煙稈生物炭還田對植煙黃棕壤養(yǎng)分、細菌群落結構與功能的影響

戴華鑫 梁太波 李彩斌 羅貞寶 關羅浩 鐘帥 翟振 邊文杰 黃衛(wèi) 張艷玲

摘要：【目的】明確煙稈生物炭對植煙黃棕壤養(yǎng)分、細菌群落結構與功能的影響，為提高煙稈的資源化利用提供理論依據(jù)。【方法】基于大田試驗，比較不同用量煙稈生物炭（0、5、15、20和40 t/ha）施用4年后煙田土壤養(yǎng)分指標及細菌豐度變化；采用16S rDNA序列高通量測序技術和PICRUSt基因預測方法，分析耕層土壤細菌群落結構、多樣性及代謝功能變化?！窘Y果】隨著生物炭施用量的增加，土壤pH、有機質、總氮、有效磷、速效鉀含量及細菌豐度呈增加趨勢。主坐標分析（PCoA）和聚類分析結果表明，施用生物炭改變了細菌群落組成。生物炭用量在15 t/ha時，土壤細菌OTU豐富度及Alpha多樣性指數(shù)最高；在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）相對豐度較低，而芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）相對豐度較高；在屬水平上，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、黃色土源菌屬（Flavisolibacter）和Roseiflexus相對豐度較高。冗余分析（RDA）結果表明，生物炭用量與土壤擬桿菌門顯著正相關（P<0.05，下同），與酸桿菌門顯著負相關。PICRUSt功能預測表明，施用生物炭增加了與土壤碳代謝相關的細菌基因豐度。【結論】貴州植煙黃棕壤施用煙稈生物炭后，土壤養(yǎng)分、烤煙農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀指標均有提升，土壤細菌群落豐富度及多樣性顯著提高，土壤細菌碳代謝能力增強，對改善煙田土壤微生態(tài)具有積極作用。以15 t/ha煙稈生物炭作用效果較好，可在生產(chǎn)上推廣應用。

關鍵詞：生物炭；植煙黃棕壤；土壤養(yǎng)分；細菌群落；功能預測

中圖分類號：S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）02-0476-12

Abstract：【Objective】In order to explore the effects of tobacco-stalk biochar （BC） on soil nutrients the structure and functioning of bacterial communities in tobacco-planting yellow-brown fields，and provide theoretical basis for the utilization of tobacco stalk. 【Method】A field experiment with different biochar dosages（0，5，15，20，40 t/ha） was set up to compare the changes of soil nutrient indexes and bacterial abundance of tobacco field after four years application. The 16S rDNA high-throughput sequencing and PICRUSt gene prediction analysis were used to decipher soil community composition， diversity and metabolic function. 【Result】The results showed that soil pH，organic matter，total nitrogen，available phosphorus，available potassium and the abundance of soil bacteria significantly increased with the dosage of biochar application. The results of principal coordinate analysis （PCoA） and cluster analysis show that soil bacterial community composition was significantly altered by the biochar application. When the amount of tobacco-stalk biochar was 15 t/ha，bacteria OTU richness and Alpha diversity indexes were higher than other treatments. At the phylum level，the relative abundance of Proteobacteria and Actinobacteria was lower under 15 t/ha than other treatments，but those of Gemmatimona-detes，Chloroflexi，Planctomycetes and Nitrospirae were high. At the genus level，the relative abundance of Gemmatimonas，F(xiàn)lavisolibacter，Roseiflexus was higher under 15 t/ha than other treatments. Redundancy analysis（RDA） analysis showed that biochar application dosage was significantly positively correlated with the relative abundance of Bacteroidetes（P<0.05， the same below），while negatively correlated with Acidobacteria. PICRUSt functional prediction analysis suggested that biochar application increased the functional gene abundance related to soil carbon metabolism in bacterial community. 【Conclusion】After applying tobacco-stalk biochar to the yellow-brown tobacco-planting soil in Guizhou， soil nu-trients， agronomic and economic indicators of flue-cured tobacco are improved， and the richness and diversity of soil bacterial communities are significantly increased. The carbon metabolism ability of soil bacteria is enhanced， which has a positive effect on improving the soil microecology of tobacco fields. In sum， the effect of using 15 t/ha tobacco-stalk biochar isrelatively better and can be popularized in tobacco production.

Key words： biochar； tobacco-planting yellow-brown soil； soil nutrients； bacterial community； function prediction

Foundation items： Key Scientific and Technological Project of China National Tobacco Corporation （110201902004）；Science and Technology Project of China Tobacco Guangdong Industrial Co.， Ltd.（QJ/GY G03.009/02）；Youth Talent Support Project of Zhengzhou Tobacco Research Institute（112020CR0250）

0 引言

【研究意義】生物炭是農(nóng)業(yè)廢棄有機物等經(jīng)高溫低氧或限氧環(huán)境熱解后產(chǎn)生的一種富碳物質（Blanco-Canqui，2017）。生物炭具有豐度的微孔結構、較大的比表面積、較高的穩(wěn)定性和吸附能力，在改良土壤、固碳減排、修復環(huán)境等方面具有很大的應用前景（Oni et al.，2019）。煙草是我國主要的經(jīng)濟作物之一，我國煙區(qū)每年生產(chǎn)近450萬t煙草秸稈（李文豪，2019），主要處理方式是直接燃燒和秸稈還田。秸稈燃燒在造成環(huán)境污染的同時也浪費了生物質資源，直接還田則可能引起病蟲害爆發(fā)進而造成煙草產(chǎn)質量下滑。有研究報道，合理施用生物炭可提高土壤保水性能（Wang et al.，2020；曾鳳玲等，2022），增加土壤碳氮儲量和有效養(yǎng)分含量（黃雁飛等，2020；張珂珂等，2022），修復土壤重金屬污染（白珊等，2021），改良作物根系發(fā)育狀況（陳懿等，2017），有利于作物生長和品質提升（李青山等，2021；李松偉等，2021；王志丹等，2022）。貴州是我國第二大煙葉產(chǎn)區(qū)，黃棕壤是當?shù)乜緹煼N植的主要土壤類型之一。因此，研究煙稈生物炭還田對植煙黃棕壤養(yǎng)分、細菌群落結構與功能的影響，對改善當?shù)刂矡熗寥佬再|、煙稈的合理利用及生態(tài)保護均具有重要意義。【前人研究進展】土壤微生物是土壤碳氮循環(huán)的“推進器”和土壤養(yǎng)分有效性的“轉換器”，由于土壤微生物對環(huán)境變化的敏感性，其自身種群多樣性及優(yōu)勢菌屬的變化可在一定程度上指示土壤肥力和質量狀況的高低（Luo et al.，2016；桂意云等，2022）。王光飛等（2017）通過盆栽試驗研究秸稈生物炭（0～2%）對種植辣椒土壤性狀的影響，結果發(fā)現(xiàn)土壤pH、有機質、有效磷和速效鉀含量隨著生物炭用量的增加逐漸上升，土壤細菌及4種功能菌數(shù)量也逐步增加，微生物代謝能力、多樣性及均勻度均與生物炭用量呈倒U型曲線關系，其在1.33%用量時達最高值。況帥等（2021）在田間植煙紅壤中添加油菜秸稈生物炭（0～9 t/ha），發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分、細菌OTU數(shù)目、菌群豐度和多樣性等明顯增加，土壤中主要優(yōu)勢菌群變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）與酸桿菌門（Acidobacteria）與土壤有效磷和速效鉀含量呈顯著正相關。姚麗茹等（2022）在半干旱農(nóng)業(yè)地區(qū)通過長期田間定位試驗研究施用小麥秸稈生物炭（0～20 t/ha）后作物生長及土壤細菌群落的變化，結果顯示隨著生物炭施用量的增加，土壤pH、有機碳、全氮、小麥生物量和產(chǎn)量呈上升趨勢，變形菌門（Proteobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）相對豐度增加，土壤細菌群落變化主要受生物炭施用量和采樣時期的影響，以10～20 t/ha生物炭用量較合適。然而，Zhang等（2021）在東北黑土單次施用10～50 t/ha玉米秸稈生物炭3年后，發(fā)現(xiàn)土壤細菌香農(nóng)指數(shù)顯著降低。由此看出，生物炭對土壤細菌群落結構的影響并不一致，這可能與土壤類型、利用方式及生物炭種類、用量等因素有關。在烤煙生產(chǎn)中，葉協(xié)鋒等（2015）研究指出，適量添加生物炭可改善烤后煙葉單料煙評吸質量，以常規(guī)施肥配施600 kg/ha生物炭用量的處理效果最好，而過量的生物炭可能會對烤后煙葉品質造成負面影響；鄧建強等（2018）研究指出，適量生物炭可降低土壤可能致病菌屬的相對豐度，但高劑量施用將增大煙葉生產(chǎn)感病風險?！颈狙芯壳腥朦c】前人關于生物炭的研究多集中于施用當年單一階段的變化，而關于生物炭施用多年后土壤養(yǎng)分和細菌群落變化的研究相對較少，尤其是針對貴州植煙黃棕壤施用生物炭后土壤養(yǎng)分和細菌群落變化的研究尚無報道?！緮M解決的關鍵問題】通過大田試驗，重點研究煙稈生物炭施用4年后對植煙土壤養(yǎng)分、細菌群落結構及功能的影響，旨在闡明生物炭對貴州典型植煙黃棕壤微生態(tài)的調控效應，為提高烤煙秸稈的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

生物炭（煙稈）材料來自貴州金葉豐農(nóng)業(yè)科技有限公司。煙稈在380 ℃下裂解2 h制備成煙稈生物炭，其基本性質為：pH 9.18、碳48.3%、氫3.93%、氧31.4%、氮1.50%、全磷2.38%、全鉀2.44%、速效鉀161.9 mg/kg、比表面積1.47 m2/g、總孔隙體積0.0075 cm3/g、平均孔直徑20.31 nm。供試煙草品種為云煙87。土壤類型為黃棕壤，2018年3月下旬拔除前茬煙稈和雜草后采集基礎土樣，檢測土壤理化指標：pH 5.40、有機質21.0 g/kg、總氮0.96 g/kg、全磷1.00 g/kg、全鉀1.71%、堿解氮102.90 mg/kg、有效磷28.30 mg/kg、速效鉀196.40 mg/kg。

1. 2 試驗方法

試驗于2018—2021年在貴州威寧黑石鎮(zhèn)科技園（東經(jīng)103°59′55″、北緯26°45′14″）進行。2018年5月，將煙稈生物炭一次性施入大田，考慮生物炭實際成本及田間承載狀況，用量分別為0 t/ha（CK）、5 t/ha（T1）、15 t/ha（T2）、20 t/ha（T3）和40 t/ha（T4），之后不再施入生物炭；生物炭在起壟前均勻撒施在土壤中，隨后將其與耕層土壤迅速旋耕混勻。施肥用量參照當?shù)爻Ｒ?guī)優(yōu)質烤煙生產(chǎn)，每公頃施用酒糟有機肥1800.0 kg、復合肥（9-13-22）525.0 kg、提苗肥（15-8-7）37.5 kg和追肥（13-0-26）300.0 kg。隨機區(qū)組設計，3次重復，共15個小區(qū)，株距0.55 m，行距1.10 m，小區(qū)面積74.8 m2（長11.0 m、寬6.8 m），試驗地面積1122.0 m2。基肥在移栽前結合有機肥窩施，提苗肥于移栽時結合定根水施用（肥料融入水中澆灌）、移栽25 d后穴施追肥，其他各項田間生產(chǎn)管理措施統(tǒng)一按當?shù)丶夹g規(guī)范進行。

連續(xù)4年種植烤煙，2021年8月在圓頂期測量煙株農(nóng)藝性狀，9月大田煙葉采收結束后，在每小區(qū)選取8株煙株，采集每2株煙株中心點處的耕層（0～20 cm）土壤，均勻混合成1個樣品。每個樣品分成2份，1份放入冰盒運回實驗室，用于土壤細菌豐度及多樣性檢測；另1份裝于布袋中，帶回實驗室自然風干，過篩后用于土壤養(yǎng)分指標測定。采收煙葉統(tǒng)一裝于烤房中部，按當?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝烘烤和分級收購，統(tǒng)計煙葉經(jīng)濟性狀。

1. 3 測定指標及方法

1. 3. 1 土壤養(yǎng)分指標測定 參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》（魯如坤，2000）測定土壤養(yǎng)分指標。土壤pH采用水浸提電位法（水土比2.5∶1）測定；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；土壤總氮和堿解氮含量分別采用半微量凱氏定氮法和堿解擴散法測定；土壤有效磷及速效鉀含量分別采用用氟化銨—鹽酸浸提—鉬銻抗比色法及醋酸銨浸提—火焰光度法測定。

1. 3. 2 土壤細菌DNA提取與擴增 采用土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit，MOBIO，USA）對土壤樣本提取基因組DNA，提取后的DNA利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，檢驗合格后，將DNA樣本放入-20 ℃條件保存，后續(xù)用于qPCR檢測及二代高通量測序。qPCR檢測和二代高通量測序中均采用16S rRNA基因V4～V5區(qū)域通用引物，引物序列為515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和926R（5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3'），由微基生物科技（上海）有限公司完成測序及分析。

1. 3. 3 土壤細菌豐度的qPCR檢測 運用染料法熒光定量PCR檢測土壤樣本中細菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)的拷貝數(shù)。采用16S rRNA基因V4～V5區(qū)通用引物擴增基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Axygen，USA）回收PCR產(chǎn)物，隨后進行TA克隆，篩選陽性克隆進行測序，并采用質粒提取試劑盒（Axygen，USA）進行質粒提取。采用Qubit 3.0（Invitrogen，USA）測定質粒DNA濃度，根據(jù)質粒濃度和質粒DNA相對分子量計算標準質粒拷貝數(shù)。將構建好的標準質粒進行10倍梯度稀釋，作為模板，構建標準曲線。qPCR反應總體系20.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。每個反應3個平行，陰性對照采用ddH2O作為模板。PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行40次循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)采集在延伸時進行。實時定量PCR在ABI 7900HT型熒光定量PCR儀中進行。結果以每克樣本中16S V4～V5區(qū)基因拷貝數(shù)統(tǒng)計。

1. 3. 4 土壤細菌多樣性的二代高通量測序 采用二代高通量測序技術檢測土壤樣本中細菌多樣性。采用兩步PCR擴增方法構建文庫（戴華鑫等，2017），第一步采用含有部分測序引物和16S rRNA基因V4～V5通用引物的融合引物進行PCR擴增目的片段；以回收的PCR產(chǎn)物為模板，進行第二步擴增，添加Barcode和測序接頭序列，并用FTC-3000TM Real-Time PCR儀進行熒光定量，均一化混勻后完成文庫構建，文庫質控合格后，采用Illumina NovaSeq 6000進行測序。

1. 3. 5 PICRUSt2功能預測 基于OTU的代表序列和豐度信息，采用PICRUSt2進行功能和代謝途徑預測分析，通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫獲得不同代謝通路的豐度信息（Langille et al.，2013）。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

二代高通量原始測序結果經(jīng)Trimmomatic初步質控后，采用Flash進行序列拼接，采用UPARSE按照序列97%相似性進行OTU（Operational taxonomic unit）聚類，同時去掉singletons序列，每個OTU得到1條代表序列，采用mothur的classify.seqs命令與SILVA 128數(shù)據(jù)庫比對，進行物種信息注釋，閾值設置0.6。根據(jù)注釋結果，分別在門、屬分類水平上統(tǒng)計微生物相對豐度，并采用R語言ggplot2進行可視化（Gao et al.，2020）。利用R語言vegan包中的estimateR函數(shù)計算Chao和ACE豐富度指數(shù)，diversity函數(shù)計算Shannon多樣性指數(shù)，picante包的pd函數(shù)計算PD_whole_tree，rda函數(shù)進行冗余分析（RDA），采用ggplot2程序包對結果進行可視化。Beta多樣性分析，采用R語言ape程序包進行weighted.unifrac分析，dendextend包進行聚類樹分析，基于OTU數(shù)據(jù)，采用bray curtis算法進行主坐標分析（PCoA），聚類樹形圖和PCoA圖采用ggplot2進行可視化。采用vegan包中的adonis函數(shù)，對bray curtis結果進行adonis分析。ggpubr包進行Kruskal-Wallis秩和檢驗，對樣本間屬水平微生物豐度進行差異分析（Wang et al.，2019）。采用SPSS 24.0的單因素方差分析和Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2. 1 不同生物炭用量對土壤養(yǎng)分的影響

由表1可知，隨著生物炭用量增加，土壤pH、有機質、總氮、有效磷和速效鉀含量均呈增加趨勢，堿解氮含量無顯著變化（P>0.05，下同）。T4處理的土壤有機質、速效鉀含量分別為49.53 g/kg、691.00 mg/kg，顯著高于其他處理（P<0.05，下同）；土壤pH、總氮、有效磷含量高于CK和T1處理。由此可見，施用煙稈生物炭對土壤養(yǎng)分具有明顯的提升作用。

2. 2 不同生物炭用量對烤煙農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀的影響

由表2可知，施用生物炭后烤煙的莖圍、上部葉最大葉長、中部葉最大葉長顯著高于CK，株高、上部葉最大葉寬、中部葉最大葉寬、葉數(shù)等農(nóng)藝性狀與在各處理間均無顯著差異。從烤煙經(jīng)濟性狀來看，T1、T2處理的煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值顯著高于其他處理，不同處理間烤煙均價、上等煙和中等煙比例無顯著差異（表3）。

2. 3 不同生物炭用量對土壤細菌豐度的影響

由圖1可看出，土壤細菌豐度隨著生物炭用量的增加呈增加趨勢。與CK相比，增施5、15、20 t/ha生物炭后，T1、T2和T3處理的土壤細菌豐度增加不顯著；生物炭施用量增加至40 t/ha時，T4處理的土壤細菌豐度為1.82×108 CFU/g，顯著高于其他處理。

2. 4 不同生物炭用量對土壤細菌Alpha多樣性的影響

由表4可知，樣品序列覆蓋率均達0.99以上，說明文庫中包含細菌群落的絕大多數(shù)細菌類群，基本能反映群落結構組成。與其他處理相比，CK的土壤細菌OTUs和Alpha多樣性指數(shù)處于較低水平；隨著生物炭用量的增加，細菌OTUs和Alpha多樣性指數(shù)（Chao、ACE、Shannon、PD_whole_tree）均呈先升高后降低的變化趨勢，T2處理的土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)均為最高。

2. 5 不同生物炭用量對土壤細菌群落結構的影響

由圖2可看出，土壤優(yōu)勢細菌相對豐度高于1.00%的細菌門有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。疣微菌門（Verrucomicrobia）和裝甲菌門（Armatimo-nadetes）的相對豐度在0.50%～1.00%，其他細菌門的相對豐度均低于0.50%。與其他處理相比，生物炭用量為15 t/ha時（T2處理）土壤變形菌門、放線菌門相對豐度較低，分別為25.70%和22.58%；芽單胞菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、硝化螺旋菌門相對豐度較高，分別為12.35%、8.13%、3.34%、1.69%和0.63%。隨著生物炭用量的增加（CK～T4處理），酸桿菌門相對豐度呈明顯降低趨勢，分別為17.70%、14.39%、13.10%、12.54%和10.48%，擬桿菌門相對豐度呈明顯增加趨勢，分別為3.46%、5.14%、7.79%、8.39%和11.06%。

由圖3可看出，生物炭用量對不同細菌屬相對豐度的影響存在差異。隨著生物炭用量的增加，多數(shù)細菌群落屬水平相對豐度總體呈下降趨勢。與其他處理相比，T4處理的Gemmatirosa、Bryobacter、水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、Gaiella、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、念珠菌固體桿菌屬（Candidatus_Solibacter）、Reyranella、Jatrophihabitans、Dyella、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、放線異壁酸菌屬（Actinoallomurus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）等細菌豐度較低；T2處理的芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、黃色土源菌（Flavisolibacter）、Roseiflexus等細菌豐度相對較高；T3處理的放線菌屬（Actinophytocola）、Reyranella、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）等細菌豐度相對較高，即總體呈先升高后降低的拋物線趨勢；Acidibacter的相對豐度則呈先降低后升高的變化趨勢。

基于OTU層次的非加權組平均法聚類分析結果表明，包括CK在內(nèi)的不同樣品可分為三大類；CK與T1處理距離相對較近，T2處理與T3處理距離相對較近，T4處理距離其他處理相對較遠（圖4）。該結果與試驗處理設置相一致，同時表明，與CK相比，生物炭施用4年后仍然改變著煙田耕層土壤的細菌群落結構。

基于OTU水平和Bray-curtis距離的PCoA分析結果（圖5）表明，不同生物炭用量處理的土壤細菌群落組成出現(xiàn)明顯區(qū)分，前兩軸共解釋75.03%的群落變異，adonis結果也說明不同處理間存在極顯著差異（P<0.001）。CK樣品沿第1軸與T2、T3和T4處理的3組樣品明顯分開，T2、T3和T4處理樣品沿第2軸分開。

2. 6 土壤細菌與環(huán)境因子的相關性

細菌群落門水平與土壤環(huán)境因子的RDA分析結果（圖6）顯示，第1軸的解釋變異量為80.22%，第2軸的解釋變異量為14.68%，兩軸共解釋總變異的94.90%。在環(huán)境因子方面，生物炭與pH、有效磷、有機質、總氮、速效鉀呈銳角，呈正相關關系，與土壤堿解氮呈鈍角，呈負相關關系。細菌群落與土壤理化性質方面，擬桿菌門（Bacteroidetes）與土壤有機質、pH、生物炭、總氮、速效鉀呈正相關關系，與堿解氮呈負相關關系；酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）均與土壤總氮、速效鉀、有效磷、pH、生物炭呈負相關關系，與堿解氮呈正相關關系；綠彎菌門（Chloroflexi）與土壤堿解氮呈負相關關系；變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）受生物炭影響相對較小。因此，生物炭用量與土壤擬桿菌門呈正相關關系，與酸桿菌門呈負相關關系。

2. 7 土壤細菌群落PICRUSt功能預測分析

將預測得到的功能基因家族（圖7）與KEGG數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，對于第一等級，所有菌群的基因序列注釋到的預測功能可分為6類，其中前4類分別是：新陳代謝（Metabolism）、環(huán)境信息加工（Environmental Information Processing）、遺傳信息加工（Genetic Information Processing）和細胞過程（Cellular Processes）。對于第二等級，參與新陳代謝的菌群中，以參與碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、能量代謝（Energy meta-bolism）、輔助因子及維他命代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）的為最大類群；參與遺傳信息加工的菌群中，參與遺傳信息翻譯（Translation）、復制和修復機制（Replication and repair）的類群具有明顯優(yōu)勢；參與環(huán)境信息加工的菌群中，參與膜運轉類群（Membrane transport）具有明顯優(yōu)勢，其次是參與信號轉導（Signal transduction）的類群；參與細胞過程的菌群中，以參與原核生物細胞群落代謝（Cellular community-prokaryotes）的為最大類群。

2. 8 代謝相關基因分析

圖8為所測土壤樣品KEGG直系同源基因簇（KO）豐度熱圖，橫坐標為不同生物炭用量處理，縱坐標表示代謝相關基因編碼酶的豐度。分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝、碳水化合物代謝和能量代謝通路上的相關基因表達差異較明顯；可大致聚為CK和生物炭兩類，不同生物炭用量間也存在差異，其中T4與其他3個生物炭處理差異相對較大。以細菌群落多樣性指數(shù)較高的T2處理與CK相比，土壤代謝相關基因豐度升高的占比較大，包括與能源物質代謝密切相關的轉酮醇酶（K00615），與碳代謝相關的脫氫酶（K00058、K00382、K01754、K01687），與脂肪酸合成代謝相關的?；d體蛋白（K02078）、3-氧?；埘；d體蛋白］合酶（K00648、K09458）及?；D移酶（K00655），作用于組氨酸的氨基轉移酶（K00817）及支鏈氨基酸的氨基轉移酶（K00826），與色氨酸代謝相關酶（K00128），參與核酸錯配修復的酶（K03657），參與氨基酸合成相關酶（K01733）及ABC轉運蛋白相關酶（K02066、K02067）。

3 討論

通常認為，生物炭本身呈堿性，其高pH主要源于組分中的灰分包含大量K、Ca、Na等金屬礦物，可有效降低土壤交換性H+含量，因此對于增加酸性土壤pH具有明顯作用（Van Zwieten et al.，2010）。研究表明，施用生物炭后土壤總氮、有機質、有效磷和速效鉀含量顯著上升，且隨著生物炭用量的增加效果較明顯（張廣雨等，2020）；煙稈生物炭施用于田間后可提高烤煙根際土壤pH及有機碳含量（Jones et al.，2012）。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，隨著生物炭用量逐漸增加，土壤pH、有機質、總氮、有效磷、速效鉀含量呈增加趨勢，可能與生物炭和肥料的互補或協(xié)同作用有關。生物炭巨大的內(nèi)表面積、較高的孔隙結構、豐富的官能團能吸附多種離子，延緩土壤中肥料養(yǎng)分的釋放，提高土壤保肥性能和碳氮比（李彩斌等，2018），調節(jié)土壤肥力平衡，改變土壤微生物定殖棲息地環(huán)境（張璐等，2019）。此外，土壤pH是影響微生物生長代謝的主要因子之一；當pH從酸性向中性范圍變化時，土壤微生物量會隨著pH的升高而增加（Aciego et al.，2008）。本研究中，施入生物炭后土壤細菌豐度顯著增加，可能與生物炭的多孔結構、土壤pH增加及微生態(tài)環(huán)境的改善等多重因素疊加有關（Oni et al.，2019）。生物炭中部分易分解炭可作為微生物生長的基質，施用生物炭可刺激土壤微生物的繁殖和活力，并發(fā)生起爆效應（Chen et al.，2017）；適量生物炭可提高土壤細菌群落的豐度和多樣性，但超過一定用量后細菌OTUs數(shù)量則會下降，致病菌豐度增加（鄧建強等，2018），其原因可能與高用量生物炭對土壤性狀產(chǎn)生的負面影響有關（王光飛等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭處理的土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)相對較高，尤其以15 t/ha處理的土壤細菌群落較豐富。因此，對于貴州煙區(qū)黃棕壤土壤細菌群落組成來說，結合煙稈生物炭自身特性、土壤類型及試驗地條件等多種因素，施用該用量的煙稈生物炭較理想。

酸桿菌門是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一個較豐富、難以培養(yǎng)的細菌群落，在關鍵碳、氮和硫等生物地質化學循環(huán)中扮演重要生態(tài)角色（Kalam et al.，2020）。大多數(shù)酸桿菌更喜歡在酸性條件下生長，較低的pH條件下酸桿菌豐度通常較高（Lladó et al.，2018）。本研究中，由于生物炭施用提高了土壤pH，可能是酸桿菌豐度隨著生物用量增加而降低的原因之一。研究表明，在土壤微生物區(qū)系中，擬桿菌門能分泌多種碳水化合物活性酶，降解來源于動植物殘體的多聚糖及纖維素（Larsbrink and McKee，2020）。施用生物炭可顯著提高土壤放線菌門和擬桿菌門的多樣性和生物量，改善土壤微生物群落結構（Liu et al.，2020）。在生物炭改良土壤的根際相關群落中，擬桿菌門的相對豐度較高（Kolton et al.，2011）。Liao等（2019）利用13CO2標記，發(fā)現(xiàn)在豆科間作系統(tǒng)中，施用生物炭不僅改變了根際細菌群落結構和多樣性，還提高了擬桿菌成員（芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等）的相對豐度。本研究發(fā)現(xiàn)，生物炭用量與土壤擬桿菌門顯著正相關，在15或20 t/ha用量時，土壤放線菌屬、芽單胞菌屬、類芽孢桿菌屬相對豐度明顯增加。放線菌是產(chǎn)生抗生素的主要細菌之一，土壤中放線菌數(shù)量及其比例對土壤微生物生態(tài)平衡調整有重要作用（張璐等，2019）；芽孢桿菌屬、假單胞菌屬為植物根際促生菌，其主要功能是分泌植物生長調節(jié)劑而促進植物生長（戴華鑫等，2020）。因此，從細菌群落多樣性指數(shù)及細菌屬功能來看，生物炭施用量在15或20 t/ha時效果較好。

農(nóng)田土壤中存在大量具有特定生態(tài)功能的活躍微生物，這些微生物與新陳代謝活動緊密相關（LeBrun and Kang，2018）；短期生物炭添加后即可改變土壤細菌群落組成（Wong et al.，2019），其對土壤碳庫的固持能力可維持3年以上（Wang et al.，2021）。轉酮醇酶是磷酸戊糖途徑非氧化分支中的關鍵限速酶，對于能量轉導和產(chǎn)生用于核酸合成的核糖至關重要，在微生物碳代謝中扮演重要角色（Wilkinson and Dalby，2019）；?；d體蛋白是脂肪酸合成中的關鍵蛋白質，3-氧?；埘；d體蛋白］合酶是一種長鏈脂肪酸合成酶，烯酰CoA水合酶是脂肪酸合成和分解代謝的關鍵分子（Khurana et al.，2010）。本研究中，上述與脂肪酸合成、能源物質及碳代謝有關酶編碼基因豐度高于對照，說明生物炭施入土壤4年后土壤細菌碳源利用能力仍處于較高水平。支鏈氨基酸是一類具有多種生理和代謝作用的必需氨基酸（呂娜娜等，2018）。研究表明，氨基酸能促進土壤微生物活動，加快有機物礦化和土壤養(yǎng)分稀釋，增加土壤微生物數(shù)量（張貴云等，2019）；生物炭處理顯著提升了與能量生產(chǎn)和轉換、氨基酸轉運代謝、核苷酸及碳水化合物轉運代謝等相關功能的基因表達量（Gao et al.，2021）。ABC轉運基因的功能不僅局限于轉運，還包括通道調控和分子量變換等（Gong and Wang，2022），且與根系分泌物的釋放量有關（Cox et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，細菌豐度隨著生物炭施入量增加而增加，且生物炭處理后的土壤養(yǎng)分相對較高，土壤細菌類群功能代謝及相關酶基因豐度改變可能是其原因之一。

4 結論

貴州植煙黃棕壤施用煙稈生物炭后，土壤養(yǎng)分、烤煙農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀指標均有提升，土壤細菌群落豐富度及多樣性顯著提高，土壤細菌碳代謝能力增強，對改善煙田土壤微生態(tài)環(huán)境具有積極作用。其中以15 t/ha煙稈生物炭作用效果較好，可在生產(chǎn)上應用推廣。

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（責任編輯 王 暉）