食品添加劑L-香芹酮的吸入遺傳毒性評(píng)價(jià)

嚴(yán)大為，李 睿，陸誠瑋，高嶧涵*

（1.上海新型煙草制品研究院有限公司，基礎(chǔ)研究室，上海 201315；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，藥理毒理所，上海 201203）

L-香芹酮是留蘭香油的主要成分，含量占比在50%～60%，具有很濃郁的留蘭香香氣，其在食品香精、牙膏、硬糖、口香糖和各種飲料中有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。近年來，隨著霧化平臺(tái)的興起，L-香芹酮等香精香料的使用方式可改變?yōu)殪F化吸入的方式攝取。L-香芹酮雖是食品級(jí)添加劑，一定劑量內(nèi)經(jīng)口攝入較為安全，但其吸入途徑的安全性卻鮮有報(bào)道，尤其是關(guān)于L-香芹酮吸入途徑的遺傳毒性。

有報(bào)道稱消費(fèi)者在電子煙煙液中違規(guī)添加四氫大麻酚等物質(zhì)，引起多起健康事件，添加劑的吸入安全性已引起廣泛關(guān)注[3]。同時(shí)，有研究表明不同的電子煙煙液氣溶膠的細(xì)胞毒性具有較大差異，且與電子煙煙液中的添加劑密切相關(guān)[4-7]。雖然THORNE等[8]開展了電子煙煙液氣溶膠的Ames試驗(yàn)，結(jié)果顯示受試菌株未發(fā)生基因回復(fù)突變。MANOJ等[9]也未觀察到在與卷煙等同的特定劑量下電子煙煙液氣溶膠會(huì)引起細(xì)胞毒性和遺傳毒性的情況。同時(shí)，AZZOPARDI等[10]也證明電子煙煙液氣溶膠的細(xì)胞毒性相對(duì)傳統(tǒng)卷煙氣溶膠的細(xì)胞毒性較小，但對(duì)單一添加劑的吸入途徑的遺傳組合毒性評(píng)價(jià)還未見報(bào)道，尤其是添加后對(duì)煙液氣溶膠整體的遺傳毒性影響。因此，本文擬采用氣-液（瓊脂）界面暴露的方式，選取TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株和中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL細(xì)胞）等受試體系，根據(jù)Ames試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)等遺傳毒性檢測方法，本著風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，選取美國香精和提取物制造商協(xié)會(huì)公認(rèn)在烘焙食品中安全無毒使用L-香芹酮濃度的3倍（300 mg·L-1）[11]，對(duì)含有L-香芹酮霧化劑參比煙液氣溶膠的遺傳毒性進(jìn)行初步評(píng)估，并與霧化劑參比煙液氣溶膠進(jìn)行比較，為L-香芹酮添加劑的合理安全使用提供參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，來源于美國Moltox公司；中國倉鼠肺細(xì)胞，來源于中國科學(xué)研究院細(xì)胞庫；A549人肺腺癌細(xì)胞，來源于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院。

瓊脂粉（212304A級(jí)），美國BD公司；氯化鈉（≥99.5%），海凌峰化學(xué)試劑有限公司；組氨酸（99%），北京百靈威科技有限公司；生物素（99%），北京百靈威科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（CM1168B），英國OXOID公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Lot2200921），美國Gibco公司；胎牛血清（Dbc0520），美國Hyclone公司；磷酸緩沖液（Lot2028925），美國Gibco公司；0.25%（w/v）胰酶-EDTA（0.25%），美國Gibco公司；絲裂霉素（99.7%），中國食品藥品檢定研究院；冰醋酸（≥99.5%），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；甲醇（≥99.5%），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿（100 mm×20 mm），美國Corning公司；Tran swell培養(yǎng)板（12/24 mm），美國Costar公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Lot2120818），美國Gibco公司；無水乙醇（≥99.7%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMSO（99.9%），美國Sigma公司；霧化劑參比煙液；上海新型煙草制品研究院有限公司配制；含300 mg·L-1L-香芹酮的霧化劑參比煙液；上海新型煙草制品研究院有限公司配制。

X200AF吸煙機(jī)，上海帕夫曼自動(dòng)化儀器有限公司；Mini Tank煙具，香港Mask King公司；LA2-6AX生物安全柜，新加坡ESCO公司；ECLIPSE TS100倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；BD240恒溫培養(yǎng)箱，德國Binder公司；G-560E漩渦混合器，美國Scientific Industries公司；CKX41顯微鏡，日本Olympus公司；HERA CELL VIOS 160i CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；移液器（5 mL、1 mL和200 μL），德國Eppendorf公司；5810R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Vi-cell XR細(xì)胞活力分析儀，美國Beckman Coulter公司；U570超低溫冰箱，加拿大New Brunswick公司；3K30離心機(jī)，美國Sigma公司；氣-液界面暴露皿，英國BAT公司自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL，加入無菌試管中，將冷凍保存的TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃下振蕩（100次/min）培養(yǎng)10 h。

CHL細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%（V/V）胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%濃度的CO2加濕培養(yǎng)。

1.2.2 氣溶膠產(chǎn)生方式和暴露方式

將參比煙液（或含300 mg·L-1L-香芹酮的參比煙液）裝入Mask King電子煙煙具，煙具充電激活后，接入吸煙機(jī)。按照一定的抽吸模式（抽吸間隔30 s，抽吸流量55 mL，抽吸時(shí)間3 s，電子煙功率11.3 W）進(jìn)行抽吸，在吸煙機(jī)和電子煙煙具間采用軟管接入氣-液界面暴露皿（圖1），待細(xì)胞接種至Trans well培養(yǎng)板（或細(xì)菌接種至瓊脂培養(yǎng)皿，然后將培養(yǎng)皿直接放入暴露小室）后，即可產(chǎn)生氣-液（瓊脂）界面暴露染毒，染毒時(shí)間為30 min（60口抽吸耗時(shí)，煙具單次充電最大抽吸口數(shù)），暴露的氣溶膠濃度為電子煙煙液的全煙氣[12]。

圖1 氣-液（瓊脂）界面暴露皿實(shí)物以及結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.3 遺傳毒性檢測方法

（1）Ames試驗(yàn)方法。Ames試驗(yàn)中，將含0.5 mmol·L-1組氨酸和0.5 mmol·L-1生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基按照0.4 mL/管分裝于60個(gè)試管中（共分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、參比煙液組和含L-香芹酮參比煙液組，每組測試5個(gè)菌株，每個(gè)菌株3個(gè)平行），45 ℃水浴中保溫，每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.2 mL，PBS或者S9混合液（需代謝活化時(shí)）1.0 mL，陽性對(duì)照組加入陽性物質(zhì)溶液（敵可松、疊氮鈉、甲磺酸甲酯或2-氨基芴），充分混勻，取80 μL迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻，置于培養(yǎng)箱，待平皿干燥后受試物組進(jìn)行全煙氣暴露。陰性對(duì)照組不作處理、陽性對(duì)照組給予各菌株的陽性對(duì)照品。暴露結(jié)束后置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。若陽性對(duì)照組的回復(fù)突變數(shù)是陰性對(duì)照組的3倍或3倍以上，則視為菌株陽性結(jié)果，如不符合，則視為陰性結(jié)果。

（2）染色體畸變試驗(yàn)方法。染色體畸變試驗(yàn)中，將CHL細(xì)胞接種在24 mm的trans well小室的頂側(cè)，接種密度為2×105cells/孔，1.5 mL/孔，底側(cè)加入1.3 mL含有10%（V/V）胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h。陰性對(duì)照組不作處理；陽性對(duì)照組給予絲裂霉素（終濃度為0.2 μg·mL-1）；處理組進(jìn)行全煙氣暴露。在細(xì)胞收獲前4 h，每皿加入15 μL濃度為20 μg·mL-1的秋水仙素，使秋水仙素的終濃度為0.2 μg·mL-1。秋水仙素處理4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入0.5 mL 0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞。待消化結(jié)束后，加入一定量的完全培養(yǎng)液終止消化，終體積為10 mL。取約0.5 mL細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。取剩下的細(xì)胞懸液離心后經(jīng)0.075 mol·L-1氯化鉀低滲、固定、滴片，干燥后Giemsa染色，干燥后封片待閱。記錄染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞數(shù)和畸變類型，畸變類型包括斷裂、缺失、交換、環(huán)狀、三輻體、四輻體和粉碎等。裂隙和染色體數(shù)目畸變（多倍體和內(nèi)復(fù)制）單獨(dú)記錄，不計(jì)入畸變率中。若細(xì)胞的染色體畸變率與陰性對(duì)照組存在顯著性差異，則視為陽性結(jié)果，若不符合，則視為陰性結(jié)果。

（3）體外微核試驗(yàn)方法。體外微核試驗(yàn)中，將CHL細(xì)胞接種在12 mm的trans well小室的頂側(cè)，接種密度為1.5×105cells/孔，0.5 mL/孔，底側(cè)加入1 mL培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h。陰性對(duì)照組不作處理；陽性對(duì)照組給予絲裂霉素（終濃度為0.1 μg·mL-1）；處理組進(jìn)行全煙氣暴露，暴露結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后棄去培養(yǎng)液，加0.2 mL的0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞。待消化結(jié)束后，加入一定量的完全培養(yǎng)液終止消化，終體積為10 mL。取約0.5 mL細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。取剩下的細(xì)胞懸液離心后經(jīng)0.075 mol·L-1的氯化鉀低滲、甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定、滴片，干燥后Giemsa染色，干燥后封片，后在光學(xué)顯微鏡（100×10倍）下觀察并計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)其中單核、雙核、三核、四核細(xì)胞的數(shù)量，每個(gè)劑量組計(jì)數(shù)1 000個(gè)雙核細(xì)胞中出現(xiàn)微核的數(shù)量，并計(jì)算微核率。若細(xì)胞的微核率與陰性對(duì)照組存在顯著性差異，則視為陽性結(jié)果，若不符合，則視為陰性結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Ames試驗(yàn)中，培養(yǎng)結(jié)束后，顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中菌斑的生長情況，同時(shí)計(jì)數(shù)每皿的菌落數(shù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。染色體畸變試驗(yàn)中，畸變率=出現(xiàn)結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w細(xì)胞/觀察細(xì)胞數(shù)×100%，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體外微核試驗(yàn)中，微核率=（含有微核的雙核細(xì)胞數(shù)）/至少1 000個(gè)雙核細(xì)胞總數(shù)×1 000，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，與陰性對(duì)照組相比，在有無代謝活化系統(tǒng)的情況下，陽性對(duì)照組所有菌株的菌落數(shù)均至少是陰性對(duì)照組的培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)的3倍，試驗(yàn)系統(tǒng)有效，可檢測出有致突變物質(zhì)。暴露參比煙液氣溶膠和含L-香芹酮的參比煙液氣溶膠后，在有無代謝活化系統(tǒng)的情況下，菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535背景菌斑均正常，培養(yǎng)皿中TA97a、TA98、TA100和TA102菌株的菌落數(shù)均未達(dá)到各自空白對(duì)照組培養(yǎng)皿中菌落數(shù)的3倍或者3倍以上，只有菌株TA1535菌落數(shù)超過空白對(duì)照組菌落數(shù)的3倍以上，結(jié)果為可疑陽性。與參比煙液組相比，在不含活化系統(tǒng)S9情況下，含L-香芹酮的參比煙液組的5種菌株的細(xì)菌突變菌落數(shù)降低幅度為0%～39.6%，而含活化系統(tǒng)S9的情況下，TA97a和TA102菌株的菌落數(shù)增加56.0%和2.4%，TA98、TA100和TA1535菌株的菌落數(shù)分別降低50%、27.9%和50%，L-香芹酮的添加改變了參比煙液的細(xì)菌突變菌落數(shù)，但增加或降低的變化幅度均在60%以下。

表1 不同組別的電子煙煙液氣溶膠對(duì)5種菌種回復(fù)突變的影響

2.2 染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組（絲裂霉素處理）的染色體畸變細(xì)胞率明顯升高，畸變率具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），證明本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有效。但與陰性對(duì)照組比較，參比煙液氣溶膠組和含L-香芹酮參比煙液氣溶膠組染色體畸變率分別為2.3%和1.7%，無顯著性差異。同時(shí)與參比煙液氣溶膠組相比，加入L-香芹酮后霧化劑參比煙液氣溶膠的染色體畸變率降低0.6%。

表2 不同組別的電子煙煙液氣溶膠對(duì)細(xì)胞染色體畸變的影響

2.3 體外微核試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組（絲裂霉素處理）的總微核率明顯升高，具有極顯著差異（P＜0.01），證明本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有效。與陰性對(duì)照組比較，參比煙液氣溶膠組和含L-香芹酮的參比煙液氣溶膠組微核率分別為10.55‰和9.00‰，差異不明顯。與參比煙液氣溶膠組相比，加入L-香芹酮后霧化劑參比煙液氣溶膠微核率降低1.55‰。

表3 不同組別的電子煙煙液氣溶對(duì)細(xì)胞微核形成率的影響

3 討論

細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)作為致突變物的早期篩選和前期研究階段手段，主要利用營養(yǎng)缺陷型菌株，在選擇培養(yǎng)基上經(jīng)外源性物質(zhì)處理后，觀察菌株的回復(fù)突變情況，用來判斷致突變能力，是科研機(jī)構(gòu)和政府公認(rèn)的測定新化學(xué)物質(zhì)和新藥潛在致突變性的檢測方法[13]。對(duì)于電子煙遺傳毒性的評(píng)價(jià)，將電子煙氣溶膠整體看作外源性混合物，可以通過細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)檢測電子煙氣溶膠引起的堿基水平上的致突變作用[14]。同時(shí)，由于電子煙的特殊使用方式，AZZOPARDI等[15]認(rèn)為氣-液界面暴露的方式進(jìn)行遺傳毒性檢測較為科學(xué)，可用于檢測吸入制品的安全性評(píng)價(jià)。霧化體中的單一添加劑的安全性，不僅要考慮物質(zhì)本身的遺傳毒性，還應(yīng)考慮單一添加劑與其他物質(zhì)的交互作用。

關(guān)于L-香芹酮的經(jīng)口毒性，PROGRAM等[16]在對(duì)B6C3F1小鼠每周給藥5 d，劑量為375 mg·kg-1或750 mg·kg-1，連續(xù)2年進(jìn)行重復(fù)灌胃染毒，未發(fā)現(xiàn)L-香芹酮對(duì)B6C3F1小鼠具有致癌活性。但吸入途徑的遺傳毒性還未見報(bào)道。因此，本次研究基于上述考慮，采用了氣-液（瓊脂）界面的暴露方式，測試添加L-香芹酮后對(duì)參比煙液氣溶膠整體遺傳毒性的影響。

電子煙氣溶膠的遺傳毒性已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，THORNE等[17]研究發(fā)現(xiàn)在長達(dá)112.5 min的未稀釋電子煙氣溶膠暴露后，菌株均未發(fā)現(xiàn)致突變現(xiàn)象，認(rèn)為電子煙氣溶膠致細(xì)菌回復(fù)突變能力較弱。這與本實(shí)驗(yàn)中參比煙液氣溶膠未引起TA97a、TA98、TA100和TA102等4種菌株回復(fù)突變的結(jié)果較為類似，但本試驗(yàn)中TA1535菌株在有、無代謝活化系統(tǒng)的情況下，霧化劑參比煙液氣溶膠和含L-香芹酮的參比煙液氣溶膠均發(fā)生了致突變效應(yīng)，這可能是由于參比煙液氣溶膠殺死了大部分TA1535細(xì)菌，使殘存的細(xì)菌得以利用培養(yǎng)基中微量的組氨酸和生物素生長成肉眼可見的菌落，但這并非是回復(fù)突變菌落，而是由煙液氣溶膠毒性導(dǎo)致的假陽性結(jié)果[18]。同時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，添加L-香芹酮后也未引起致突變菌落數(shù)目的明顯增加，說明L-香芹酮不具有增加參比煙液氣溶膠的潛在致突變能力。

在染色體畸變試驗(yàn)和微核試驗(yàn)中，與參比煙液組相比，未發(fā)現(xiàn)添加L-香芹酮后的煙液氣溶膠引起染色體畸變率和微核率的上升，不存在導(dǎo)致細(xì)胞染色體畸變和微核突變潛在能力。與陰性對(duì)照組相比，參比煙液氣溶膠引起的染色體畸變或微核形成率上升不明顯，這與MANOJ等[19]和GANAPATHY等[20]的研究結(jié)果較為一致。因此，添加L-香芹酮的參比煙液氣溶膠對(duì)染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂過程的影響較小，未見明顯的遺傳毒性效應(yīng)。根據(jù)遺傳組合試驗(yàn)判斷規(guī)則[21]，添加300 mg·L-1的L-香芹酮不會(huì)增加參比煙液氣溶膠的遺傳毒性。

霧化氣溶膠的遺傳毒性一直是關(guān)注的熱點(diǎn)，現(xiàn)在針對(duì)氣溶膠的遺傳毒性大多數(shù)采用氣-液界面暴露方式[22]，但關(guān)于霧化添加劑的遺傳毒性的評(píng)價(jià)還很欠缺。有文獻(xiàn)單獨(dú)考察了單一添加劑的遺傳毒性[16]，但霧化氣溶膠的成分較為復(fù)雜，檢測遺傳毒性時(shí)應(yīng)考慮添加劑之間的相互作用。本文采取參比煙液氣溶膠作為本底，考察了單一添加劑L-香芹酮添加后整體煙液的遺傳毒性，為霧化添加劑的遺傳毒性評(píng)價(jià)提供了一個(gè)新的思路。本試驗(yàn)還存在一些缺陷，如僅考慮了L-香芹酮的3倍使用劑量的遺傳毒性，暴露時(shí)間受霧化設(shè)備的限制也僅設(shè)置了30 min，可進(jìn)一步研究高劑量或者長時(shí)間暴露條件下的L-香芹酮的遺傳毒性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，采取氣-液（瓊脂）界面暴露，加入300 mg·L-1的L-香芹酮暴露30 min后，未改變霧化劑參比煙液氣溶膠的遺傳毒性?？梢奓-香芹酮在限定劑量下其吸入途徑的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)較小。