宮頸癌組織ERCC1、hMSH2表達及病理特征與鉑類藥物抵抗的相關(guān)性研究

吳培培,施朕善,李東鵬,馬家芹,翟璠

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬亳州醫(yī)院婦科,安徽 亳州 236800;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬亳州醫(yī)院腫瘤科,安徽 亳州 236800;3.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬亳州醫(yī)院病理科,安徽 亳州 236800)

宮頸癌為女性常見惡性腫瘤,發(fā)病率、死亡率較高,是造成女性死亡的主要惡性腫瘤[1]。宮頸癌發(fā)病隱匿,多數(shù)患者初次確診已進展為中晚期,喪失手術(shù)治療時機,只能采用保守治療方式延長患者生存時間[2]。以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療為中晚期宮頸癌主要治療方式,能有效降低局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移率,延長患者生存時間[3]。但研究表明鉑類藥物同期放化療治療效果存在明顯個體差異,部分宮頸癌患者在承受藥物毒副作用、經(jīng)濟負擔的同時,卻無法獲取良好的治療效果[4]。因此,能否通過相關(guān)檢測篩查出能在同步放化療中收益的患者,對于宮頸癌患者個體化治療具有重要意義。鉑類藥物可與癌細胞內(nèi)DNA發(fā)生交聯(lián),引發(fā)DNA單鏈損傷,發(fā)揮抗腫瘤效果,而DNA修復(fù)是影響宮頸癌患者鉑類藥物耐藥的主要機制[5]。核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)屬修復(fù)家族重要成員,在DNA修復(fù)中具有重要作用[6]。而錯配修復(fù)基因2(hMSH2)能識別復(fù)制中錯配堿基及插入缺失環(huán),是完成DNA修復(fù)的必需組件[7]。以上兩種基因均與DNA修復(fù)有關(guān),在DNA修復(fù)中具有重要作用,由此推測是否可通過分析ERCC1、hMSH2表達情況來預(yù)測宮頸癌患者鉑類藥物反應(yīng)性?；诖?本研究嘗試探究宮頸癌組織ERCC1、hMSH2表達與病理特征及鉑類藥物抵抗的相關(guān)性。報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。收集2019年1月—2022年3月我院86例宮頸癌患者病理組織為觀察組。納入標準:均經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌;均為中晚期,無法實施手術(shù)治療;病例資料及隨訪資料完整。排除標準:合并其他惡性腫瘤;遠處轉(zhuǎn)移;急慢性炎癥;合并心、肝、腎等重要臟器嚴重病變;血液性疾病;嚴重感染性疾病或免疫性疾病;精神異常、認知障礙。另收集同期72例因子宮肌瘤手術(shù)切除的正常宮頸組織為對照組。

1.2 方法 ①病理特征收集:通過查閱電子病歷獲取患者病理特征信息,包括年齡、分化程度、腫瘤直徑、肌層浸潤深度、組織類型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等;②ERCC1、hMSH2檢測:與病理醫(yī)生共同,將獲取的組織經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,高溫抗原修復(fù)15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,每次5 min,二甲苯脫蠟,孵育10 min(0.3%過氧化氫),滅活內(nèi)源性過氧化物酶;PBS沖洗3次,每次5 min,山羊血清封閉,室溫下孵育30 min,分別滴加一抗鼠抗人hMSH2抗體、ERCC1抗體(美國Pharmingen公司),過夜孵育(4 ℃),加入相應(yīng)二抗,孵育2 h(室溫),顯色、復(fù)染、脫水封片。結(jié)果判定:陽性細胞數(shù)≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%(分組區(qū)間數(shù)值有問題)分別計0分、1分、2分、3分、4分;不著色、顏色淺、顏色深分別為0分、1分、2分;二者乘積為最終判定結(jié)果,其中0～3為陰性,3～8為陽性;③治療方案:所有患者均予以放療,即以15MV-X進行盆腔前后野照射,全盆腔照射劑量為1.8～2.0 Gy/次,5次/周,總量DT 45～50 Gy,在照射25～30 Gy后中間擋鉛;然后進行腔內(nèi)后裝治療,后裝當天不進行盆腔照射,后裝治療6 Gy/次,1次/周,A點劑量30 Gy/5次。與放療第1天開始單藥使用奈達鉑進行化療增敏,每次40 mg·m-2,1次/周,共使用6次。在放化療結(jié)束后進行療效評估,以實體瘤療效評價標準[8]評估,分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD),其中CR、PR為鉑類藥物敏感,SD、PD為抵抗。

1.3 觀察指標 ①比較2組ERCC1、hMSH2表達情況;②癌組織ERCC1、hMSH2表達與病理特征相關(guān)性;③鉑類藥物抵抗患者病理特征及ERCC1、hMSH2表達情況;④影響宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的多因素分析;⑤ERCC1、hMSH2表達對鉑類藥物抵抗的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以例數(shù)描述,采用χ2檢驗,影響因素采用Logistic回歸分析,預(yù)測價值采用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線,獲取AUC、置信區(qū)間、敏感度、特異度,聯(lián)合預(yù)測實施Logistic二元回歸擬合,返回預(yù)測概率logit(p),將其作為獨立檢驗變量。均采用雙側(cè)檢驗,α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織、正常組織ERCC1、hMSH2表達情況 觀察組ERCC1、hMSH2陽性率較對照組高(P<0.05),結(jié)果見表1。

表1 宮頸癌組織、正常組織ERCC1、hMSH2表達情況[n(%)]

2.2 癌組織ERCC1、hMSH2表達與病理特征相關(guān)性 癌組織ERCC1、hMSH2表達與年齡、腫瘤直徑、分化程度、病理類型無關(guān)(P>0.05),與肌層浸潤深度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),結(jié)果見表2。

表2 癌組織ERCC1、hMSH2表達與病理特征相關(guān)性

2.3 鉑類藥物抵抗患者病理特征及ERCC1、hMSH2表達情況 所有患者在經(jīng)治療后47例鉑類藥物敏感(9例CR、38例PR),39例鉑類藥物抵抗(25例SD、14例PD),鉑類藥物抵抗患者與肌層浸潤深度、分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERCC1、hMSH2陽性有關(guān)(P<0.05),結(jié)果見表3。

表3 不同鉑類藥物反應(yīng)性患者病理特征及ERCC1、hMSH2表達情況

2.4 影響宮頸癌患者鉑類藥物敏感的多因素分析 以宮頸癌患者經(jīng)鉑類藥物治療后反應(yīng)性作為因變量(敏感=0,抵抗=1),以單因素分析中有差異的變量作為自變量,應(yīng)用多因素Logistic回歸方程分析,結(jié)果顯示,將肌層浸潤深度、分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移控制后,癌組織ERCC1、hMSH2陽性仍為宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的危險因素(P<0.05),結(jié)果見表4。

表4 影響宮頸癌患者鉑類藥物敏感的多因素分析

2.5 ERCC1、hMSH2表達對鉑類藥物敏感的預(yù)測價值 以宮頸癌患者經(jīng)鉑類藥物治療后抵抗為陽性樣本,以敏感為陰性樣本,繪制ERCC1、hMSH2陽性預(yù)測經(jīng)鉑類藥物治療后抵抗的ROC,結(jié)果顯示,ERCC1陽性、hMSH2陽性預(yù)測經(jīng)鉑類藥物治療后抵抗的AUC分別為0.631、0.634;應(yīng)用SPSS軟件的聯(lián)合應(yīng)用ROC理論模式,構(gòu)建各指標聯(lián)合預(yù)測的ROC模型,結(jié)果顯示,聯(lián)合預(yù)測AUC最大,為0.702,見表5、圖1。

圖1 ERCC1、hMSH2陽性預(yù)測鉑類藥物抵抗的ROC曲線

表5 ERCC1、hMSH2表達對鉑類藥物敏感的預(yù)測價值

3 討論

3.1 完善宮頸癌患者診療機制可提高患者生存率 早期宮頸癌患者通過手術(shù)切除病灶可達到根治效果,而對于無法進行手術(shù)治療的患者則需要采用放療或化療方式延長患者生存時間[9]。既往研究指出,對于進行放療的宮頸癌患者,建議同步接收順鉑實施化療,可使患者明顯受益,但順鉑的毒副反應(yīng)導(dǎo)致部分患者無法耐受,從而無法順利完成治療[10]。而奈達鉑作為第二代鉑類藥物,其機制與順鉑相同,但毒副作用小,與順鉑具有同樣的療效。因此本研究選用奈達鉑為化療藥物。但即便如此,仍有部分患者對化療不敏感,具體表現(xiàn)為PD、SD明顯延長。因此探究宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的原因?qū)ν晟圃摬≡\療機制、提高患者生存率十分重要。

3.2 DNA損傷修復(fù)與鉑類藥物抵抗的相關(guān)性分析 研究指出,藥物療效存在個體差異在臨床十分常見,臨床醫(yī)師也一直關(guān)注這一問題,隨著分子遺傳學(xué)、分子藥理學(xué)發(fā)展,越來越多的學(xué)者認為這一差異源于基因的差異[11]。一般來說宮頸癌患者發(fā)生鉑類藥物抵抗為繼發(fā)性耐藥,即隨藥物服用次數(shù)增加,導(dǎo)致藥物脫敏,對藥物呈現(xiàn)低敏感性,從而導(dǎo)致治療效果較差[12]。我們分析鉑類藥物的作用機制發(fā)現(xiàn),奈達鉑主要作用靶點為DNA,進入機體后可水解為雙氯雙氨鉑,與腫瘤細胞DNA形成奈達鉑-DNA加合物,從而使DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄受到影響,導(dǎo)致DNA損傷,但臨床中發(fā)現(xiàn),不同患者對DNA損傷程度不同,這也是出現(xiàn)個體療效差異的重要原因[13]。研究指出,癌癥患者采用鉑類藥物后出現(xiàn)DNA損傷程度不同的原因在于機體存在可使受損DNA恢復(fù)正常的有效修復(fù)系統(tǒng),因此DNA損傷修復(fù)可能是鉑類藥物抵抗的重要原因[14]。ERCC1基因為DNA損傷、識別、修復(fù)重要組成部分,核苷酸切除修復(fù)為其減輕DNA損傷的主要機制,ERCC1表達量直接影響DNA修復(fù)的生理過程[15]。目前已有研究證實,ERCC1與多種癌癥的發(fā)生有關(guān),與病理特征具有明顯相關(guān)性,其中發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ERCC1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者臨床分期有關(guān),說明ERCC1高表達的宮頸癌細胞浸潤性更強,惡性程度更高,可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果顯示宮頸癌組織ERCC1呈高表達狀態(tài),與肌層浸潤深度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),與上述研究類似,說明ERCC1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。此外,本研究通過分析不同鉑類藥物反應(yīng)性患者ERCC1表達發(fā)現(xiàn),鉑類藥物抵抗患者ERCC1陽性率較高,且ERCC1陽性為宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的危險因素。分析原因在于DNA損傷修復(fù)為影響鉑類藥物敏感性的重要原因,而核苷酸切除修復(fù)時DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中的重要組成,ERCC1在核苷酸切除修復(fù)中具有關(guān)鍵作用,ERCC1可將距損傷位點15～24個核苷酸處將DNA單鏈切開,這一表達產(chǎn)物可結(jié)合DNA修復(fù)酶缺乏互補基因,形成異二聚體,參與核苷酸切除修復(fù)中的調(diào)節(jié)或限速,從而導(dǎo)致腫瘤細胞DNA損傷減輕,發(fā)生藥物抵抗[17-18]。

3.3 ERCC1、hMSH2預(yù)測宮頸癌患者鉑類藥物反應(yīng)性的價值 研究指出,基因不穩(wěn)定性是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的重要原因,錯配修復(fù)(MMP)系統(tǒng)為遺傳不穩(wěn)定性的守護者,可特異性識別、修復(fù)DNA復(fù)制過程中堿基錯配,維持基因組穩(wěn)定性,降低自發(fā)性突變過程,hMSH2為錯配修復(fù)過程必須參與基因,能識別復(fù)制中錯配堿基,是完成修復(fù)必須組成[19]。陶萍萍等[20]研究指出,hMSH2蛋白在宮頸癌患者中呈高表達狀態(tài),其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,同時hMSH2高表達與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān),原因可能是在DNA復(fù)制過程中,hMSH2功能缺陷,不能及時修復(fù)DNA復(fù)制時的堿基錯配,使突變的癌基因和抑癌基因得不到有效修復(fù),基因突變累積,錯配修復(fù)系統(tǒng)啟動,反饋性誘發(fā)hMSH2蛋白表達增加。本研究同樣發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織hMSH2呈高表達狀態(tài),與肌層浸潤深度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明hMSH2可能參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。正常生理狀態(tài)下DNA修復(fù)處于休眠狀態(tài),當細胞DNA受損時,修復(fù)基因被激活,從而發(fā)揮修復(fù)功能,而腫瘤細胞屬于異己突變細胞,在這一狀態(tài)下,細胞修復(fù)系統(tǒng)可能被激活,從而出現(xiàn)hMSH2表達增多現(xiàn)象[21]。本研究還發(fā)現(xiàn),鉑類藥物抵抗患者hMSH2陽性率較高,且hMSH2陽性為宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的危險因素。這可能是由于腫瘤細胞DNA損傷時,為修復(fù)這一損傷,使細胞修復(fù)系統(tǒng)被激活,hMSH2表達明顯增加,且其表達水平越高,導(dǎo)致機體對鉑類藥物的耐藥性越大[22]。結(jié)合以上ERCC1、hMSH2與宮頸癌組織中的生物學(xué)特征及與鉑類藥物抵抗的關(guān)系,推測ERCC1、hMSH2或許可用于預(yù)測宮頸癌患者鉑類藥物反應(yīng)性。本研究通過繪制ERCC1、hMSH2陽性預(yù)測宮頸癌患者鉑類藥物抵抗的ROC曲線發(fā)現(xiàn),ERCC1、hMSH2陽性預(yù)測鉑類藥物抵抗的AUC分別為0.631、0.634,且聯(lián)合預(yù)測預(yù)后的AUC為0.702,大于單一指標預(yù)測?？梢妼RCC1、hMSH2聯(lián)合用于預(yù)測宮頸癌患者鉑類藥物抵抗可提升預(yù)測評估價值,對治療方案的完善具有重要意義。

綜上所述,宮頸癌組織ERCC1、hMSH2呈高表達狀態(tài),且與病理特征及鉑類藥物抵抗有關(guān),二者可用于預(yù)測鉑類藥物反應(yīng)性,從而指導(dǎo)臨床干預(yù)方案。