ω-3 PUFA 在肺結(jié)節(jié)患者血清中的表達(dá)及數(shù)字預(yù)測(cè)模型的建立

姚 益 胡秋霞 李 季 王 毅 楊彥輝 李曉亮 羅 雷 雷 雨 謝曉陽(yáng)

四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬內(nèi)江醫(yī)院胸心外科，四川內(nèi)江 641000

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤。2020 年全球新發(fā)的1 929.0 萬(wàn)例癌癥病例中肺癌發(fā)病率高達(dá)220.6 萬(wàn)；995.0 萬(wàn)癌癥死亡病例中肺癌死亡高達(dá)179.6 萬(wàn)例[1]。肺癌患者的預(yù)后依賴于肺部結(jié)節(jié)的早發(fā)現(xiàn)、早診斷。隨著低劑量CT（low-dose computed tomography，LDCT）的普及使無(wú)癥狀個(gè)體中不確定肺結(jié)節(jié)的檢出率達(dá)26.32%～31.00%[2]，增加了早期肺癌檢出率從而降低肺癌患者死亡率并延長(zhǎng)了生存期[3]。但LDCT 的高假陽(yáng)性率仍是一個(gè)亟須解決的問題。前期研究已顯示[4-6]，ω-3 多不飽和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）作為一種重要的免疫營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可使人群肺癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌發(fā)病率降低。然而，ω-3 PUFA 在良、惡性肺結(jié)節(jié)患者血清中表達(dá)是否有差異還未見報(bào)道。因此，測(cè)定比較良、惡性肺結(jié)節(jié)患者血清中ω-3 PUFA 的濃度差異，并聯(lián)合LDCT 建立概率預(yù)測(cè)模型提高肺結(jié)節(jié)診斷效能對(duì)于早期肺癌診斷具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年1 月至2021 年12 月四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院胸心外科收治的肺結(jié)節(jié)患者294 例，年齡25～81 歲。CT 表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)內(nèi)直徑≤3 cm 且具有清晰或者模糊的邊緣，不伴有肺不張、縱隔淋巴結(jié)腫大及胸腔積液的類圓形密度增高影定義為肺結(jié)節(jié)[7]。讀片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的放射科醫(yī)師診斷確定肺結(jié)節(jié)影像學(xué)特征。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸部CT 提示直徑≤3 cm肺內(nèi)腫塊；②病理診斷明確且資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①就診前已接受過抗腫瘤治療；②目前患者有嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙，或者存在嚴(yán)重感染；③測(cè)量前1 周應(yīng)用過高劑量利尿劑或應(yīng)用過可影響測(cè)量指標(biāo)相關(guān)藥物。將患者按約2∶1 比例簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣分為兩組，建模組201 例，驗(yàn)證組93 例。建模組男91 例、女110 例，年齡（56.92±12.44）歲；驗(yàn)證組男53 例、女40 例，年齡（55.06±11.68）歲。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-倫審批-43）。

1.2 數(shù)據(jù)收集

通過手術(shù)或肺穿刺活檢明確肺結(jié)節(jié)病理。比較兩組基線臨床資料（性別、年齡、吸煙史、腫瘤病史），ω-3 PUFA，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell antigen，SCC），細(xì)胞角蛋白19 片段抗原（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）；CT 影像學(xué)重要指標(biāo)[8-9]（病灶直徑、腫瘤實(shí)性成分直徑比值（consolidation/tumor ratio，CTR），血管征，支氣管充氣征、結(jié)節(jié)邊界、短毛刺、分葉征、胸膜牽拉）。其中ω-3 PUFA 濃度通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定，其他指標(biāo)通過醫(yī)院病歷及檢驗(yàn)系統(tǒng)收集并將CEA≤5.09 ng/ml定義為陰性，＞5.09 ng/ml 定義為陽(yáng)性，將SCC≤1.50 ng/ml定義為陰性，＞1.50 ng/ml 定義為陽(yáng)性；將CYFRA21-1≤3.30ng/ml 定義為陰性，＞3.30 ng/ml 定義為陽(yáng)性。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)ω-3 PUFA 濃度

收集患者入院時(shí)空腹全血，靜置1 h 后離心（3 000 r/min，10 min，離心半徑6 cm）收集血清。根據(jù)ω-3 PUFA 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法試劑盒（南京卡米洛生物公司，批號(hào)：190909）使用說明書將包被好抗體的96孔板加待檢抗原，37℃60 min，洗滌3 次后拋干，加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）再次37℃、60 min 孵育，洗滌3 次后拋干；加入酶標(biāo)抗Ab-2 抗體→37℃、60 min，洗滌3 次后拋干；加底物液→37℃、20 min，加終止液；用酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）測(cè)定OD 值并換算為ω-3 PUFA 濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用logistic 回歸分析影響因素，并建立預(yù)測(cè)模型并給予驗(yàn)證。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ω-3 PUFA 在良惡性肺結(jié)節(jié)中濃度

建模組201 例患者中惡性162 例，良性39 例。分析建模組中良惡性肺結(jié)節(jié)患者血清中ω-3 PUFA 的濃度，惡性組[（17.10±13.24）ng/ml]低于良性組[（24.85±14.84）ng/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.204，P＜0.05）。

2.2 建模組肺結(jié)節(jié)良惡性單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，兩組性別、年齡、吸煙史、腫瘤病史、CEA、SCC、CYFRA21-1、病灶直徑、支氣管充氣征、邊界不光滑、分葉征比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。建模組肺結(jié)節(jié)良性和惡性患者ω-3 PUFA、病灶直徑、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牽拉比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 建模組肺結(jié)節(jié)良惡性單因素分析

2.3 建模組肺結(jié)節(jié)良惡性多因素分析

通過上述單因素分析，將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的ω-3 PUFA、病灶直徑、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牽拉6 項(xiàng)數(shù)據(jù)納入多因素分析。結(jié)果顯示，ω-3 PUFA、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牽拉是判斷肺結(jié)節(jié)良惡性的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 建模組肺結(jié)節(jié)良惡性多因素分析

2.4 建立臨床預(yù)測(cè)模型及驗(yàn)證

根據(jù)多因素分析結(jié)果，建立肺結(jié)節(jié)良惡性預(yù)測(cè)模型：P=ex/（1+ex），X=-5.020+（0.042×ω-3 PUFA 陽(yáng)性）+（1.613×CTR）+（1.185×短毛刺）+（1.081×胸膜牽拉）+（0.936×血管征）。其中P 為惡性結(jié)節(jié)預(yù)測(cè)值概率，e 為自然對(duì)數(shù)，X根據(jù)ω-3 PUFA、CTR、有無(wú)短毛刺、有無(wú)胸膜牽拉、有無(wú)血管征不同而變化。ω-3 PUFA為具體實(shí)測(cè)值（ng/ml）；CTR≥0.5=1，CTR＜0.5=0；有短毛刺=1，無(wú)短毛刺=0；有胸膜牽拉=1，無(wú)胸膜牽拉=0；有血管征=1，無(wú)血管征=0。將建模組數(shù)據(jù)帶入預(yù)測(cè)模型中計(jì)算出肺惡性概率并繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，診斷模型的AUC（95%CI）為0.837（0.770～0.904），靈敏度、特異度分別為74.5%、84.6%。見圖1～2、表3。將驗(yàn)證組數(shù)據(jù)代入預(yù)測(cè)模型并繪制ROC 曲線，AUC（95%CI）為0.780（0.651～0.908）。見圖3。

圖1 基于預(yù)測(cè)模型繪制ROC 曲線

圖2 基于ω-3 PUFA 繪制ROC 曲線

圖3 基于驗(yàn)證組數(shù)據(jù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型ROC 曲線

表3 ROC 曲線分析結(jié)果

3 討論

肺癌是全世界致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌總?cè)巳? 年生存率只有約19%[10]，而ⅠA 期肺癌患者術(shù)后5 年生存率已超過70%，其中原位腺癌和微浸潤(rùn)腺癌術(shù)后5 年生存率更是接近100%[7]。隨著LDCT 的普及，越來(lái)越多影像學(xué)表現(xiàn)為孤立性不確定肺結(jié)節(jié)被發(fā)現(xiàn)[11]，且多發(fā)性肺結(jié)節(jié)患者達(dá)到14.5%[12]，提高了早期肺癌診斷率并降低了肺癌患者死亡率[3,13]。然而，不管是LDCT 還是前期對(duì)肺結(jié)節(jié)進(jìn)行良惡性預(yù)測(cè)的Mayo模型[14]、VA 模型[15]、Brock 模型[16]和PKUPH 模型[17]都因自身局限性使用受到限制。因此，引入新的生物標(biāo)志物制訂新的預(yù)測(cè)模型具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，惡性肺結(jié)節(jié)患者血清中ω-3 PUFA 濃度低于良性肺結(jié)節(jié)組。因此，本研究在傳統(tǒng)的患者病歷資料、腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)特征等基礎(chǔ)上，增加了ω-3 PUFA 這一有意義的新的生物標(biāo)志物納入研究，是一項(xiàng)更為全面的綜合性診斷模型。本研究多因素分析發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA 降低、CTR≥0.5、具有短毛刺、血管征、胸膜牽拉等影像學(xué)特征是惡性肺結(jié)節(jié)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中，ω-3PUFA 是重要的一種免疫營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，高攝入ω-3 PUFA 可使人群肝癌、乳腺癌和前列腺癌發(fā)病率降低[5]，可見ω-3 PUFA 為肝癌、乳腺癌和前列腺癌患者的保護(hù)性因素。在肺癌中亦是如此，Song 等[6]meta 分析結(jié)果表明富含ω-3 PUFA 的魚類進(jìn)食量與肺癌發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)也有研究表明，補(bǔ)充ω-3 PUFA 能改善肺癌患者預(yù)后，延長(zhǎng)患者生存期[18]。這有可能與以下原因有關(guān)：①ω-3 PUFA 可以通過PI3K/Akt 等信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移[19]；②補(bǔ)充ω-3 PUFA 可以改善肺癌患者的免疫營(yíng)養(yǎng)狀況并抑制全身性的炎癥反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[20]；③ω-3 PUFA的過氧化可加速腫瘤細(xì)胞的鐵死亡[21]。本研究在CT影像學(xué)特征上得到與前期研究相同的結(jié)果，肺結(jié)節(jié)向周圍肺實(shí)質(zhì)伸展浸潤(rùn)形成的短毛刺[22]、動(dòng)脈和靜脈等血管向病灶集中或受牽拉形成的血管征[23-24]及CTR增高是肺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，預(yù)示著肺癌的可能且惡性程度更高。亦有研究表明[25]，肺結(jié)節(jié)性質(zhì)與結(jié)節(jié)直徑密切相關(guān)。而本研究中單因素分析結(jié)果顯示病灶直徑對(duì)于結(jié)節(jié)良惡性判斷具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而多因素分析結(jié)果未納入病灶直徑這一因素進(jìn)入預(yù)測(cè)模型公式。這可能是因?yàn)榱紣盒圆粌H與結(jié)節(jié)直徑有關(guān)，實(shí)性成分占比亦具有重要價(jià)值[26]。本研究診斷模型的AUC 為0.837，靈敏度、特異度分別為74.5%和84.6%，同時(shí)使用驗(yàn)證組數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證均具有較高診斷價(jià)值。相較于單獨(dú)使用ω-3 PUFA、CTR、血管征、毛刺征、胸膜牽拉診斷肺結(jié)節(jié)良惡性具有更高的特異度和靈敏度。所建立起的模型是一種相對(duì)無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)方便的肺結(jié)節(jié)預(yù)測(cè)模型，可為臨床不確定肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別提供參考。

本研究將ω-3 PUFA 這一血清生物標(biāo)志物與CT特征結(jié)合起來(lái)建立預(yù)測(cè)模型來(lái)判斷肺結(jié)節(jié)的良惡性，但仍存在不足之處：①由于研究納入患者為高度懷疑惡性肺結(jié)節(jié)且收治入院行手術(shù)或穿刺活檢明確病理患者，所獲得的結(jié)論可能存在一定選擇偏差；②本研究納入294 例患者為研究對(duì)象，樣本例數(shù)相對(duì)不足，后期還需加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。