

圖2 不同季節(jié)(A)、屠宰場類型(B)和地理位置區(qū)域(C)的PRV-gE抗體及病原陽性檢出率Fig.2 Positivity rate of PRV-gE detection in different seasons (A), slaughterhouse(B) and geographical regions (C)

2.2 PRV病毒分離

為進(jìn)一步研究湖北省近2年P(guān)RV遺傳變異情況,本研究對(duì)檢出PRV病原陽性的組織樣品進(jìn)行病毒分離鑒定。結(jié)果成功分離到可在PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的PRV毒株17株,分離率為20.7%(17/82)。根據(jù)采樣地區(qū)和采樣時(shí)間對(duì)毒株進(jìn)行了命名。用Reed-Muench法測定這些毒株的TCID50為(106.39～107.55)·0.1 mL-1。提取病毒的基因組進(jìn)行全基因組測序,結(jié)果顯示,這些毒株的全基因組長度介于142 735～160 216 bp,GC含量為71%～73%,符合PRV的基因組結(jié)構(gòu)特征(表3)。

表3 本研究分離的PRV毒株Table 3 PRV strains isolated in this study

2.3 系統(tǒng)發(fā)育與同源性分析

將本研究分離的17株P(guān)RV與NCBI下載的28株參考毒株的全基因組和gB、gC、gE基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析(圖3)。結(jié)果顯示,在4種系統(tǒng)發(fā)育樹中,本研究分離的17株P(guān)RV均屬于基因Ⅱ型變異株,與2012年以來國內(nèi)分離的變異株處于同一演化分支。值得注意的是,HBXG-2020-1～5與HuB1/CHN2017(GenBank登錄號(hào):MK682670)在基因Ⅱ型毒株中位于一個(gè)獨(dú)立的演化分支(圖3)。

2.4 PRV gB、gC、gE基因分析

將本研究分離的17株P(guān)RV與NCBI下載的28株參考毒株的gB、gC、gE基因核苷酸序列推導(dǎo)為氨基酸序列,通過DNAStar中的Megalign軟件進(jìn)行同源性分析(表4)。

表4 PRV分離株的gB、gC和gE基因推導(dǎo)的氨基酸與其他毒株的同源性分析Table 4 Amino acids similarity analysis of the gB, gC and gE of PRV strains isolated in this study %

結(jié)果顯示,本次分離的毒株gB、gC、gE基因都與國外分離的基因Ⅰ型毒株相似性最低,分別達(dá)到97.3%、92.8%和96.4%。與2012—2019年分離的基因Ⅱ型毒株相似性最高,最高值都達(dá)到了100%。其中,gC基因的差異性最大,這與該基因的多變性有關(guān)。值得注意的是,HBXG-2020毒株的gC基因與NIA3、Kaplan、Becker、Bartha-K61等國外早期分離株的同源性明顯高于其他分離株。

3 討 論

PR自從1947年首次在我國被報(bào)道以來,在我國經(jīng)歷了2個(gè)流行時(shí)期。20世紀(jì)80年代后期,我國通過使用匈牙利引進(jìn)的Bartha-K61弱毒疫苗已經(jīng)基本控制了PR的流行[30]。2011年底,在免疫過疫苗的豬群又暴發(fā)了PRV變異株導(dǎo)致的新一輪流行[13]。雖然我國一直在進(jìn)行PR凈化工作,但變異PRV至今仍在豬場中流行,因此應(yīng)持續(xù)推進(jìn)該病的凈化根除工作。

本研究檢測到湖北省PRV的感染抗體陽性率為5.79%,與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致[23-27],說明湖北省存在PRV持續(xù)感染,但感染率少于其他省份。由于組織樣品難以按比例采集,關(guān)于PRV病原陽性檢出率的報(bào)道較少,Sun等[24]研究表明2012—2017我國平均PRV病原陽性率為8.27%,華中地區(qū)為10.9%,結(jié)合本研究的3.94%,可能由于健康屠宰肥豬的帶毒率低于其他豬群的帶毒率,也說明對(duì)ASFV防控加強(qiáng)豬場生物安全建設(shè)的措施對(duì)其他疫病的防控也有一定效果。

本研究結(jié)果顯示PRV感染抗體和病原都在春季檢出率最高,這與PRV的理化特性有關(guān),符合PRV的流行規(guī)律。從地理區(qū)域看在湖北省東部地區(qū)總體檢出率最高,西北部地區(qū)總體檢出率較低。結(jié)合當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖規(guī)模,發(fā)現(xiàn)西北部地區(qū)主要是開展了PRV凈化的規(guī)?；i場及其提供陰性豬的輻射豬場;東部地區(qū)規(guī)模較小的養(yǎng)殖場偏多,存在較多生豬轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)。從屠宰場規(guī)?？碅類小型屠宰場總體檢出率最高,可能與其關(guān)聯(lián)的主要是小型養(yǎng)殖場和散戶,PRV凈化程度低和ASFV防控措施不到位等因素有關(guān)[31]。

為了掌握偽狂犬病病毒的致病機(jī)制和突變機(jī)制,近年來,對(duì)流行毒株基因組進(jìn)行了深入研究。發(fā)現(xiàn)gB是PRV主要的免疫原性蛋白,能產(chǎn)生中和抗體[32],gC基因是公認(rèn)的PRV基因分型靶標(biāo)[13],gE基因是主要毒力基因[33],而且不同基因型的gB、gC、gE之間存在較大差異[34]。此外,潛伏感染是PRV凈化的難點(diǎn),它不是由單個(gè)基因決定,而是與多個(gè)因素相關(guān),如即時(shí)早期基因IE180、早期基因EP0和潛伏的侵染相關(guān)轉(zhuǎn)錄本LAT等[35]。因此本研究對(duì)分離株進(jìn)行了gB、gC、gE和全基因組的遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明,湖北省主要流行的是基因Ⅱ型毒株,與2012年以來國內(nèi)分離的毒株處于同一系統(tǒng)發(fā)育分支。值得注意的是,在所有的基因Ⅱ型毒株中,HBXG-2020-1～5與HuB1/CHN2017位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的遺傳進(jìn)化分支,而在我們之前的研究中,HuB1/CHN2017為Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株產(chǎn)生的重組毒[18]。值得一提的是,HBXG-2020-1～5所展現(xiàn)出的遺傳進(jìn)化特征與國內(nèi)其他團(tuán)隊(duì)所報(bào)道的PRV重組毒株的一致[17]。而gC蛋白的氨基酸序列分析亦顯示HBXG-2020的gC基因與Bartha-K61等早期國外分離株有很高的同源性。上述結(jié)果均提示HBXG-2020可能為重組病毒。在下一步研究中,作者將基于全基因組序列開展生物信息學(xué)分析予以確認(rèn)。由于本研究受到新冠疫情和ASFV影響,采樣時(shí)間和地點(diǎn)受到一定限制。因此結(jié)合各地防疫政策,生豬運(yùn)輸和養(yǎng)殖屠宰規(guī)模情況制定了采樣計(jì)劃,從而使數(shù)據(jù)更有代表性。

4 結(jié) 論

本研究調(diào)查了2020—2022年湖北省屠宰場肥豬中PRV抗體和病原的流行情況和遺傳變異規(guī)律。結(jié)果表明在湖北省屠宰場輻射的豬場中PRV依然流行,但陽性率有所降低。遺傳進(jìn)化分析表明,本研究分離的17株P(guān)RV均屬于基因型Ⅱ毒株。本研究有利于后續(xù)對(duì)湖北省PRV流行情況的評(píng)估,也提示要持續(xù)對(duì)PRV進(jìn)行監(jiān)測和新疫苗研發(fā)。