黃芪石斛方對(duì)小鼠免疫功能的影響

扈覲璽 劉佳琪 邵紫萱 李麗 馮穎童 劉雙巧 賈嵐 王景霞

當(dāng)代社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈,工作生活壓力增大,精神緊張,作息不規(guī)律等諸多因素,導(dǎo)致部分人群處于免疫力低下的亞健康狀態(tài)[1],而增強(qiáng)免疫力類保健食品是一種安全增強(qiáng)免疫力,改善亞健康狀態(tài)的有效措施。黃芪石斛方是在中醫(yī)辨證保健理論[2]指導(dǎo)下,基于未病先防的思想,針對(duì)免疫功能低下人群屬脾腎虧虛者而設(shè),選擇具有健脾補(bǔ)腎,益氣養(yǎng)陰功效的黃芪、女貞子、西洋參、鐵皮石斛配伍而成。本研究按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[3]評(píng)價(jià)黃芪石斛方增強(qiáng)免疫力的保健功能,探討“健脾補(bǔ)腎,益氣養(yǎng)陰法”與增強(qiáng)免疫力的關(guān)系,為黃芪石斛方精準(zhǔn)應(yīng)用于免疫力低下人群,降低患病風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只SPF級(jí)雄性昆明小鼠,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的屏障環(huán)境中,室溫為(24±2)℃,空氣相對(duì)濕度為(60±10)%,光照12小時(shí)/天,自由飲水。動(dòng)物倫理審批號(hào):BUCM-4-2019110201-4032。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

黃芪(批號(hào):200602CP273)購(gòu)自河北萬(wàn)修藥業(yè)有限公司;女貞子(批號(hào):201201)、西洋參(批號(hào):201101)購(gòu)自珠海市健興藥業(yè)有限公司;鐵皮石斛(批號(hào):20201201)購(gòu)自云南天泉生物科技股份有限公司。制備:由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備,按3∶3∶2∶3比例稱取黃芪、女貞子、西洋參、鐵皮石斛,經(jīng)水提、濃縮、干燥、粉碎等工藝制得干膏粉,作為受試物。

1.3 主要試劑

刀豆蛋白A(Sigma,批號(hào):L6397)、MTT(阿拉丁,批號(hào):D274386)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(阿拉丁,批號(hào):D103272)、乳酸脫氫酶(Sigma,批號(hào):L1254)、PMS(Sigma,批號(hào):P9625)、氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽(Sigma,批號(hào):P9625)、Tris(阿拉丁,批號(hào):T105289)、NH4Cl(阿拉丁,批號(hào):A116370)、血清溶血素水平(serum hemolysin level,HC50)試劑盒(華英生物,批號(hào):20220725)、免疫球蛋白A(華英生物,批號(hào):20220915)、免疫球蛋白G(華英生物,批號(hào):20220915)、免疫球蛋白M(華英生物,批號(hào):20220915)、補(bǔ)體C3(華英生物,批號(hào):20220915)、補(bǔ)體C4(華英生物,批號(hào):20220915)、腫瘤壞死因子α(華英生物,批號(hào):20220910)、γ干擾素(華英生物,批號(hào):20220910)、白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)(華英生物,批號(hào):20220910)、綿羊紅細(xì)胞(華英生物,批號(hào):20220915)、正常豚鼠血清(華英生物,批號(hào):20220915)、都氏試劑(海標(biāo)科技,批號(hào):20220805H)。

1.4 主要儀器

電子天平(FA1004,上海力辰邦西儀器科技有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(QP50,山東博科)、酶標(biāo)分析儀(DR-200BS,華衛(wèi)德朗)、數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精密度0.02 mm,ASOne)、微量注射器(50 μL,sigma-aldrich)、移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL ,Eppendorf)、HT7700型透射電子顯微鏡(TEM,日本日立公司)、neofuge 15R型冷凍離心機(jī)(heal force公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

80只小鼠隨機(jī)均分為A、B兩批,設(shè)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測(cè)定實(shí)驗(yàn)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)活性測(cè)定、血清免疫球蛋白含量和補(bǔ)體含量測(cè)定7個(gè)試驗(yàn),A批進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測(cè)定實(shí)驗(yàn),B批進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性測(cè)定以及血清免疫球蛋白含量和補(bǔ)體含量測(cè)定。兩批小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后,每批根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4組即空白對(duì)照組、黃芪石斛方低(1.833 g/kg)、中(3.667 g/kg)、高劑量(5.5 g/kg)組(以生藥量計(jì),每日灌胃劑量為人體用量10、20、30倍),每組10只?？瞻讓?duì)照組小鼠灌胃等體積的蒸餾水,各劑量組小鼠灌胃相應(yīng)的黃芪石斛方溶液,灌胃量為0.1 mL/10g 體質(zhì)量,連續(xù)給藥30天。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 胸腺指數(shù)與脾指數(shù) 稱取小鼠體質(zhì)量、脾臟重量、胸腺重量,計(jì)算脾指數(shù)與胸腺指數(shù)。脾指數(shù)=脾臟重量/體質(zhì)量;胸腺指數(shù)=胸腺重量/體質(zhì)量。

1.6.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell,SRBC)進(jìn)行免疫。免疫4天后,使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量左后足跖厚度并在測(cè)量部位注射20%(v/v)SRBC,于24小時(shí)后測(cè)量左后足跖部厚度,兩次測(cè)量均為同一部位測(cè)量三次,取平均值。結(jié)果以攻擊前后足跖厚度或腫脹度的差值表示。

1.6.3 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(Jerne改良玻片法) 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC進(jìn)行免疫。5天后將小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟磨碎制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL,與加入Hanks液的表層培養(yǎng)基(1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL)混合均勻傾倒于刷瓊脂糖薄層的玻片上放入二氧化碳箱中孵育1～1.5小時(shí),然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入到玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1～1.5小時(shí)后,計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.6.4 血清溶血素測(cè)定 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC進(jìn)行免疫,5天后取血分離血清,設(shè)樣品孔和空白對(duì)照孔,樣品孔:取血清用SA緩沖液稀釋后依次加入SRBC,補(bǔ)體(用SA溶液按1∶8稀釋)?？瞻讓?duì)照孔:除不加入血清外同樣品孔。置37°C恒溫培養(yǎng)箱中保溫30分鐘后,冰浴終止反應(yīng)。水平離心10分鐘后分別取樣品孔和空白孔上清液加入另一個(gè)96孔板內(nèi)加入都氏試劑。同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔[加入10%(v/v)SRBC再加入都氏試劑]。用震蕩器充分混勻,放置10分鐘后,于540 nm處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值。溶血素的量以HC50表示,按下列公式計(jì)算。

1.6.5 ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法) 小鼠于給藥第30天頸椎脫臼處死。無(wú)菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液。將每一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,一孔加ConA液另一孔作為對(duì)照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí),每孔吸去上清液,加入不含小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液,同時(shí)每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解。隨后分裝至96孔板中,每孔作3個(gè)平行孔,于540 nm處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.6.6 NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 小鼠于給藥第30天頸椎脫臼處死。無(wú)菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞加入U(xiǎn)型96孔板中,靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液,靶細(xì)胞最大釋放孔加2.5%Triton,上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)平行孔于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí),然后將96孔培養(yǎng)板離心并每孔吸取上清液置平底96孔培養(yǎng)板中,同時(shí)加入LDH基質(zhì)液反應(yīng)5分鐘,每孔加入1 mol/L的鹽酸溶液30 μL,在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度值。并按照下式計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.6.7 血清生化指標(biāo)測(cè)定 小鼠于給藥結(jié)束后,眼眶取血,室溫放置1小時(shí),4°C 3000 r/min離心15分鐘分離血清備用。采用比色法檢測(cè)血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量,免疫比濁法檢測(cè)血清中補(bǔ)體C3、C4含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪石斛方對(duì)動(dòng)物臟器/體質(zhì)量比值的影響

與空白對(duì)照組比較,黃芪石斛方各劑量組小鼠胸腺臟器指數(shù)與脾臟器指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表1。

表1 黃芪石斛方對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

2.2 黃芪石斛方對(duì)SRBC誘導(dǎo)小鼠足跖厚度差值和抗體生成細(xì)胞的影響

與空白對(duì)照組比較,黃芪石斛方低、高劑量組足跖厚度差值顯著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高劑量組溶血空斑數(shù)均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、3。

表2 黃芪石斛方對(duì)SRBC誘導(dǎo)小鼠足跖厚度的影響[M(P25,P75),mm]

表3 黃芪石斛方對(duì)SRBC誘導(dǎo)小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

2.3 黃芪石斛方對(duì)SRBC免疫小鼠血清溶血素水平、脾淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞活性的影響

與空白對(duì)照組比較,黃芪石斛方中、高劑量組血清溶血素水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值顯著升高(P<0.01),NK細(xì)胞活性顯著升高(P<0.01)。見表4。

表4 黃芪石斛方對(duì)SRBC免疫小鼠血清溶血素、淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性的影響

2.4 黃芪石斛方對(duì)小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

與空白對(duì)照組比較,黃芪石斛方低、中、高劑量組血清IgG、IgM、IgA含量均顯著升高(P<0.01),結(jié)果見表5。

表5 黃芪石斛方對(duì)小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

2.5 黃芪石斛方對(duì)小鼠血清補(bǔ)體含量的影響

與空白對(duì)照組比較,黃芪石斛方低、中、高劑量組血清C3、C4含量均顯著升高(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見表6。

表6 黃芪石斛方對(duì)小鼠血清補(bǔ)體含量的影響

3 討論

免疫力是免疫系統(tǒng)抵抗疾病的能力,人體具有一套完整的免疫防護(hù)系統(tǒng)如胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、淋巴組織等[4],以及執(zhí)行免疫功能的免疫活性細(xì)胞如T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[5],這些免疫活性細(xì)胞在神經(jīng)、體液及免疫系統(tǒng)的自身調(diào)節(jié)下,相互協(xié)調(diào),執(zhí)行自己的職能,以保證人體處于一個(gè)自身穩(wěn)定的正常狀態(tài)。若免疫功能受損,機(jī)體免疫力下降,則不能正常發(fā)揮免疫功能,對(duì)細(xì)菌、病毒等病原微生物的抵抗能力降低從而容易罹患感冒、肝炎、結(jié)核等感染性疾病。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫力的概念與中醫(yī)理論所述的“正氣”相似,正氣是相對(duì)邪氣的稱謂,泛指人體正常的生命物質(zhì)及其功能活動(dòng),以及基于此而產(chǎn)生的各種維護(hù)能力,包括自我調(diào)節(jié)、適應(yīng)環(huán)境、抗病祛邪和康復(fù)自愈等能力,是人體生理功能狀況的總稱[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi),邪不可干”,正氣是人體感邪后發(fā)病與否,疾病轉(zhuǎn)歸、預(yù)后好壞的關(guān)鍵。正氣的旺盛依賴于正常的臟腑生理功能和充沛的氣血津液以及精微物質(zhì)。若臟腑功能正常,氣血充盈,陰陽(yáng)平衡,則外邪難以入侵,疾病就無(wú)從發(fā)生。因此,中醫(yī)主要通過調(diào)節(jié)臟腑功能,補(bǔ)益氣血,來(lái)維持機(jī)體內(nèi)在的陰陽(yáng)平衡,從而達(dá)到提高免疫力的作用。

《金匱要略》提出扶正祛邪以調(diào)補(bǔ)脾腎為主,五臟中首重脾腎。腎為先天之本[7],正氣之根,所以腎為免疫的生化之源,腎氣足,腎精充,方可正氣旺,免疫強(qiáng),不僅少受邪氣侵襲,還可祛邪于外。脾胃為后天之本[8],氣血生化之源,所以脾為免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。脾氣健旺,運(yùn)化有度,免疫活性物質(zhì)正常產(chǎn)生,機(jī)體免疫功能運(yùn)作正常,反之脾氣虛則導(dǎo)致免疫功能低下[9]。脾腎相互資生,相互促進(jìn),即“先天促后天,后天滋先天”,健脾補(bǔ)腎對(duì)于調(diào)節(jié)免疫功能平衡至關(guān)重要。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中根據(jù)免疫器官功能不同,分為中樞免疫器官和外周免疫器官,兩者通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)互相聯(lián)系。其中中樞免疫器官包括骨髓和胸腺,外周免疫器官包括淋巴結(jié)與脾臟[10]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中指出“腎主骨生髓”[11],中醫(yī)理論認(rèn)為骨髓功能的正常與否和腎精氣充盛與否相關(guān)聯(lián),所以中醫(yī)理論中的補(bǔ)腎健脾與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中增強(qiáng)中樞和外周免疫器官功能思路相得益彰。

黃芪石斛方由黃芪、西洋參、鐵皮石斛、女貞子四味中藥組成,其中黃芪甘微溫,入脾經(jīng),能補(bǔ)氣健脾,生津養(yǎng)血,滋養(yǎng)后天之本,使氣血生化有源以不斷充養(yǎng)先天;西洋參甘苦涼,歸腎經(jīng),能大補(bǔ)元?dú)?補(bǔ)氣養(yǎng)陰,清熱生津;石斛甘寒,歸胃、腎經(jīng),能益胃生津,滋陰清熱;女貞子甘苦涼,歸肝、腎經(jīng),藥性和緩而持久,功善滋補(bǔ)肝腎,清退虛熱,補(bǔ)中有清,為一味清補(bǔ)之品。諸品合用,共奏健脾補(bǔ)腎,益氣養(yǎng)陰之功,且補(bǔ)中有清,滋而不膩,無(wú)溫燥上火之弊端?，F(xiàn)代研究顯示,黃芪[12-13]、西洋參[14-15]、鐵皮石斛[16]、女貞子[17-18]均具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。且黃芪和女貞子配伍可以顯著提高環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能,同時(shí)可以提高小鼠血清溶血素抗體水平及增強(qiáng)二硝基氯苯所致遲發(fā)型超敏反應(yīng)[19]。國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局查詢數(shù)據(jù)顯示,截至2023年2月,153項(xiàng)已批含鐵皮石斛的保健食品中有62項(xiàng)包含鐵皮石斛和西洋參配伍,徐建華[20]通過對(duì)小鼠和家兔的研究證明鐵皮石斛與西洋參單用及合用均具有養(yǎng)陰生津的功效,同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩藥合用時(shí)有協(xié)同作用。楊明晶[21]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛和西洋參配伍可有效促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力,提高產(chǎn)生抗體細(xì)胞和血清溶血素的功能,增強(qiáng)其NK細(xì)胞活性、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力。這些研究也為黃芪石斛方用于增強(qiáng)機(jī)體的免疫力提供了理論依據(jù)。

B淋巴細(xì)胞受到抗原刺激后會(huì)增殖分化出大量漿細(xì)胞,漿細(xì)胞可合成和分泌多種免疫球蛋白,免疫球蛋白是機(jī)體體液免疫重要組成部分。IgG、IgM、IgA屬于免疫球蛋白中最重要的幾種類型。其量的變化可以一定程度反映B淋巴細(xì)胞功能進(jìn)而反映機(jī)體體液免疫功能[22]。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心[23]為補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典激活與替代激活途徑過程的關(guān)鍵成分。補(bǔ)體C4是經(jīng)典途徑中第二個(gè)被激活的補(bǔ)體分子,其被活化后裂解成的C4b片段主要參與經(jīng)典途徑中C3轉(zhuǎn)化酶和C5轉(zhuǎn)化酶的形成,介導(dǎo)補(bǔ)體后續(xù)成分的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24],在30多種補(bǔ)體蛋白中,補(bǔ)體C3、C4與補(bǔ)體總水平趨勢(shì)一致,可反映補(bǔ)體系統(tǒng)的狀態(tài),繼而反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)[25]。本實(shí)驗(yàn)中IgG、IgM、IgA、C3、C4水平均有不同程度的升高,說明黃芪石斛方可能通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分泌和補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。