多菌種聯(lián)合發(fā)酵降低醬油二次沉淀的研究

鄭二帥，曹 猛，梁蘭蘭，廖熙娜，李 孌

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528400）

醬油起源于中國，距今已有超過2 500年的歷史，在我國日常生活和食品工業(yè)中均扮演著極為重要的角色。隨著人們生活水平的提高，醬油以其滋味純鮮、醇厚的特性，已經(jīng)成為佐餐點(diǎn)蘸、烹飪贈香添色的最佳幫手，成為家庭廚房中必不可少的調(diào)味品之一。醬油在經(jīng)過加熱、沉淀、過濾后包裝銷售，在貨架期會有沉淀物析出，盡管不存在食品安全隱患，但會給消費(fèi)者帶來不好的感官體驗(yàn)，這種外觀質(zhì)量的顯著差異嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購買選擇[1]。為了減少貨架期沉淀的產(chǎn)生，目前通用的方法是在灌裝包裝前采用多級沉淀過濾甚至膜過濾的方式，盡可能過濾掉沉降物及大分子物質(zhì)，但過濾會帶來損耗增加、醬油增香大分子物質(zhì)減少等不利影響，降低醬油的風(fēng)味及口感[2]。

本文從醬油發(fā)酵根源進(jìn)行研究，旨在利用各種菌株的優(yōu)勢，從發(fā)酵結(jié)束后醬油體系的穩(wěn)定性入手解決二次沉淀問題。米曲霉具有強(qiáng)大的產(chǎn)蛋白酶能力，黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的能力較強(qiáng)，通過在制曲階段控制溫度，充分發(fā)揮兩種菌株的能力，使曲料在兩種菌種作用下發(fā)酵產(chǎn)生豐富的酶系，以促進(jìn)大豆、小麥原料中的蛋白質(zhì)、纖維、淀粉充分分解為氨基酸態(tài)氮、單糖、單脂類物質(zhì)，減少多肽類物質(zhì)量，提升原料分解率[3]。后發(fā)酵階段添加乳酸菌、酵母菌，有利于降低醬醪體系的pH，同時抑制雜菌產(chǎn)酸和惡性酵母的生成[4]。本文通過大量試驗(yàn)，在制曲階段使用米曲霉和黑曲霉菌種聯(lián)合發(fā)酵制曲，在后發(fā)酵階段添加耐鹽酵母菌和乳酸菌，在有效降低醬油二次沉淀生成的同時，能明顯提升原料利用率[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

醬油發(fā)酵原料非轉(zhuǎn)基因大豆、精制小麥粉、食鹽從市場采購；醬油專用M01米曲霉、H02黑曲霉、M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供；葡萄糖、麥麩從市場采購。

1.2 儀器與設(shè)備

冰箱、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、耐鹽菌擴(kuò)培系統(tǒng)、種曲機(jī)、NK式旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋、拌料絞龍、發(fā)酵池、松曲機(jī)、自動出曲機(jī)、65 m3發(fā)酵罐、列管換熱器、熱沉罐和灌裝機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 小試驗(yàn)證米曲霉混合黑曲霉制曲添加比例

（1）利用超靜工作臺、生化培養(yǎng)箱設(shè)備，培養(yǎng)M01米曲霉、H02黑曲霉菌種，培養(yǎng)成熟后，放置在冰箱中，供小試使用。

（2）小試制大曲。試驗(yàn)參數(shù)：總用種比例為混合料（黃豆+面粉）的0.04%。黃豆（以干黃豆計(jì)）∶面粉按照1∶0.3的比例，M01米曲霉和H02黑曲霉菌種配比分別按照9.5∶0.5、9.0∶1.0、8.5：1.5、8.0∶2.0、7.5∶2.5和7.0∶3.0配比進(jìn)行試驗(yàn)，以中性酶活力、酸性酶活力和大曲消化率3項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果作為判斷依據(jù)，每個配比平行做5組，取結(jié)果平均值作為該組配比的結(jié)果。對照樣：以正常大生產(chǎn)M01菌種培養(yǎng)大曲為對照樣。

1.3.2 中試驗(yàn)證最佳配比制曲效果

根據(jù)1.3.1結(jié)果，取最優(yōu)組合作為大曲中大試的試驗(yàn)參數(shù)，開展中大試試驗(yàn)。試驗(yàn)參數(shù)：總用種比例為混合料（黃豆+面粉）的0.04%，黃豆（以干黃豆計(jì)）∶面粉按照1∶0.3比例；試驗(yàn)量：1.5 t酵池，共投5條池進(jìn)行驗(yàn)證；對照樣：以正常大生產(chǎn)M01菌種培養(yǎng)大曲為對照樣。

1.3.3 大試驗(yàn)證最佳配比制曲效果及醬油的貨架期沉淀

按照1.3.2驗(yàn)證的最佳配比，以生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)2批次大曲，投入2個60 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行后期發(fā)酵，驗(yàn)證大生產(chǎn)階段大曲的質(zhì)量指標(biāo)情況及發(fā)酵天然油滅菌、過濾后放置6個月內(nèi)出現(xiàn)的二次沉淀情況。試驗(yàn)參數(shù)：參照中試參數(shù)；對照樣：以正常大生產(chǎn)M01菌種培養(yǎng)大曲及發(fā)酵天然油為對照樣。

1.3.4 小試添加M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌的最佳量

在曬場后發(fā)酵階段，選取1.3.2步驟的試驗(yàn)大曲制作后發(fā)酵醬醪，醬醪鹽水濃度為19°Bé，料水比為1∶2.0。按照正交試驗(yàn)，分別在第14天添加M31耐鹽乳酸菌和第40天添加M21耐鹽高滲透酵母菌，發(fā)酵120 d后，分離出發(fā)酵醬油，檢測全氮、氨基酸態(tài)氮、濁度指標(biāo)，經(jīng)常規(guī)滅菌、過濾后灌裝，觀察貨架期6個月內(nèi)出現(xiàn)沉淀情況，并通過離心收集析出沉淀物的量進(jìn)行分析，確定最佳添加量。對照樣：以正常大生產(chǎn)M01菌種培養(yǎng)大曲發(fā)酵醬醪為對照樣。

1.3.5 中大試驗(yàn)證添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌的效果

在曬場后發(fā)酵階段，根據(jù)1.3.3小試結(jié)果，開展中大試試驗(yàn)，醬醪鹽水濃度為19.0°Bé，料水比為1∶2.0，發(fā)酵周期120 d。發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵醬油的全氮、氨基酸態(tài)氮、濁度指標(biāo)；經(jīng)滅菌、過濾后灌裝，觀察貨架期出現(xiàn)沉淀情況。對照樣：以正常大生產(chǎn)M01菌種培養(yǎng)大曲發(fā)酵醬醪為對照樣。

1.3.6 指標(biāo)測定方法

中性酶活力、酸性酶活力：SB/T 10317—1999；大曲消化率：Q/MWX 108456—2017；全氮、氨基酸態(tài)氮：GB/T 18186—2000；濁度：Q/MWX 108511—2019；沉淀量：每瓶（500 g）樣品，以3 500 r·min-1離心20 min，傾倒液體后，濾紙上倒置1 min后稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小試驗(yàn)證不同M01米曲霉混合H02黑曲霉配比制曲結(jié)果

由表1可知，M01米曲霉與H02黑曲霉配比在9.0∶1.0時，大曲的總酶活力和消化率均最高，其中總酶活力3 106 U，為對照樣的1.10倍；消化率為83.8%，為對照樣的1.04倍。H02比例進(jìn)一步增加后，大曲中性酶活力會逐漸降低，影響M01菌株性能，造成總酶活力降低。故M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0是最合適的，按照該配比進(jìn)行中大試試驗(yàn)。

表1 M01米曲霉混合H02黑曲霉不同添加比例制曲結(jié)果

2.2 中大試驗(yàn)證最佳配比制曲效果

由表2可知，5個試驗(yàn)組總酶活力平均結(jié)果為3 037 U，為對照樣的1.1倍，提升10%。消化率為83.7%，為對照樣的1.05倍，提升5%。試驗(yàn)結(jié)果與小試結(jié)果基本保持一致。

表2 M01米曲霉混合H02黑曲霉最優(yōu)組合制曲中大試結(jié)果

2.3 大試驗(yàn)證最佳配比制曲效果及醬油的貨架期沉淀

由表3可知，大試生產(chǎn)的大曲總酶活力3 053 U，為對照樣的112%，消化率為83.6%，為對照樣的1.05倍，結(jié)果與中試結(jié)果基本保持一致，大曲消化率水平相比于對照組有明顯的提升。

表3 大試生產(chǎn)大曲檢測結(jié)果數(shù)據(jù)

由表4可知，試驗(yàn)大曲生產(chǎn)的天然油全氮提升1.74%，氨基酸態(tài)氮提升3.96%，濁度降低36%，6個月貨架期沉淀降低42.9%。

表4 大試生產(chǎn)天然油結(jié)果及滅菌過濾后貨架期二次沉淀量結(jié)果數(shù)據(jù)

2.4 小試M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌最佳添加量結(jié)果

由表5可知，在不同添加量酵母菌和乳酸菌的組合試驗(yàn)中，在14 d添加2‰的M21乳酸菌和第40天添加2‰的M31酵母菌，所得樣品的二次沉淀析出量最少，樣品（500 g）放置6個月后，析出量為0.11 g，為對照樣（0.85 g）的12.9%。同比減少87.1%。該配比為最優(yōu)配比，按照該配比進(jìn)行中大試試驗(yàn)。

表5 不同添加量M31酵母菌和M21乳酸菌組合下的沉淀量

2.5 中大試驗(yàn)證添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌的效果

按照M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0制曲后，以醬醪鹽水濃度為19°Bé，料水比為1∶2.0投料，進(jìn)行曬場環(huán)節(jié)后發(fā)酵，其中分別在第14天加入2‰的M21乳酸菌，第40天加入2‰的M31酵母菌，發(fā)酵周期120 d后，以自淋方式放出天然油，檢測并經(jīng)滅菌、過濾后裝瓶。進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測和觀察，結(jié)果如表6所示。

表6 添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌生產(chǎn)大試結(jié)果

由表6可知，生產(chǎn)大試結(jié)果與對照樣相比，天然油全氮提升4.1%，氨基酸態(tài)氮提升5.9%，濁度降低60%，6個月貨架期沉淀降低86.9%。試驗(yàn)結(jié)果與小試基本一致。

3 結(jié)論

在制曲階段，以M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0的比例制曲，能顯著提升大曲酶活力和大曲消化率，制備的大曲在曬地發(fā)酵階段，分別在第14天和第40天添加2‰的M21乳酸菌和M31酵母菌，能顯著改善醬醪的發(fā)酵環(huán)境，促進(jìn)大分子結(jié)構(gòu)多糖向單糖和單酯轉(zhuǎn)化，確保天然油體系的穩(wěn)定性[6]。綜合影響，貨架期沉淀降低86.9%，同時蛋白原料向氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率提升5.9%，效益明顯。在降低醬油貨架期二次沉淀的同時，提升了原料的轉(zhuǎn)化效率。

米曲霉與黑曲霉聯(lián)合發(fā)酵，能充分利用米曲霉蛋白酶能力和黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的能力，相互促進(jìn)，增強(qiáng)了酶系的寬度和廣度。將原料中蛋白質(zhì)和淀粉、糖類物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，在發(fā)酵階段前期添加乳酸菌物質(zhì)，能迅速降低醬醪的pH，抑制雜菌的生長和對原料的消耗[7]。發(fā)酵第40天時添加酵母菌，能促進(jìn)體態(tài)的后熟，促進(jìn)大分子結(jié)構(gòu)多糖向單糖和單酯轉(zhuǎn)化，使體系向著小分子化方向轉(zhuǎn)化[8]。本研究成果的應(yīng)用能顯著提升醬油的貨架期質(zhì)量，提升原料利用率，在節(jié)能降耗環(huán)保方面，有著明顯的優(yōu)勢。