重組蛋白中甘氨酸、組氨酸含量柱前衍生反相高效液相色譜檢測方法的建立及驗證

張小雪，梁舒靜，王惠欣，王輝

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司抗體藥物研制國家重點實驗室，河北石家莊050015

氨基酸是常見的蛋白質保護劑之一，常用氨基酸類蛋白質保護劑有甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、肌氨酸等［1-3］。本公司重組蛋白制品在制備過程中加入了適量的甘氨酸和組氨酸。低濃度甘氨酸降低了蛋白質藥物變性的風險［4-5］，可預防重組人生長激素在凍干過程中聚集［6-8］。組氨酸為較常見賦形劑，其內部咪唑基團有助于發(fā)揮較好的pH 緩沖作用［9-11］。重組制品中的游離氨基酸含量對其質量控制具有重要意義［12-13］，《中國藥典》三部（2020 版）生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質量控制的要求中，曾明確提出了生物制品生產(chǎn)企業(yè)用于生物制品注射劑生產(chǎn)的藥用輔料應檢測其含量［14-15］。本研究建立了重組蛋白制品中甘氨酸和組氨酸含量檢測的柱前衍生反相高效液相色譜法（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC），并對該方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1供試品及對照品 重組蛋白藥物（批號：20211011）為本公司自制；α-氨基丁酸、甘氨酸、組氨酸購自美國Sigma 公司。

1.2主要試劑及儀器 乙腈（色譜純）購自美國Honeywell 公司；AccQ·Fluor 氨基酸衍生試劑盒（waters WAT052880）、AccQ Tag Eluent A濃縮液（waters WAT-052890）、AccQ Tag氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm，Waters WAT052885）、高效液相色譜儀（2695）均購自美國Waters 公司；紫外檢測器（EVOLUTION 201）購自美國Thermo 公司；磺基水楊酸購自美國Sigma-Aldrich 公司；超濾離心管（UFC5010BK）購自美國Millipore公司。

1.3溶液配制

1.3.1流動相A 取200 mL AccQTag Eluent A 液（配方為：140 mmol／L乙酸鈉，17 mmol／L三乙胺，1 mg／mL EDTA 二鈉鹽，0.5%NaN3，用濃磷酸調pH 至4.95 或5.05）與2 000 mL 超純水混勻，經(jīng)0.22μm 有機濾膜過濾，超聲振蕩5 min。

1.3.2流動相B 取乙腈1 000 mL，經(jīng)0.22μm 有機濾膜過濾，超聲振蕩1 min。

1.3.3流動相C 取100%超純水1 000 mL，超聲振蕩10 min。

1.3.41.5%磺基水楊酸 取磺基水楊酸1.5 g，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5標準溶液

1.3.5.1α-氨基丁酸內標溶液取α-氨基丁酸40 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5.2甘氨酸標準溶液 取甘氨酸對照品375.5 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.5.3組氨酸標準溶液 取組氨酸對照品375.5 mg，加超純水定容至100 mL，混勻。

1.3.6AccQ·Fluor 衍生劑溶液 將AccQ·Fluor 衍生劑粉末輕彈至瓶底，加1 mL AccQ·Fluor稀釋劑，振蕩10 s，55 ℃加熱9 min使粉末溶解。

1.4標準曲線樣品、供試品、空白對照溶液的制備

1.4.1標準溶液 取甘氨酸標準溶液0.3 mL，用組氨酸標準溶液定容至10 mL，取0.9 mL，加1.5%磺基水楊酸8.1 mL，混勻，室溫靜置2 h；3 000×g離心10 min；分別取上清液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、1.0 mL，加超純水定容至1 mL，混勻。

1.4.2供試品及空白對照品溶液 每個重組制品平行制備3份供試品。分別取供試品和超純水0.1 mL，與0.9 mL 1.5%磺基水楊酸混勻，按1.4.1項靜置離心后，取0.3 mL上清液與0.7 mL超純水混勻。

1.5各溶液加內標溶液及衍生

1.5.1加內標溶液 分別取標準溶液、供試品溶液、空白對照品溶液各0.1 mL，加超純水0.4 mL，與α-氨基丁酸內標溶液0.1 mL混勻。

1.5.2衍生 分別取標準溶液、供試品溶液、空白對照品溶液各10μL，加硼酸緩沖液70μL，渦旋混合，瞬時離心后在渦旋狀態(tài)下加入AccQ·Fluor衍生劑溶液20μL，持續(xù)渦旋混合15 s。衍生后標準曲線中甘氨酸為2.25、4.51、6.76、7.89、9.01、11.27μg／mL，組氨酸為72.85、145.70、218.54、254.96、291.39、364.24μg／mL，即S1 ～S6溶液。

1.6檢測方法 將S1 ～S6溶液、供試品溶液、空白對照品溶液按表1 試驗條件進樣分析。色譜條件：色譜柱為AccQ Tag-C18（3.9 mm × 150 mm，4 μm）；紫外檢測波長為248 nm；柱溫為37 ℃；上樣體積為10μL。進樣前用流動相A 平衡30 min，至基線平穩(wěn)。按照空白對照、S1 ～S6、系統(tǒng)適用性（S3）、供試品溶液依次進樣，以S3 為系統(tǒng)適用性樣品，每3 ～6 個樣品后加入1針系統(tǒng)適用性樣品，依次循環(huán)。

表1 試驗條件Tab.1 Experiment condition

1.7方法的驗證

1.7.1專屬性 取不含甘氨酸、組氨酸的空白制劑溶液，用空白制劑溶液超濾換液后的重組蛋白溶液，按1.5項方法加入內標溶液和衍生后，按1.6項方法檢測甘氨酸、組氨酸與內標α-氨基丁酸的分離情況。

1.7.2線性 將S1 ～S6 溶液分別進樣，以甘氨酸或組氨酸濃度為橫坐標，甘氨酸或組氨酸峰面積／內標峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性相關系數(shù)（R2）。

1.7.3檢測限 按1.5 項衍生后制備甘氨酸、組氨酸分別為1.13、36.43μg／mL的SL1溶液和甘氨酸、組氨酸分別為0.56、18.21μg／mL的SL2溶液，進樣分析各樣品信噪比。

1.7.4定量限 將組氨酸與甘氨酸對照品溶液按7∶1混合，平行制備6份。按1.5項衍生后制備甘氨酸、組氨酸分別為4.69、32.86μg／mL 的溶液，進樣分析，計算甘氨酸或組氨酸峰面積／內標峰面積值的RSD。

1.7.5重復性 平行取6份重組蛋白制品（批號：2021-1011），按1.5和1.6項方法進行衍生和液相分析，每份樣品進樣1 次，檢測甘氨酸或組氨酸含量，并計算其峰面積／內標峰面積值的RSD。

1.7.6中間精密度 不同實驗人員于不同日期對6份重組蛋白制品（批號：20211011）進行衍生和液相分析，每份樣品進樣1 針，計算不同實驗人員不同日期檢測同一樣品的RSD。

1.7.7準確度 將供試品和甘氨酸、組氨酸混合標準溶液，分別按1.4 項取上清液后，按低、中、高劑量（0.2、0.3、0.4 mL）加入經(jīng)1.4 項處理的0.15 mL 重組蛋白上清液中，用水定容至1 mL，每組平行制備3份，經(jīng)沉淀蛋白，按1.5和1.6項方法進行衍生、液相分析，計算甘氨酸、組氨酸加樣回收率。

1.7.8溶液穩(wěn)定性 分別取1 份供試品、標準溶液S3，按1.4 項處理后，按1.5 和1.6 項方法進行衍生、液相分析，將同一個樣品分別在0、12、18、24、30、48 h進樣分析，計算甘氨酸或組氨酸峰面積／內標峰面積值的RSD。

1.8數(shù)據(jù)采集及分析 使用Waters Empower 3 色譜數(shù)據(jù)軟件采集和處理數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1專屬性 在甘氨酸、組氨酸出峰位置無可見干擾峰，符合專屬性驗證要求。內標峰與甘氨酸、組氨酸峰充分分離。見圖1。

圖1 α-氨基丁酸與甘氨酸、組氨酸分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of Glycine and Histidine separated from α-aminobutyric

2.2線性 甘氨酸濃度在2.25 ～11.27μg／mL范圍內，組氨酸濃度在72.85 ～364.24μg／mL范圍內，標準曲線線性良好，R2分別為0.997、0.999，均＞0.99，見圖2。

圖2 甘氨酸（A）、組氨酸（B）標準曲線Fig.2 Standard curve of Glycine（A），Histidine（B）

2.3檢測限 甘氨酸濃度為2.25 μg／mL 時，信噪比為2.5，為滿足供試品檢測要求，且信噪比接近3，因此確定甘氨酸檢測限為2.25 μg／mL；組氨酸濃度為18.21 μg／mL 時，信噪比為17，確定為組氨酸的檢測限為18.21μg／mL。

2.4定量限 甘氨酸濃度為4.69μg／mL、組氨酸濃度為32.86μg／mL時，兩者信噪比分別為5和20，將此作為定量限，均低于供試品經(jīng)衍生處理后甘氨酸（6.76μg／mL）和組氨酸（218.54μg／mL）理論含量。6 份定量限樣品甘氨酸和組氨酸峰面積／內標峰面積值的RSD分別為9.2%和2.5%，符合驗證要求。

2.5重復性 6 份樣品甘氨酸濃度的RSD為4.6%，組氨酸濃度的RSD為5.0%，符合重復性驗證要求。見表2。

表2 重復性驗證結果（μg／mL）Tab.2 Verification for reproducibility（μg／mL）

2.6中間精密度 不同實驗員不同日期檢測甘氨酸濃度的RSD為6.9%，組氨酸濃度的RSD為2.0%，符合中間精密度驗證要求。見表3。

表3 中間精密度驗證結果（μg／mL）Tab.3 Verification for intermediate precision（μg／mL）

2.7準確度 甘氨酸低、中、高濃度的平均回收率分別為111.7%、108.7%、75.9%，各濃度回收率RSD分別為7.5%、2.8%、15.7%；組氨酸低、中、高濃度的回收率分別為97.3%、94.5%、88.9%，各濃度回收率RSD分別為0.8%、2.6%、9.7%。表明該方法準確度良好。

2.8溶液穩(wěn)定性 在0、12、18、24、30、48 h 內，標準品衍生樣品溶液甘氨酸濃度的RSD為4.3%，組氨酸濃度的RSD為3.4%；供試品衍生樣品溶液甘氨酸濃度的RSD為7.7%，組氨酸濃度的RSD為3.3%。見表4。表明供試品在48 h內穩(wěn)定。

表4 溶液穩(wěn)定性驗證（μg／mL）Tab.4 Verification for solution stability（μg／mL）

3 討論

涉及到游離氨基酸含量檢測的方法目前有分光光度法、氨基酸分析儀法、HPLC 法和液相色譜-串聯(lián)質譜法、超臨界流體色譜法、多維液相色譜法等［16-18］，受檢測成本和應用范圍的影響，在重組蛋白制品的測定中，HPLC 法為常用的測定方法［19-22］。但目前，RP-HPLC在針對重組蛋白檢測的實際應用中多是僅測定1種氨基酸，且測定含量相對較高［23-24］。本研究建立的方法可同時檢測兩種含量相差數(shù)倍的游離氨基酸，其中甘氨酸的標準曲線在2.25 ～11.27μg／mL范圍內。注射液中甘氨酸含量接近定量限，易受干擾，在一定程度上增加了甘氨酸檢測難度，本研究為同時檢測蛋白制品中兩種含量相差數(shù)倍的游離氨基酸提供了思路。

本研究采用內標法，相比于外標法，內標法可校正物理和化學損失，提高測定的準確性［25-26］。α-氨基丁酸作為本研究內標，性質與甘氨酸、組氨酸相近，能完全溶解于供試品中，且能與待測氨基酸各峰充分分離，可滿足甘氨酸、組氨酸含量的測定需求［27-28］。

本研究以AccQ·Fluor氨基酸衍生試劑作為衍生劑，柱前衍生過程為實驗的關鍵步驟［29-30］，經(jīng)優(yōu)化，將在硼酸環(huán)境中定量的游離氨基酸與過量AccQ 衍生劑迅速混合，衍生時采用水平圓周振蕩器IKA MS 3 basic，調整轉速至500 r／min，此時溶液形成渦流狀態(tài)，操作簡單且衍生效果較好。各樣品分別用計時器單獨混勻15 s，快速操作，并保證衍生劑現(xiàn)用現(xiàn)配，以避免衍生劑與空氣接觸，經(jīng)衍生生成的氨基酸衍生物較穩(wěn)定。

本研究優(yōu)化并明確了柱前衍生的操作，采用內標法同時測定出兩種氨基酸。該方法專屬性好，分離完全，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，適用性較強，測定結果準確，可操作性強，可用于重組蛋白制品中甘氨酸、組氨酸含量的檢測。