不同程度煙草白粉病感染秦煙99的DNA甲基化研究

鐵丹 張保華 張軍倉 趙繼剛

摘要 ［目的］了解煙草白粉病對秦煙99 DNA甲基化水平的影響，探明其DNA甲基化在脅迫條件下對煙草的調(diào)控作用。［方法］結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術，對不同程度感染煙草白粉病秦煙99的基因組DNA甲基化水平進行MSAP分析。 ［結(jié)果］DNA甲基化在白粉病脅迫條件下調(diào)控煙草生長，秦煙99感染白粉病程度越高，其DNA甲基化水平越高。［結(jié)論］該試驗通過研究感染不同程度煙草白粉病的秦煙99間的表觀遺傳多樣性，為探明秦煙99生態(tài)適應性獲得的表觀遺傳機制提供理論依據(jù)。該試驗結(jié)果豐富了煙草基因組甲基化方面的研究內(nèi)容，為今后研究煙草表觀遺傳學提供一定的參考。

關鍵詞 煙草白粉病；秦煙99；DNA甲基化；MSAP；表觀遺傳

中圖分類號 S435.72? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0135-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.032

Study on DNA Methylation of Qinyan 99 Infected with Tobacco Powdery Mildew in Different Degrees

TIE? Dan， ZHANG? Bao-hua， ZHANG? Jun-cang? et al

（Baoji Tobacco Company Linyou Branch，Baoji， Shaanxi?? 721599）

Abstract ［Objective］ To understand the influence of Erysiphe cichoracearum DC. on DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings and explore the regulation of DNA methylation on Nicotiana tabacum under stress. ［Method］ The genomic DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings with different infection degrees of Erysiphe cichoracearum DC. was analyzed MSAP by using polyacrylamide gel electrophoresis technique. ［Result］ The higher the degree of Erysiphe cichoracearum DC. infection， the higher the DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings. ［Conclusion］ In this study， the epigenetic diversity of Qinyan 99 infected with different degrees of tobacco powder virus was studied to provide a theoretical basis for exploring the epigenetic mechanism of Qinyan 99s ecological adaptation. The results of this experiment enrich the research content of Nicotiana tabacum genome methylation， and provide a certain reference for the future study of Nicotiana tabacum epigenetics.

Key words Erysiphe cichoracearum DC.;Qinyan 99;DNA methylation;MSAP;Epigenetics

作者簡介 鐵丹（1996—），女，陜西寶雞人，助理農(nóng)藝師，碩士，從事逆境脅迫條件下的植物響應研究。

收稿日期 2022-08-22

煙草作為我國主要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。但由于病蟲害的發(fā)生，每年都會帶來巨大的經(jīng)濟損失。所以，在煙草種植過程中各類病蟲害的防治也成為當前研究工作重點。煙草白粉病的病原菌為二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.），屬于子囊菌亞門核菌綱白粉菌目白粉菌科白粉菌屬（Golovinomyces orontii），其作為煙草的主要病害之一，給我國的煙草生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失［1］。氣象條件可以直接影響白粉病菌的侵染時間與分生孢子的繁殖數(shù)量，也可以顯著影響白粉病的越夏、越冬、流行速度及嚴重程度［2-3］。白粉病會隨著溫度和濕度的增加，其發(fā)病速度也會增加，尤其是田間濕度過大和高溫高濕交替出現(xiàn)情況下，病害會持續(xù)加重；此外，煙草徒長、種植密度過大導致的通風透光不良，也會造成白粉病發(fā)病嚴重。白粉病菌只存活于活體寄主，為專性寄生菌，一般侵染植物分為分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、吸器產(chǎn)生、菌絲形成、生長和分生孢子形成［4］，其病原菌主要危害植株的葉片，嚴重時危害果實。植株在發(fā)病初期，葉片表面通常會出現(xiàn)褪綠斑點，形成白粉狀病斑，隨后連成一片，成為邊緣不明顯的白色粉狀物，可降低植株的光合能力，嚴重時造成整株死亡［5-6］，從而影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究表明，表觀遺傳調(diào)控機制（DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和小分子RNAs（sRNAs））可影響植物表型可塑性［7］。在植物中由小分子RNA所介導的DNA甲基化模式最早在感染類病毒的煙草中發(fā)現(xiàn)［8］。DNA甲基化是植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫等過程中一種常見的表觀遺傳現(xiàn)象，也是植物逆境響應的重要機制，其通過調(diào)控植物開花、產(chǎn)量、抗性等與物種穩(wěn)定性或品種一致性密切相關的性狀來維持正常的生長發(fā)育［9-10］。DNA甲基化主要是高等真核生物中胞嘧啶殘基的甲基化［11］，是植物中表觀遺傳效應研究最多的內(nèi)容，也是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳途徑之一。在植物中，胞嘧啶甲基化在以下3種不同的序列中發(fā)現(xiàn)：對稱的CG和CHG位點（H = A，C，T）和不對稱的CHH位點。這3種情況下的甲基化會在轉(zhuǎn)座元件和重復序列中發(fā)生，它們通常與轉(zhuǎn)錄抑制相關［12］。但不同植物品種，即使是同一品種的不同發(fā)育時期和不同器官中的甲基化水平也有所不同［13］。研究表明，相同種屬煙草的不同品種間甲基化修飾水平不同，其DNA甲基化水平在29.72%～43.37%［14］。Boyko等［15］研究發(fā)現(xiàn)，煙草感染普通花葉病毒后其基因組甲基化水平提高，但降低了與抗病相關的區(qū)域甲基化水平；生物脅迫可以誘導植物基因組DNA甲基化水平變化，改變基因的表達水平，從而逃避或耐受生物脅迫。Dowen 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，DNA胞嘧啶甲基化在病原菌-寄主互作中，可調(diào)控寄主基因表達的方式防御病原菌，從而在植物生長、發(fā)育及響應生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用；DNA甲基化可能參與了病原菌-寄主互作的抗病信號轉(zhuǎn)導［17］及基因表達水平變化與DNA甲基化程度密切相關［18］。因此，筆者通過植物甲基化MSAP技術，研究煙草白粉病毒不同感染程度的秦煙99間的表觀遺傳多樣性，為探明秦煙99生態(tài)適應性獲得的表觀遺傳機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“秦煙99” 為茄科煙草屬煙草（Nicotiana tabacum）草本植物。依據(jù)白建保（2010年）煙草白粉病病害嚴重度分級標準采集樣品，于 2021年7月20日從陜西省寶雞市麟游縣九成宮鎮(zhèn)豐塬村大田采集4種不同感染程度（0、3、7及9級）的秦煙99葉片。采集處于同一天移栽的同一片煙田內(nèi)不同發(fā)病程度的秦煙99葉片，采集的個體間聚力不低于50 cm；每種程度至少采集3株作為重復處理。隨后，為盡量減少葉表面的污染，將用75%的乙醇輕輕地擦洗所采集的煙草葉片，裝在茶包袋中，再置于裝有硅膠的塑封袋中干燥，用于后續(xù)植物DNA提取。

0級，無病斑；

1級，病斑面積占葉片面積的5%以下；

3級，病斑面積占葉片面積的6%～10%；

5級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；

7級，病斑面積占葉片面積的21%～40%；

9級，病斑面積占葉片面積的41%以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物基因組的提取。

用植物DNA提取試劑盒（BioTeke，北京）提取秦煙99葉片DNA，所提取的DNA放置在-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因組DNA濃度和純度檢測。

用核酸測定儀（BioSpec-nano）分別于260和280 nm處分別測定吸光度值以檢測DNA的濃度，一般情況認為OD260/OD280的值在1.7～1.9純度均較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，隨后用ddH2O將DNA濃度均稀釋為100 ng/μL。

1.2.3 MSAP（甲基化敏感多態(tài)性）分析。

1.2.3.1 基因組DNA雙酶切。

采用核酸內(nèi)切酶Eco RI（識別六堿基）分別與同裂酶Msp I（識別四堿基）和Hpa II組合對植物樣本DNA進行雙酶切。酶切體系總體積為20 μL，包括5 μL cDNA、2 μL Cutsmart TM Buffer、1 μL Eco RI、1 μL Hpa II/Msp I、用ddH2O補足至20 μL，將混合物混勻于37 ℃酶切5 h。為使酶徹底失活，Eco RI+Msp I酶切體系于65 ℃滅活20 min；Eco RI+Hpa II于80 ℃ 滅活20 min，酶切產(chǎn)物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.2 酶連接反應。

人工設計的與Eco RI+Hpa II/Msp I酶切位點互補的人工接頭加于酶切片段兩端（表1）。接頭使用前需在100 ℃的條件下變性5 min。酶連體系總體積為30 μL，包括5.0 μL 酶切產(chǎn)物、3.0 μL 10×T4 DNA Buffer、0.5 μL T4 DNA ligase、1.0 μL Eco RI adaptor、1.0 μL Hpa II/Msp I adaptor、用ddH2O補足至30 μL，將混合物混勻于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.3 預擴增。

預擴增體系總體積為30.0 μL，包括3.0 μL 連接產(chǎn)物、0.5 μL Eco RI pre-selective primer、0.5 μL Hpa II/Msp I pre-selective primer、17.5 μL? 2 × Taq PCR master mix，用ddH2O補足至30 μL。PCR預擴增反應程序：72 ℃ 2 min →94 ℃ 2 min →94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（25個循環(huán)）→ 72 ℃ 10 min。預擴增產(chǎn)物稀釋30倍，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 選擇性擴增。

選擇性擴增體系總體積為50 μL，包括1 μL 稀釋30×預擴產(chǎn)物、1 μL Eco RI selective primer、1 μL Hpa II/Msp I selective primer、25 μL 2 × Taq PCR master mix，用ddH2O補足至50 μL。降式PCR擴增反應程序：94 ℃ 2 min → 94 ℃ 30 s → 65 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（15個循環(huán)，退火溫度每個循環(huán)降1 ℃）→ 94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min → 72 ℃ 10 min；將產(chǎn)物于70 ℃滅活10分鐘，4 ℃保存即可。

1.2.3.5 聚丙烯凝膠電泳檢測（PAGE）。

配制5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對選擇性擴增產(chǎn)物進行進一步分離：于大燒杯中加入33.3 mL Acr和20 mL 5×TBE Buffer，混合用玻璃棒攪拌均勻后，加入700 μL 10%的APS和65 μL TEMED溶液作為助凝劑，隨后用ddH2O補足至100 mL，迅速混勻后立即用10 mL移液槍向玻璃板內(nèi)灌膠［19］。制作好的凝膠板組裝放入含有1×TBE的電泳槽中，預電泳1 h使膠面溫度達到55 ℃時上樣，260 V下電泳3.5 h。電泳結(jié)束后，剝離2塊玻璃板，將長玻璃板上的電泳條帶進行固定、銀染和顯色，ddH2O沖洗干凈后，用凝膠成像系統(tǒng)（GBoxF3，GeneCompany Limited，UK）拍膠保存，并進行條帶計數(shù)和分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013（Microsoft、WA、USA）統(tǒng)計MSAP凝膠電泳圖上100～500 bp條帶，記錄條帶的有（1）和無（0）情況。DNA甲基化的限制性內(nèi)切位點（5′SCCGG）有3種不同的類型：①Eco RI-Hpa II和Eco RI-Msp I酶切片段都存在（1/1）表示未發(fā)生甲基化狀態(tài)；②Eco RI-Hpa II（1/0）或 Eco RI-Msp I（0/1）片段只存在1種，表示發(fā)生甲基化狀態(tài)（半甲基化或者雙鏈內(nèi)部甲基化）；③Eco RI-Hpa II and Eco RI-Msp I片段（0/0）被認為是可能由片段缺失或超甲基化造成的無信息位點［20］。在msap包中計算未甲基化、半甲基化、完全甲基化或不存在靶標的百分比，用半甲基化及全甲基化的總和衡量總甲基化水平［21］。對統(tǒng)計形成的0/1矩陣利用R軟件（RStudio，New Zealand）的msap軟件包進行統(tǒng)計分析；隨后，用分子方差分析（AMOVA）檢查整體分化和兩兩間的差異，用pegas包進行AMOVA分析，將Phi-st作為固定指數(shù)（分子數(shù)據(jù)中Fst的類似物）［22］；用ade4包進行主坐標分析（PCoA）［23］。

總擴增條帶數(shù)＝Type I+Type II+Type III+Type IV

總甲基化條帶數(shù)＝Type II+Type III

未甲基化率＝Type I條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

半甲基化率＝Type II條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

全甲基化率＝Type III條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

MSAP＝（Type II+Type III條帶數(shù)）/總甲基化條帶數(shù)×100％

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

由于MSAP技術對基因組DNA質(zhì)量要求很高，模板DNA的純度直接影響后續(xù)酶切、擴增以及MSAP譜帶的穩(wěn)定性，為滿足MSAP試驗要求，用核酸測定儀（BioSpec-nano）分別于260和280 nm處分別測定吸光度值以檢測DNA的濃度，一般情況認為OD260/OD280在1.7～1.9純度較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示樣本所提取的秦煙99葉片基因組DNA主帶清晰，無降解、無雜質(zhì)現(xiàn)象，符合試驗對DNA的要求。隨后用ddH2O將DNA濃度均稀釋為100? ng/μL可用于后續(xù)甲基化MSAP檢測（圖1）。

2.2 預擴增結(jié)果

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測預擴增產(chǎn)物，結(jié)果表明預擴增產(chǎn)物均勻彌散，且連續(xù)成片，有部分有條帶（圖2），符合MSAP選擴模板的要求。

2.3 MSAP試驗結(jié)果

依據(jù)以下標準統(tǒng)計聚丙烯酰胺凝膠條帶，選擇較為清晰的條帶進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。依據(jù)Schulz等［20］的相關研究將2種酶組合所產(chǎn)生的條帶類型分為4種情況：類型I，H和M均有條帶，記為（1，1），表示未發(fā)生甲基化；類型II，H有條帶，而M無條帶，記為（1，0），表示發(fā)生半甲基化；類型 Ⅲ，H無條帶，而M有條帶，記為（0，1），表示發(fā)生全甲基化；類型 Ⅳ，H和M均無條帶，記為（0，0），該類情況較為復雜，Schulz等［20］認為很可能是基因突變的結(jié)果，所以一般作為無信息處理。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖3。

2.4 白粉病對DNA甲基化水平的影響

由表2可知，與CK（對照組）相比，不論煙草白粉病發(fā)病程度高低，其總甲基化水平程度均上升，Ⅶ級發(fā)病程度誘導了最低的未甲基化和半甲基化水平，并隨著發(fā)病程度的增加，其DNA甲基化水平上升的程度越高，其總甲基化水平依次為Ⅲ級為24.31%，Ⅶ級為27.24%，Ⅸ級為29.61%。因此，不同程度的白粉病感染情況會影響煙草的DNA甲基化水平，其發(fā)病程度越高，總甲基化程度越高。

由表3可知，對照組（CK）的煙草與其他不同發(fā)病程度的煙草成對比較P值分別為0.048、0.029和0.027（P值均小于0.05），表明是有差異的。因此，煙草白粉病對秦煙99的DNA甲基化水平有顯著影響（P<0.05），且這種差異受到白粉病不同發(fā)病程度的影響。

秦煙99 DNA甲基化的PCoA分析圖顯示處理組之間存在顯著差異（Phi-ST=0.335 6，P<0.000 1）。2個主坐標軸分別解釋了甲基化差異的 12.0%和22.3%。Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ 均與CK組無重疊區(qū)域，但CK和 Ⅲ 距離較近，Ⅶ 和Ⅸ 距離較近（圖4）。

3 結(jié)論與討論

研究表明，DNA甲基化修飾會導致植物的某些重要性狀發(fā)生變化。如不同的生態(tài)條件會影響煙草基因組的表達，K326烤煙在不同生態(tài)區(qū)的甲基化水平不同［24］。該研究中，不同程度的白粉病感染秦煙99葉片會改變其DNA甲基化水平，并隨著感染程度的增加，DNA甲基化水平升高的程度越大。目前，關于DNA甲基化參與植物抗病的研究，主要集中于病原菌對植物基因組甲基化水平的影響，導致基因的表達水平發(fā)生變化，從而引起植物響應的生理生化變化，參與植物的抗病反應［25］。如Pst侵染擬南芥后，會降低CpG和CHH甲基化水平，但提高防御相關基因的表達水平［16］。DNA甲基化是在轉(zhuǎn)錄水平對基因進行調(diào)節(jié)，甲基化程度的高低直接影響了基因表達的活性。甲基化程度低，基因表達活躍；甲基化程度高，基因低表達或不表達。甲基化水平調(diào)控基因表達，基因表達時，其表現(xiàn)為低的甲基化水平；當在植物某階段不需該基因表達時，基因的啟動子或編碼區(qū)會重新發(fā)生甲基化，抑制基因的轉(zhuǎn)錄并終止其表達［26］。因此，秦煙99感染煙草白粉病后，DNA甲基化通過調(diào)控基因表達來滿足植物不同生長階段的需求，這對煙草的正常生長及適應復雜多變的外界環(huán)境提供了良好的調(diào)控機制。

該研究表明DNA甲基化介導不同煙草白粉病感染秦煙99的生長，使其適應環(huán)境正常生長，但仍存在不足，如該調(diào)控基因的表達方式是依賴目標基因的甲基化還是對目標基因起調(diào)控作用的其他基因的甲基化仍有待進一步研究。

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