鳳丹皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

錢(qián)世兵,朱月輝,方凌,陳郝,項(xiàng)琪琪,方榮 （.安徽省銅陵市藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心,安徽 銅陵 44000;.安徽省銅陵市食品藥品檢驗(yàn)中心,安徽 銅陵 44000）

鳳丹皮為毛茛科植物鳳丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。秋季采挖根部，除去細(xì)根和泥沙，剝?nèi)「?，曬干；或刮去粗皮，除去木心，曬干[1]。鳳丹皮主要產(chǎn)于安徽銅陵鳳凰山地區(qū)，為銅陵市的道地藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]。鳳丹皮，苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無(wú)汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、癰腫瘡毒。鳳丹皮在中藥處方中應(yīng)用非常廣泛，《中華人民共和國(guó)藥典》和中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中收錄了很多含有鳳丹皮的復(fù)方制劑。目前也有較多文獻(xiàn)報(bào)道了鳳丹皮藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，但對(duì)鳳丹皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少[3-9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)自安徽銅陵鳳凰山的10批次鳳丹皮進(jìn)行了牡丹皮對(duì)照藥材、丹皮酚對(duì)照品以及沒(méi)食子酸對(duì)照品的薄層鑒別，并測(cè)定了其水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和丹皮酚的含量，為鳳丹皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器 賽默飛世爾U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技(中國(guó)）有限公司）；AB135-S電子天平（十萬(wàn)分之一）（梅特勒托利多公司）；LT12/15/C450箱式電阻爐（納博熱(上海)工業(yè)爐有限公司）；FD115電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（德國(guó)賓德公司）；Good look-2000卡瑪薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆㎜inomat 5卡瑪半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（上海持互電子有限公司）。

1.2 試藥 薄層層析用硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水；牡丹皮對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121490-201603，供薄層色譜鑒別使用）；丹皮酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110708-201908，供含量測(cè)定使用）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201906，供含量測(cè)定使用），其余為分析純。

1.3 材料 10批鳳丹皮藥材均購(gòu)自道地產(chǎn)地安徽銅陵鳳凰山，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉守金教授鑒定為毛茛科植物鳳丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮。見(jiàn)表1。

表1 鳳丹皮藥材收集編號(hào)表

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別取本品粉末2g，加水l0ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為供試品溶液。取牡丹皮對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取丹皮酚和沒(méi)食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各4-10μl，對(duì)照品溶液3μl分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（5∶5∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃條件下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。薄層照片見(jiàn)圖1。

圖1 10批鳳丹皮樣品的薄層色譜圖。3-12為鳳丹皮F1-F10，1為丹皮酚對(duì)照品，2為牡丹皮對(duì)照藥材，13為沒(méi)食子酸對(duì)照品

2.2 水分檢查 按照中國(guó)藥典收載的水分測(cè)定方法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0832 第四法）對(duì)10批鳳丹皮樣品進(jìn)行了水分的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鳳丹皮藥材檢查項(xiàng)和含量測(cè)定結(jié)果(%)

2.3 灰分檢查 按照中國(guó)藥典收載的灰分測(cè)定方法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2302）對(duì)10批鳳丹皮樣品進(jìn)行了總灰分和酸不溶性灰分的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 浸出物檢查 按照中國(guó)藥典收載的浸出物測(cè)定方法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2201）項(xiàng)下的熱浸法，用乙醇作溶劑，對(duì)10批鳳丹皮樣品進(jìn)行了浸出物的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：大連依利特C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55），流速為每分鐘1.0ml；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm；理論塔板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.5.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹皮酚對(duì)照品適量，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.5.4 線性關(guān)系考察 將濃度為0.02116mg/ml的丹皮酚對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋，分別制備成0.04232μg/ml、0.08464μg/ml、0.16928μg/ml、0.2116μg/ml、0.3174μg/ml、0.4232μg/ml的對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述6份對(duì)照品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丹皮酚的線性回歸方程y=3307.8x+1.498（r=0.9999，n=6）。結(jié)果表明，丹皮酚在0.04232-0.4232μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取0.02116mg/ml的丹皮酚對(duì)照品溶液，精密吸取10μl連續(xù)進(jìn)樣6次，丹皮酚峰面積的RSD為1.3%，結(jié)果表明，該方法的精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為F1的鳳丹皮樣品6份，依法制備供試品溶液，測(cè)定供試品中丹皮酚的峰面積，RSD為1.3%，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為F1的同一份供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、16h、24h進(jìn)樣，共測(cè)定6次，測(cè)得丹皮酚峰面積的RSD為1.2%，結(jié)果表明，該方法在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的F1樣品約0.25g，精密稱定，共6份，分別加入7.35mg/ml的丹皮酚對(duì)照品溶液1ml，依法測(cè)定，計(jì)算，得丹皮酚的平均回收率為104.58%，RSD為4.5%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 丹皮酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.5.9 樣品含量試驗(yàn) 取10批鳳丹皮藥材樣品約0.5g，精密稱定，依法制備供試品溶液，測(cè)定丹皮酚的峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中丹皮酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。樣品和丹皮酚的HPLC圖譜見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 鳳丹皮樣品的HPLC圖譜

圖3 丹皮酚對(duì)照品的HPLC圖譜

3 結(jié)論

3.1 薄層色譜的結(jié)果 薄層色譜結(jié)果表明，采用該方法可以檢出10批鳳丹皮藥材在薄層色譜中與牡丹皮對(duì)照藥材、丹皮酚對(duì)照品以及沒(méi)食子酸對(duì)照品在相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，方法簡(jiǎn)便、快速、可行，故此方法可作為鳳丹皮藥材的定性鑒別依據(jù)。

3.2 10 批鳳丹皮藥材的檢查項(xiàng)和含量測(cè)定結(jié)果 10批樣品的各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果差異不大，各項(xiàng)指標(biāo)的平均值為：水分11.23%，總灰分4.53%，酸不溶性灰分0.52%，浸出物27.43%，丹皮酚含量2.33%。參照試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)藥典委員會(huì)的要求，并考慮到鳳丹皮為根皮類藥材的實(shí)際情況以及藥典中牡丹皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故建議規(guī)定鳳丹皮藥材的水分不得超過(guò)13.0%，總灰分不得超過(guò)5.0%，酸不溶性灰分不得超過(guò)1.0%，浸出物不得少于15.0%，丹皮酚的含量不得少于1.2%。鳳丹皮藥材中有藥理活性的成分較多，但含量參差不齊，通過(guò)前期研究和查閱文獻(xiàn)得知，丹皮酚的含量比較穩(wěn)定，一般都在1%以上[10]，所以筆者以丹皮酚為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定鳳丹皮的丹皮酚含量，建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。

3.3 本實(shí)驗(yàn)建立了鳳丹皮的定性定量分析方法，方法簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可為鳳丹皮藥材的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。