血清lncRNA HOTAIR和miR-206表達(dá)水平與急性呼吸窘迫綜合征患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系▲

李開(kāi)宇 閆秀林 趙志剛

(大同市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,山西省大同市 037004)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的呼吸系統(tǒng)重癥疾病,主要臨床表現(xiàn)為呼吸衰竭、頑固性低氧血癥、呼吸窘迫,伴有胸悶、咳嗽、痰血,起病急、進(jìn)展快,治療困難,預(yù)后差[1-2]。ARDS的致病因素較多,包括藥物中毒、外傷、胰腺炎等[3]。既往研究顯示,ARDS患者死亡多發(fā)生在發(fā)病后2～3周[4],目前臨床尚無(wú)有效的治療方案來(lái)提高ARDS患者的生存率。因此,探討ARDS病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)預(yù)測(cè)指標(biāo)有助于臨床醫(yī)生進(jìn)行早期干預(yù),改善患者的預(yù)后。HOX轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA(HOX transcript anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)是一種長(zhǎng)度為2 148 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),位于12q13.13染色體上,介于同源盒C(homebox C,HOXC)11和HOXC12基因之間,屬于致癌性lncRNA,在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[5]。Wang等[6]的研究結(jié)果顯示,在經(jīng)脂多糖處理的MLE-12細(xì)胞和ARDS小鼠模型中HOTAIR表達(dá)水平升高,在MLE-12細(xì)胞及ARDS小鼠模型中敲除HOTAIR基因后可減弱脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而緩解ARDS病情。miR-206位于人類染色體6q12上,是一種含有21個(gè)核苷酸序列的多功能miRNA,廣泛參與肺功能的調(diào)節(jié),例如其可以下調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá),導(dǎo)致氣道平滑肌的神經(jīng)功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致肺部炎癥性疾病,其還可以靶向抑制間隙連接蛋白43表達(dá),調(diào)節(jié)肺泡氣血屏障的通透性[7]。研究表明,miR-206在支氣管、肺發(fā)育不良患者及急性肺損傷大鼠模型的外周血中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-206能夠抑制纖維連接蛋白1(fibronectin 1,FN1)表達(dá),抑制大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[8]。本課題組通過(guò)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),HOTAIR與miR-206具有互補(bǔ)序列,提示二者可能可以相互結(jié)合。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),靶向調(diào)控HOTAIR/miR-206/FN1軸是治療心肌梗死的潛在方法[9],表明HOTAIR與miR-206存在靶向關(guān)系,并可能在相關(guān)疾病的診治中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)檢測(cè)ARDS患者血清HOTAIR、miR-206的表達(dá)水平,分析二者與ARDS患者病情嚴(yán)重程度及入院28 d內(nèi)生存情況的關(guān)系,初步探討HOTAIR、miR-206在ARDS中的具體調(diào)控機(jī)制,同時(shí)為早期識(shí)別預(yù)后不良的高危患者提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年10月至2021年10月在我院治療的110例ARDS患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)體征、病史及各項(xiàng)輔助檢查結(jié)果均符合ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];(2)入院時(shí)發(fā)病時(shí)間≤24 h;(3)患者及家屬均知情同意;(4)全程在本院接受治療且配合本次研究;(5)無(wú)激素治療史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并病毒性肝炎、嚴(yán)重瓣膜病、心源性或神經(jīng)源性肺水腫、支氣管哮喘、心律失常、感染、血液系統(tǒng)疾病、肺部腫瘤等的患者;(2)臨床診斷不明確的患者;(3)自動(dòng)出院或不能配合本次研究的患者;(4)確診ARDS 24 h內(nèi)即死亡的患者;(5)嚴(yán)重精神障礙的患者。其中,男性58例、女性52例,年齡30～76(57.77±8.62)歲,體質(zhì)指數(shù)18～26(23.08±2.46)kg/m2。本研究經(jīng)大同市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 收集患者入院時(shí)的一般資料與臨床資料:一般資料包括年齡、性別、發(fā)病原因、合并基礎(chǔ)疾病、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史(吸煙史定義為每日吸煙1支以上,并持續(xù)1年以上)、飲酒史(飲酒史定義為每日乙醇攝入量超過(guò)40 g或每周飲酒量超過(guò)280 g,并持續(xù)1年以上)。查閱患者的電子病歷,收集其臨床資料,包括入院時(shí)心率、舒張壓、收縮壓、病因、呼吸頻率、基礎(chǔ)疾病、氧合指數(shù)[PaO2/吸入氧比例(fraction of inspiration oxygen,FiO2)]、急性生理與慢性健康評(píng)價(jià)Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)評(píng)分、血清白蛋白水平、動(dòng)脈血pH值、空腹血糖水平、呼氣末正壓通氣(positive end-expiratory pressure ventilation,PEEP)。其中,APACHEⅡ總分范圍為0～71分,評(píng)分越高表明病情越嚴(yán)重,總分<15分為非重癥、≥15分則為重癥。使用弘盛GT6800監(jiān)護(hù)儀(濟(jì)寧弘盛醫(yī)療器械有限公司)測(cè)量患者入院時(shí)的PEEP。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)患者血清HOTAIR和miR-206的表達(dá)水平:采集患者入院次日早晨空腹外周血10 mL,4 ℃下以3 000 r/min離心10 min,取上層血清。采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司,批號(hào):9112)從血清中提取總RNA,使用核酸測(cè)定儀(北京凱奧科技發(fā)展公司,型號(hào):K5500)檢測(cè)RNA純度和濃度,然后取2 μg總RNA作為模板,經(jīng)過(guò)PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa公司,貨號(hào):6110A)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus)(TaKaRa公司,貨號(hào):RR820A)配置反應(yīng)體系,選用GADPH作為內(nèi)參,通過(guò)LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增目的基因。取血清樣品,利用miRNA抽提試劑盒(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司,批號(hào):CW0627S)提取miRNA,取2 μg miRNA按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):KR211-02]說(shuō)明書(shū)的操作標(biāo)準(zhǔn)將樣本miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以U6為內(nèi)參,使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):FP411-01]檢測(cè)血清miR-206的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為SYBR Mixture 10.0 μL,cDNA 2.0 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各2.0 μL,ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法分別計(jì)算HOTAIR和miR-206基因的相對(duì)表達(dá)量,各引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 分組:參照參考文獻(xiàn)[4],根據(jù)入院時(shí)的PaO2/FiO2將ARDS患者分為ARDS輕度組(200 mmHg

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。采用COX回歸模型分析ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的影響因素。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清HOTAIR、miR-206表達(dá)水平預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的效能。采用Pearson法對(duì)ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患者一般資料與臨床資料的比較 ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的APACHEⅡ評(píng)分、PEEP均依次升高(均P<0.05),但3組間的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、發(fā)病原因、合并基礎(chǔ)疾病、體質(zhì)指數(shù)、心率、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖水平、動(dòng)脈血pH值、血清白蛋白水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患者一般資料與臨床資料的比較

2.2 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平的比較 ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清HOTAIR表達(dá)水平依次升高,而血清miR-206表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 不同臨床結(jié)局ARDS患者一般資料與臨床資料的比較 與生存組相比,死亡組患者的APACHEⅡ評(píng)分、PEEP均升高,PaO2/FiO2降低(均P<0.05),兩組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、發(fā)病原因、合并基礎(chǔ)疾病、體質(zhì)指數(shù)、心率、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖水平、動(dòng)脈血pH值、血清白蛋白水平的比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同臨床結(jié)局ARDS患者一般資與臨床資料的比較

2.4 不同臨床結(jié)局ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平的比較 相比于生存組,死亡組患者的血清HOTAIR表達(dá)水平更高,血清miR-206表達(dá)水平更低(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同臨床結(jié)局ARDS患者血清HOTAIR、miR-206表達(dá)水平的比較(x±s)

2.5 COX回歸分析 將2.3及2.4中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的APACHEⅡ評(píng)分(實(shí)測(cè)值)、PEEP(實(shí)測(cè)值)、PaO2/FiO2(實(shí)測(cè)值)、血清miR-206表達(dá)水平(實(shí)測(cè)值)、血清HOTAIR表達(dá)水平(實(shí)測(cè)值)作為自變量,以ARDS患者的臨床結(jié)局為因變量(死亡=1,存活=0),納入COX回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,APACHEⅡ評(píng)分、PaO2/FiO2、血清HOTAIR表達(dá)水平、血清miR-206表達(dá)水平均是ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的影響因素(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡影響因素的COX回歸分析

2.6 血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清HOTAIR表達(dá)水平、血清miR-206表達(dá)水平及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.845(95%CI:0.765,0.926)、0.837(95%CI:0.760,0.913)、0.943(95%CI:0.899,0.987),特異度分別為87.80%、71.60%、89.20%,敏感度分別為75.00%、83.30%、91.70%,最大約登指數(shù)分別為0.628、0.549、0.809。見(jiàn)圖1。

圖1 血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的ROC曲線圖

2.7 血清HOTAIR和miR-206表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,ARDS患者血清HOTAIR的表達(dá)水平與血清miR-206的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.646,P<0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 ARDS患者血清HOTAIR與miR-206表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討 論

ARDS是一種以呼吸系統(tǒng)衰竭為特征的急性彌漫性肺損傷,常見(jiàn)于重癥監(jiān)護(hù)室患者,由直接肺損傷(肺炎、誤吸等)或間接肺損傷(敗血癥、外傷等)引起,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,致殘率與致死率均較高[11]。盡管目前ARDS的早期診斷和治療手段已取得較大進(jìn)步,但尚無(wú)直接針對(duì)ARDS病理機(jī)制的有效治療方法,大部分患者的臨床轉(zhuǎn)歸仍不理想。另外,ARDS患者雖然經(jīng)治療后肺功能可有不同程度的恢復(fù),但是仍有超過(guò)50%的患者在患病兩年后出現(xiàn)呼吸功能下降,25%～78%的患者在患病1年內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙,部分患者伴有抑郁、焦慮等不良心理癥狀[12]。目前臨床上主要采用APACHEⅡ評(píng)分和Murray肺損傷評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)估ARDS患者的預(yù)后,但二者具有主觀性,特異性較差,例如APACHEⅡ評(píng)分并不能特異性區(qū)分膿毒癥、ARDS或急性腎損傷[13]。因此,亟須尋找特異性指標(biāo)來(lái)準(zhǔn)確識(shí)別高危ARDS患者,及時(shí)調(diào)整臨床治療策略,以改善ARDS患者的預(yù)后。

ARDS疾病進(jìn)展與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),炎癥反應(yīng)可以引起肺泡上皮和內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,導(dǎo)致肺水腫發(fā)生,加重肺部損傷[11]。研究表明,lncRNA可以通過(guò)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性及表達(dá)水平,以及競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA等途徑,來(lái)參與ARDS患者免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞組織修復(fù)、血管內(nèi)皮損傷等病理過(guò)程[14]。Yao等[15]發(fā)現(xiàn),lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1可以通過(guò)靶向調(diào)控miR-150-5p來(lái)參與ARDS小鼠模型的肺損傷,提示lncRNA可以靶向結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)控ARDS的病理過(guò)程。HOTAIR是一種與細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)、基因沉默、神經(jīng)元功能等相關(guān)的lncRNA,有研究表明,HOTAIR參與脂多糖誘導(dǎo)的多種炎癥損傷信號(hào)通路的調(diào)控過(guò)程,如脂多糖誘導(dǎo)的小鼠軟骨細(xì)胞炎癥損傷[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),HOTAIR在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷動(dòng)物模型中表達(dá)上調(diào),HOTAIR被敲除后可減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷,進(jìn)一步的功能試驗(yàn)表明HOTAIR通過(guò)調(diào)節(jié)miR-17-5p來(lái)影響細(xì)胞的自噬和生物學(xué)活動(dòng),從而促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[17]。此外,還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HOTAIR在脂多糖處理的MLE-12細(xì)胞和ARDS小鼠模型中的表達(dá)上調(diào)[6]。本研究結(jié)果顯示,ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清HOTAIR表達(dá)水平依次升高(均P<0.05),說(shuō)明HOTAIR的表達(dá)水平可能與ARDS患者的病情嚴(yán)重程度有關(guān),其表達(dá)水平越高,患者的病情越嚴(yán)重。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn),抑制HOTAIR可調(diào)節(jié)miR-30a-5p/磷酸二脂酶7A軸,減輕ARDS小鼠模型體內(nèi)的炎癥反應(yīng),這提示HOTAIR可能是通過(guò)靶向調(diào)控下游miRNA,間接調(diào)控與ARDS發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的mRNA,從而參與ARDS的進(jìn)展。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,HOTAIR與miR-206核酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-206被證實(shí)是一種抑癌因子,可抑制多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18]。研究表明,miR-206廣泛參與肺功能調(diào)節(jié)[19-20],還在炎癥過(guò)程中扮演重要角色[21]。本研究結(jié)果顯示,ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清miR-206表達(dá)水平依次降低(均P<0.05),說(shuō)明miR-206可能參與ARDS的發(fā)展,且其表達(dá)水平可反映ARDS病情嚴(yán)重程度。

本研究還根據(jù)ARDS患者的臨床結(jié)局進(jìn)行分組,結(jié)果顯示,相比于生存組,死亡組患者的血清HOTAIR表達(dá)水平更高,血清miR-206表達(dá)水平更低(均P<0.05),說(shuō)明血清HOTAIR及miR-206的表達(dá)水平與ARDS患者的預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步行COX回歸分析,結(jié)果顯示,血清HOTAIR表達(dá)水平升高及血清miR-206表達(dá)水平降低均是ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的危險(xiǎn)因素(均P<0.05),提示二者或許可以作為ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清HOTAIR表達(dá)水平及血清miR-206表達(dá)水平預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的AUC分別為0.845、0.837,說(shuō)明血清HOTAIR及miR-206表達(dá)水平單獨(dú)預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡情況具有一定的價(jià)值,但診斷效能中等(AUC均<0.9),而二者聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的AUC為0.943,且敏感度與特異度均較單獨(dú)檢測(cè)更高,說(shuō)明血清HOTAIR與miR-206表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)ARDS患者預(yù)后的效能更高。這提示,對(duì)于血清HOTAIR呈高表達(dá)、血清miR-206呈低表達(dá)的ARDS患者,臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)給予高度警惕,制訂好治療策略,以降低患者的死亡率。本研究進(jìn)一步行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),ARDS患者血清HOTAIR表達(dá)水平與血清miR-206表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示HOTAIR、miR-206可能共同參與ARDS中的炎癥反應(yīng)。然而,HOTAIR是否能夠靶向調(diào)控miR-206進(jìn)而參與ARDS發(fā)病過(guò)程,還需要通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,血清HOTAIR、miR-206的表達(dá)水平與ARDS患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān),血清HOTAIR表達(dá)水平升高及血清miR-206表達(dá)水平降低均是ARDS患者入院28d內(nèi)死亡的危險(xiǎn)因素,且ARDS患者血清HOTAIR表達(dá)水平與血清miR-206表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ARDS患者的預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值,為ARDS發(fā)病機(jī)制的研究及治療提供新的思路。但本研究納入病例數(shù)較少,未來(lái)還需要加大樣本量進(jìn)行深入研究,且HOTAIR、miR-206在ARDS中的具體調(diào)控機(jī)制及應(yīng)用價(jià)值還需要進(jìn)一步探討。