豬細小病毒S-1A株對細胞的適應性及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

朱永軍 張婉華 林鷙 何錫忠 彭麗英

摘 ?要：將豬細小病毒S-1A株在不同的細胞中培養(yǎng)，測定病毒含量，以確定適合豬細小病毒S-1A株增殖的細胞。結果表明：豬細小病毒S-1A株能在豬腎傳代細胞系（PK-15）、豬腎原代細胞（PK）、豬睪丸細胞（ST）和仔豬腎細胞（IBRS-2）中生長增殖，不能在幼倉鼠腎細胞系（BHK-21）、綠猴腎細胞（Vero）和雞胚成纖維細胞（CEF）中增殖；當ST細胞生長至2/3單層時，將豬細小病毒S-1A株種毒液100倍或1 000倍稀釋后接種ST細胞，37 ℃培養(yǎng)96～144 h，獲得的病毒載量最高。

關鍵詞：豬細小病毒S-1A株；ST細胞；培養(yǎng)條件

中圖分類號：S816.79 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）03-0041-04

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一[1]。1966年，Mayr在進行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時首次發(fā)現(xiàn)PPV，通過核酸鑒定證明為DNA病毒[2]。豬細小病毒病的主要特征是懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現(xiàn)臨床癥狀，其他豬感染后也無明顯的臨床癥狀[3-4]。

豬細小病毒能在豬的細胞（包括豬睪丸細胞、豬腎原代細胞及傳代細胞系）和人的某些傳代細胞系中培養(yǎng)增殖[1]，適合在正處于有絲分裂期的細胞內增殖。細胞感染豬細小病毒后初期呈現(xiàn)彌漫性顆粒樣病變，隨后細胞圓縮、拉網(wǎng)、脫落。1982年，上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所用仔豬腎原代細胞從上海郊區(qū)某豬場所產(chǎn)的死胎中分離到一株PPV，將其在細胞上連續(xù)傳代、純化，獲得一株具有良好的免疫原性的PPV強毒株，命名為PPVS-1A株。本研究將PPVS-1A株在不同的細胞內培養(yǎng)，以獲得一種適合該病毒的細胞，并優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

1 ?試驗材料

1.1 細胞與病毒

豬腎傳代細胞系（PK-l5）、豬睪丸細胞（ST）、仔豬腎細胞（IBRS-2）、綠猴腎細胞（Vero）、幼倉鼠腎傳代細胞系（BHK-21），均由本實驗室保存。豬腎原代細胞（PK）、雞胚成纖維細胞（CEF），均由本實驗室按常規(guī)方法制備。

PPVS-1A株由本實驗室分離鑒定、傳代并保存。

1.2 培養(yǎng)基

DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清，購自GIBCO公司；胰酶購自Sigma公司。

細胞生長液為含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細胞維持液為含2％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

2 ?試驗方法

2.1 細胞接種

按常規(guī)方法培養(yǎng)或制備PK-15、BHK-21、IBRS-2、PK、ST、Vero和CEF細胞單層。用PPVS-1A株病毒液接種細胞，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變效應并記錄。當細胞病變效應達75％以上時，收獲細胞培養(yǎng)物，并測定病毒含量；沒有細胞病變效應的細胞均于接毒后7 d收獲，－70 ℃凍融3次后傳代，盲傳3代，每代均觀察有無細胞病變效應。

2.2 病毒含量測定

用細胞生長液將種毒液作10倍系列稀釋，4個稀釋度10－4、10－5、10－6、10－7 ，分別接種有絲分裂期的相應細胞（96孔細胞培養(yǎng)板），每個稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL，同時設細胞陰性對照孔，接種后，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每天觀察細胞病變效應，測定病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）。

2.3 血凝試驗

在96孔板的第1孔至第12孔，每孔加入磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH＝7.4）0.05 mL，取被檢樣品0.05 mL，從第1孔起，依次作 ? 2倍系列稀釋，至最后一個孔，每孔加入0.5％豚鼠紅細胞懸液0.05 mL，并設紅細胞對照孔，搖勻，置25～28 ℃作用35～45 min后觀察結果，并記錄。

2.4 最佳接毒劑量的確定

將PPVS-1A株種毒液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍后接種ST細胞，觀察細胞病變效應。當75％以上的細胞出現(xiàn)細胞病變效應時收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次，分別測定TCID50。TCID50最高的接毒劑量為最佳接毒劑量，且血凝效價大于1∶1 024。

2.5 最佳接毒時間的確定

分別采用病毒與ST細胞同步接種、形成2/3細胞單層接種及形成良好單層接種這三種方法來接種PPVS-1A株病毒液，37 ℃培養(yǎng)。當75％以上的細胞出現(xiàn)細胞病變效應時收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次，分別測定TCID50。TCID50最高的接毒時間為最佳接毒時間，且血凝效價大于1∶1 024。

2.6 最佳收毒時間的確定

將PPVS-1A株病毒液接種ST細胞，分別于37 ℃培養(yǎng)60 h、72 h、84 h、96 h、120 h、144 h后收獲細胞毒液，－70 ℃反復凍融3次后，分別測定其病毒含量（TCID50），以TCID50最高者的收毒時間為最佳收毒時間，且血凝效價大于1∶1 024。

3 ?試驗結果

3.1 細胞適應性結果

將PPVS-1A株病毒液接種PK-15、PK、ST、IBRS-2細胞，第1代細胞均出現(xiàn)細胞病變效應，主要表現(xiàn)為細胞圓縮、拉網(wǎng)、脫落，當細胞病變效應達到75％以上時收獲細胞培養(yǎng)物。接種BHK-21、Vero和CEF細胞均未出現(xiàn)細胞病變效應，盲傳3代也未有細胞病變效應。

3.2 病毒含量測定結果

取上述細胞培養(yǎng)物，凍融3次后接種同種細胞，計算病毒含量。ST細胞增殖的病毒含量為107.50 TCID50/mL；PK-15細胞增殖的病毒含量為107.25 TCID50/mL；PK細胞增殖的病毒含量為107.00 TCID50/mL；IBRS-2細胞增殖的病毒含量為106.25 TCID50/mL；其他幾種細胞接種后均未出現(xiàn)細胞病變效應，盲傳3代的原代培養(yǎng)物均未測出PPVS-1A株病毒。

3.3 最佳接毒劑量

試驗結果顯示，種毒液稀釋10倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為106.00～106.25 TCID50/mL；種毒液稀釋100倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為107.00～107.50 TCID50/mL，且血凝效價均大于1∶1 024；種毒液稀釋1 000倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為107.00～ ? ?107.50 TCID50/mL，且血凝效價大于1∶1 024；種毒液稀釋10 000倍后接種細胞，收獲細胞時測得的病毒含量為106.00～106.75 TCID50/mL。試驗表明，最佳接毒劑量為種毒液稀釋100或1 000倍。詳見表1。

3.4 最佳接毒時間

結果顯示，細胞形成2/3單層時接種病毒，病毒含量最高，且血凝效價大于1∶1 024。其次是同步接種，最后是形成良好單層時接種。試驗表明，細胞形成2/3單層時接種PPVS-1A株最佳。詳見表2。

3.5 最佳收毒時間

結果表明，接毒后96～144 h收毒，細胞病變效應可達75％以上，病毒含量在107.25 TCID50/mL以上，且血凝效價大于1∶ 1 024。詳見表3。

4 ?討論

本研究對細胞適應性得出的結果與Bergeron等[5]、Cartwright等[6]和Wu等[7]國內外學者的研究結果相似，結果表明，PPVS-1A株能在PK-15、PK、ST和IBRS-2等豬源細胞中增殖，不能在BHK-21、Vero和CEF細胞中增殖。PK細胞是原代細胞，制備繁瑣且原材料來源受限；IBRS-2細胞增殖的病毒含量較低；PK-15細胞增殖的病毒含量較高，但PK-15細胞易于污染豬圓環(huán)病毒；ST細胞為傳代細胞系，細胞形態(tài)好，生長快，易于培養(yǎng)，增殖的病毒含量較高。因此，本研究選用ST細胞系來增殖PPVS-1A株。

根據(jù)試驗結果，PPVS-1A株在ST細胞系上的最佳培養(yǎng)條件為：在細胞形成2/3單層時接種培養(yǎng)，種毒液稀釋100倍或1 000倍后接種，置37 ℃培養(yǎng)96～144 h。

趙潤澤等[8]和趙文影等[9]對河南、北京、江蘇、安徽等地區(qū)PPV流行情況進行調查，結果顯示2021年的PPV核酸檢出率比2020年的明顯升高，說明目前豬細小病毒病已普遍存在于豬群中，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究對PPVS-1A株的細胞適應性和在ST細胞系上的最佳培養(yǎng)條件的研究為豬細小病毒病疫苗的研發(fā)提供了基礎。

參考文獻

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[5] BERGERON J，HEBERT B，TIJSSEN P．Genome organization of the Kresse strain of porcine parvovirus： identification of the allotropic determinant and comparison with those of NADL-2 and field isolates[J]．Journal of Virology，1996，70（4）：2508-2515．

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[9] 趙文影，張云靜，白小飛，等．豬細小病毒BJ2株的分離鑒定及全基因組序列分析[J]．河南農(nóng)業(yè)科學，2023，52（2）：136-144．