SASH1基因雜合變異c.1574C＞G（p.T525R）可促進(jìn)黑色素合成增加

陳紅宇，張景，曾珍，楊娉娉，熊宇，張淼，周定安△

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥（dyschromatosis universalis hereditaria，DUH）是一種罕見的遺傳性皮膚病，此病由Ichikawa和Higara于1933年首次報(bào)道，主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，少數(shù)病例存在常染色體隱性遺傳，該病典型臨床表現(xiàn)為全身泛發(fā)無(wú)癥狀的色素沉著斑和色素減退斑［1］。在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)DUH 的連鎖定位區(qū)域和致病基因不同分為DUH1（OMIM 127500）、DUH2（OMIM 612715）和DUH3（OMIM 615402）3 種類型。目前發(fā)現(xiàn)，在人類染色體6q24.2～6q25.2 區(qū)域的SASH1基因變異和染色體2q33.3～q36.1區(qū)域的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族亞家族B 成員6（ABCB6）基因變異與DUH 發(fā)生相關(guān)。本研究擬探討引起DUH 臨床表型出現(xiàn)的SASH1基因變異是否影響黑色素合成。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者，女，32歲，出生于中國(guó)湖北省，出生時(shí)皮膚正常，嬰幼兒時(shí)期面部出現(xiàn)皮膚病變，青春期早期，患者頸部、肘部、膝關(guān)節(jié)和指骨關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)色素沉著斑。成年后，面部、腹部、背部、手臂、大腿、小腿和臀部開始逐漸出現(xiàn)不規(guī)則形狀、大小不一的色素沉著和色素減退斑，見圖1。手掌、足底、口腔黏膜、頭發(fā)、指甲和牙齒均正常。該患者經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和成都醫(yī)學(xué)院2 名皮膚科專家確診為DUH。本研究所涉及的患者一切資料均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審查（倫理號(hào)：2020073K），所有涉及研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、人皮膚黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-1、正常人皮膚黑色素細(xì)胞PIG1。SK-MEL-1 細(xì)胞的專用培養(yǎng)基購(gòu)自于武漢普羅賽爾生命科技有限公司；Nano drop超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；ABI 3730xl 測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；DNA 提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SASH1基因（NM_015278.5）的cDNA 序列由美國(guó)OriGene Technologies 公司合成；野生型pEGFP-C3 質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；KOD-Plus定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；過(guò)表達(dá)野生型SASH1基因腺病毒（HAWT-SASH1-ADV）和過(guò)表達(dá)突變型SASH1基因腺病毒（HAT525R-SASH1-ADV）、聚凝胺由漢恒生物科技（上海）有限公司合成和提供；RPMI 1640 培養(yǎng)基、Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胰酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；RIPA 蛋白裂解液、Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑、SignalUp?Western一抗稀釋液、4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液（Triton X-100）、山羊血清購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Promega公司；鼠抗人綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、血凝素（hemagglutinin，HA）、微管蛋白（β-tubulin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠抗人一抗購(gòu)自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；MITF一抗、Tyrosinase一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?594）、DAPI 和HRP 偶聯(lián)的羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；兔抗人SASH1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus 公司；細(xì)胞黑色素含量比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；大腸埃希菌Top 10 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

采集先證者及其父母外周抗凝全血，使用DNA提取試劑盒提取3人DNA。Nano drop 超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 樣本濃度，DNA樣本-20 ℃保存。

1.3.2 全外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證

將提取的3 人DNA 樣本委托北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。外顯子組測(cè)序檢出的SASH1c.1574C＞G（p.T525R）突變位點(diǎn)，應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該變異位點(diǎn)PCR引物：上游5'-AGCGGTCAAAGAGTG AGCAC-3' ，下游5'-CATGGAGCTCTGCCCACT-3' 。 ABI 3730xl測(cè)序儀進(jìn)行Sanger測(cè)序，SeqMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）軟件預(yù)測(cè)SASH1-T525R 氨基酸替換對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。軟件基于HumDiv 和HumVar 兩個(gè)數(shù)據(jù)集的結(jié)果，給出一個(gè)分值，該分值范圍為0～1，越接近1，說(shuō)明氨基酸突變后對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能造成影響的概率越大。MEGA7軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行不同物種之間保守位點(diǎn)分析。

1.3.4 基因克隆、定點(diǎn)突變和病毒包裝

Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)SASH1基因全長(zhǎng)引物，序列：上游5'-CCGGAATTCCGGATGGAGGACGCGGGAGCAGCTGGCCC GGGGCCGGAGC-3'，下游5'-CGGGATCCCGCTACATGGCCT CAGGGCCTGGCGGCAGTTT-3'。以SASH1基因cDNA 為模板，利用全長(zhǎng)引物和DNA 聚合酶進(jìn)行PCR。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃2 min；95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min；4 ℃恒溫。EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C3質(zhì)粒和SASH1全長(zhǎng)基因，酶切產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后獲得pEGFP-SASH1-C3 重組質(zhì)粒。挑取單個(gè)菌落于96 孔板中培養(yǎng)2 h，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。抽提陽(yáng)性菌液質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，并送測(cè)序驗(yàn)證插入序列的正確性。將已驗(yàn)證正確性的pEGFP-SASH1-C3質(zhì)粒使用KOD-Plus誘變?cè)噭┖袑ASH1基因第1574位核苷酸C定點(diǎn)突變?yōu)镚，構(gòu)建pGFP-T525R-SASH1-C3 質(zhì)粒，測(cè)序以驗(yàn)證該質(zhì)粒的正確性。委托漢恒生物上海有限公司將野生型SASH1和突變型SASH1序列克隆到adeasy014-pAdEasy-EF1-MCS-CMVEGFP腺病毒載體中。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡明確SASH1在PIG1細(xì)胞的定位

將PIG1細(xì)胞以30%密度平鋪在6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h取出6 孔板，依次進(jìn)行4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.2%Triton X-100冰上通透5 min，5%山羊血清封閉1 h，加兔一抗SASH1（1∶100）4 ℃過(guò)夜，次日用山羊抗兔IgG H&L 二抗避光1 h，漂洗后加DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色1 h，避光封片。染色后的片子用激光共聚焦顯微鏡掃描（蔡司LSM710），明確SASH1在PIG1 細(xì)胞的定位情況。其中對(duì)照組一抗用PBS 處理PIG1細(xì)胞，陽(yáng)性組用SASH1單克隆抗體處理PIG1細(xì)胞。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、感染

B16 細(xì)胞培養(yǎng)在含有100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；SK-MEL-1細(xì)胞培養(yǎng)在SK-MEL-1專用培養(yǎng)基中；PIG1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h 更換1 次培養(yǎng)基。將pEGFPSASH1-C3 和pGFP-T525R-SASH1-C3 質(zhì)粒按照Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染B16 細(xì)胞48～72 h，不做任何處理的B16 細(xì)胞作為空白對(duì)照。利用聚凝胺將對(duì)照組、HA-WTSASH1組、HA-T525R-SASH1組腺病毒感染B16 細(xì)胞、SKMEL-1 細(xì)胞，按照制造商提供的程序進(jìn)行，用免疫熒光顯微鏡觀察感染效果。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞中SASH1、MITF、Tyrosinase蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，提取蛋白，4 ℃離心收集蛋白。每孔上樣蛋白量為25μg，經(jīng)12%SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉。加一抗MITF（1∶400）、GFP（1∶400）、Tyrosinase（1∶500）、HA（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）、β-tubulin（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，次日二抗室溫?fù)u床孵育2 h后，采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。

1.3.8 體外黑色素定量T525R-SASH1是否影響黑色素合成

按照細(xì)胞黑色素含量比色法定量檢測(cè)試劑盒的操作步驟將HA-WT-SASH1-ADV 和HA-T525R-SASH1-ADV 的B16 細(xì)胞和SK-MEL-1 細(xì)胞中的黑色素提取出來(lái)，通過(guò)光譜儀在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（A），換算出黑色素含量，每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5 進(jìn)行繪圖，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子組測(cè)序結(jié)果

先證者存在SASH1c.1574C＞G（p.Thr525Arg）的雜合變異位點(diǎn)，該變異位點(diǎn)位于人6號(hào)染色148 853 942 位置，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)致病等級(jí)為致病性變異，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、MAF 數(shù)據(jù)庫(kù)目前未收錄該變異位點(diǎn)；先證者父母該變異位點(diǎn)為野生型。測(cè)序結(jié)果提示先證者存在的該變異并非來(lái)自父母，而是新生突變，SASH1基因變異與先證者表型存在相關(guān)性。先證者SASH1基因染色體位于chr6:1488 53942，核酸改變c.1574（exon 14）C＞G，氨基酸改變p.Thr525Arg（NM_015278），ACMG 致病等級(jí)為致?。≒S2+PM1+PM2+PM），次要等位基因頻率、單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組和外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)均未收錄。先證者父母該SASH1基因位點(diǎn)為野生型c.1574（exon 14）C。

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

先證者存在SASH1基因c.1574C＞G 雜合變異位點(diǎn)，其父親和母親未攜帶該雜合變異位點(diǎn)，見圖2。

Fig.2 Sanger sequencing of SASH1 c.1574C＞G of the proband and his parents圖2 先證者及其父母SASH1 c.1574C＞G變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序

2.3 預(yù)測(cè)T525R-SASH1 變異位點(diǎn)有害性和保守性

PolyPhen-2 軟件預(yù)測(cè)，當(dāng)SASH1基因第525 位蘇氨酸（Thr）突變?yōu)榫彼幔ˋrg）時(shí)，Hum Div、Hum Var 數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)該突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能有害（Probably damaging），預(yù)測(cè)分值分別為1 和0.99，預(yù)測(cè)結(jié)果提示該變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能造成影響的概率較大，見圖3。MEGA7 軟件對(duì)SASH1基因525位Thr 進(jìn)行保守位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示Thr525 在不同物種間高度保守，見圖4。

Fig. 3 PolyPhen-2 predicted the effect of T525R-SASH1 mutation on the structure and function of the protein圖3 PolyPhen-2預(yù)測(cè)T525R-SASH1變異位點(diǎn)對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

Fig. 4 MEGA7 predicted that the conserved nature of Thr525 locus in different species圖4 MEGA7預(yù)測(cè)Thr525位點(diǎn)在不同物種之間的保守性

2.4 激光共聚焦顯微鏡明確SASH1 在PIG1 細(xì)胞的定位

通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，正常人皮膚黑色素細(xì)胞PIG1表達(dá)SASH1蛋白，激光共聚焦顯微鏡觀察到SASH1定位于PIG1細(xì)胞質(zhì)中，見圖5。

Fig.5 Confocal microscopy showed the localization of SASH1 in PIG1 cells(Immunofluorescence staining×200)圖5 共聚焦顯微鏡顯示SASH1在PIG1細(xì)胞中的定位（免疫熒光染色×200）

2.5 T525R-SASH1上調(diào)B16細(xì)胞MITF和Tyrosinase表達(dá)

與空白組相比，過(guò)表達(dá)GFP-WT-SASH1和GFP-T525R-SASH1的 B16 細(xì) 胞 中 MITF 和Tyrosinase 的蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05），與過(guò)表達(dá)GFP-WT-SASH1的B16 細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)GFPT525R-SASH1細(xì)胞中MITF和Tyrosinase表達(dá)量增加（P＜0.05），見圖6、表1。

Tab. 1 Comparison of expression levels of MITF and Tyrosinase proteins between the three groups表1 3組MITF、Tyrosinase蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab. 1 Comparison of expression levels of MITF and Tyrosinase proteins between the three groups表1 3組MITF、Tyrosinase蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與WT-SASH1組比較，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組WT-SASH1組T525R-SASH1組F MITF 0.97±0.02 1.22±0.08a 1.76±0.04ab 107.884＊＊Tyrosinase 0.16±0.02 0.48±0.03a 1.12±0.1ab 179.575＊＊

Fig.6 T525R-SASH1 overexpression increased MITF and Tyrosinase expression in B16 cells圖6 T525R-SASH1上調(diào)B16細(xì)胞MITF和Tyrosinase蛋白表達(dá)

2.6 T525R-SASH1促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生黑色素

Western blot 驗(yàn)證對(duì)照腺病毒組（NC ADV）、野生型SASH1腺病毒組（HA-WT-SASH1-ADV）、突變型T525R-SASH1腺病毒組（HA-MT-SASH1-ADV）成功過(guò)表達(dá)于B16 細(xì)胞（圖7A）和SK-MEL-1 細(xì)胞（圖7B）。提取成功過(guò)表達(dá)腺病毒的各組細(xì)胞的黑色素，與對(duì)照腺病毒組相比，過(guò)表達(dá)野生型SASH1腺病毒組和突變型SASH1腺病毒組的B16細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素增加（P＜0.05）；過(guò)表達(dá)突變型SASH1腺病毒組的B16 細(xì)胞相比較野生型SASH1腺病毒組的B16細(xì)胞中產(chǎn)生的黑色素更多（P＜0.05，圖7C）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)在SK-MEL-1細(xì)胞中得到一致的結(jié)果（圖7D）。

Fig.7 T525R-SASH1 over expression increased melanin synthesis in melanoma cells圖7 過(guò)表達(dá)T525R-SASH1促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生黑色素

3 討論

3.1 SASH1 基因變異在DUH 發(fā)生中扮演著重要的角色

SASH1基因是2003 年德國(guó)學(xué)者Zeller 等［2］研究人類染色體6q23～25 的雜合性缺失時(shí)發(fā)現(xiàn)的，該基因位于染色體6q24.3，包含22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子，共279 746個(gè)堿基對(duì)，編碼了1 230個(gè)氨基酸的蛋白，包含1 個(gè)SLY 結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)SH3 結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)SAM結(jié)構(gòu)域。2003年Xing等［3］對(duì)2個(gè)漢族常染色體顯性DUH 家系進(jìn)行全基因組連鎖定位，結(jié)果2 個(gè)家系的致病基因定位于染色體6q24.2～q25.2 區(qū)域，但未找到致病基因。2013年Zhou等［4］在研究2個(gè)中國(guó)的和1個(gè)美國(guó)的DUH家系時(shí)，首次在染色體6q24.2～6q25.2 區(qū)域發(fā)現(xiàn)SASH1基因SLY 結(jié)構(gòu)域的3 個(gè)錯(cuò)義突變c. 2126T＞G（p. Tyr551Asp），c. 2019T＞C（p.Leu515Pro），c.2000G＞A（p.Glu509Lys）與DUH 的表型發(fā)生相關(guān)。并先后證實(shí)這3個(gè)雜合性變異能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Gαs-SASH1-IQGAP1-E-cadherin［4］、p53-POMC-SASH1［5］和SASH1-MAP2K2-CREB-ERK［6］信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)患者皮膚色素過(guò)度沉著表型的發(fā)生。SASH1 的變異位點(diǎn)c.1553A ＞C p.Gln518Pro［7］、c. 1651T ＞ C p. Tyr551His［8］、c. 1529G ＞ A p.Ser510Asn［9］、c.1553A ＞C p.Gln518Pro［10］、c.1547G ＞A p.Ser516Asn［11］等被報(bào)道與DUH 發(fā)生相關(guān)，迄今為止文獻(xiàn)共報(bào)道了12 個(gè)SASH1基因變異與DUH 發(fā)病相關(guān)。

3.2 SASH1 c.1574C＞G（p.T525R）變異導(dǎo)致DUH 臨床表型發(fā)生

全外顯子組測(cè)序和Sanger測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先證者父母該變異位點(diǎn)均為野生型，先證者攜帶SASH1基因c.1574C＞G（p.T525R）雜合變異是一個(gè)新發(fā)的變異位點(diǎn)。既往日本報(bào)道1例患者攜帶與本研究先證者相同的SASH1基因c.1574C＞G（p.T525R）變異位點(diǎn)，但確診為泛發(fā)性雀斑樣痣［12］，與本例患者的臨床診斷和臨床表現(xiàn)有較大差異，可見同一基因的同一變異位點(diǎn)可能會(huì)引起兩種不同的疾病出現(xiàn)。

3.3 SASH1 c.1574C＞G（p.T525R）雜合變異可促進(jìn)黑色素合成增加

研究發(fā)現(xiàn)，以往報(bào)道與DUH相關(guān)的12個(gè)SASH1基因的變異位點(diǎn)中，有9 個(gè)變異位點(diǎn)均位于SASH1基因的SLY 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域高度保守，被視為DUH 的熱點(diǎn)突變區(qū)域。本研究所報(bào)道SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異位點(diǎn)正是位于高度保守的SLY結(jié)構(gòu)域。PolyPhen-2軟件預(yù)測(cè)SASH1基因第525位蘇氨基酸突變?yōu)榫彼岷髮?duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能造成影響的概率極高，野生型SASH1基因第525位蘇氨酸在不同物種之間的保守性也高，所以推測(cè)SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異可能導(dǎo)致了SLY結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，從而影響SASH1蛋白的正常功能。本研究進(jìn)一步通過(guò)體外功能驗(yàn)證該變異位點(diǎn)的致病性。黑色素合成的過(guò)程極其復(fù)雜，主要涉及酪氨酸酶基因家族中的3 種酶，即酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白（Tyrosinase-related protein，TRP）1、TRP-2，其中TYR是黑色素合成的過(guò)程中的關(guān)鍵酶［13］。MITF 是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，可以同啟動(dòng)子區(qū)域的M-box基序結(jié)合之后調(diào)節(jié)TYR、TRP-1、TRP-2 的表達(dá)，從而調(diào)控黑色素合成［14］。人的皮膚顏色依賴于黑色素的合成，黑色素過(guò)量累積會(huì)導(dǎo)致色素沉著［15］。本研究利用B16 和SK-MEL-1 細(xì)胞構(gòu)建過(guò)表達(dá)T525RSASH1的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)T525R-SASH1可以上調(diào)在黑色素合成過(guò)程中最關(guān)鍵的TYR 以及MITF 的蛋白表達(dá)量，并且T525R-SASH1可以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞合成黑色素增加，體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)T525RSASH1變異可能是先證者出現(xiàn)色素沉著斑的原因。

綜上所述，本研究為SASH1基因變異相關(guān)聯(lián)的DUH 患者出現(xiàn)色素沉著斑的臨床表型提供了理論參考，并且豐富了與DUH相關(guān)的SASH1基因突變位點(diǎn)。體外功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明SASH1基因變異與黑色素合成有關(guān)，為DUH的基因診斷和治療提供了有益信息。但SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異位點(diǎn)如何調(diào)控黑色素生成的具體機(jī)制尚未闡述，因此課題組下一步將會(huì)擴(kuò)大該患者家系，從信號(hào)通路和基因調(diào)控等方面進(jìn)一步研究SASH1基因變異對(duì)黑色素生成的調(diào)節(jié)機(jī)制。