新疆棗上鏈格孢菌（Alternaria alternata）對戊唑醇、異菌脲和咪鮮胺的敏感性*

宋月鳳，王靜茹，國立耘，趙思峰，朱小瓊

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物監(jiān)測與綠色防控重點實驗室，北京 100193）（2 山東省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校聊城市分校）（3 河北雄安新區(qū)管理委員會公共服務(wù)局）（4 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

21 世紀以來，紅棗產(chǎn)業(yè)在新疆得到大力發(fā)展，種植面積與產(chǎn)量均居全國首位[1]。隨著紅棗產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，病蟲害大面積發(fā)生，其中黑斑病的危害有加重趨勢。文獻報道[2]和本實驗室的研究[3]發(fā)現(xiàn)，引起棗黑斑病的病原菌主要為互隔鏈格孢（Alternaria alternata）。該病在果實上形成褐色至黑色稍凹陷或不凹陷的病斑。在葉片上產(chǎn)生褐色病斑，后期葉片變黃卷曲，提早落葉[4]。

目前生產(chǎn)中主要采用化學(xué)殺菌劑防治棗黑斑病。戊唑醇和咪鮮胺均屬于甾醇脫甲基抑制劑（DMI），這類殺菌劑能引起細胞膜功能異常，從而影響細胞的生長和增殖[5-6]。異菌脲屬于二甲酰亞胺類殺菌劑（DCF），可使病原菌菌絲生長受阻、畸形或脹破，從而起到抑制病原菌的作用[7]。20 世紀90 年代，我國開始對咪鮮胺進行研究，發(fā)現(xiàn)其對多種病害均有明顯防效，且使用量低[8]，目前在生產(chǎn)中被廣泛使用。劉霞等[9]認為，咪鮮胺、戊唑醇和異菌脲對核桃上鏈格孢的菌絲生長都有較明顯的抑制作用。研究表明，相對于多菌靈和甲基硫菌靈，異菌脲、戊唑醇對鏈格孢菌有更好的抑制效果[10]。

然而，隨著用藥次數(shù)的增加，病原菌繁殖速度快、遺傳變異大，容易產(chǎn)生抗藥性[11]。戊唑醇自1986年研發(fā)成功后，由于其優(yōu)良特性被廣泛應(yīng)用[6]。現(xiàn)已檢測到蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）[12]和草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[13]對戊唑醇產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。崔毓等[11]在新疆阿克蘇地區(qū)的棗樹上也發(fā)現(xiàn)了對戊唑醇具有抗藥性的鏈格孢菌株。對于二甲酰亞胺類殺菌劑，病原菌易通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和促分裂活化蛋白激酶的突變產(chǎn)生抗藥性[14]。張敏等[15]綜合室內(nèi)和田間的試驗結(jié)果推測長期單一使用異菌脲會導(dǎo)致鏈格孢（Alternaria alternata）產(chǎn)生抗藥性，且抗性會逐年提升。楊紅福等[16]發(fā)現(xiàn)，由于長期單一使用咪鮮胺浸種防治水稻惡苗病，導(dǎo)致水稻惡苗病菌對咪鮮胺的抗性大幅度上升，其抗性頻率達82.14%。

抗藥性的產(chǎn)生給病害防治增加了難度，因此針對新疆棗園黑斑病頻發(fā)、通常使用殺菌劑進行防治的現(xiàn)狀，開展對殺菌劑敏感性測試及抗藥性監(jiān)測對于該病害的防治具有重要意義。本研究通過菌絲生長速率法測定了來自新疆棗上鏈格孢菌對戊唑醇、異菌脲和咪鮮胺的敏感性，并分析了3 種殺菌劑對分離自不同地區(qū)菌株的抑制作用及3 種殺菌劑之間的交互抗藥性情況，試驗結(jié)果將為棗黑斑病的化學(xué)防治及抗藥性監(jiān)測提供重要信息和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為2012—2013 年從新疆紅棗主產(chǎn)區(qū)阿克蘇、阿拉爾等地病果、病葉上分離的45 株鏈格孢菌和2 株新疆石河子大學(xué)趙思峰老師提供的菌株，具體信息見表1。其中7 株來自葉片上，40 株來自果實上。所有菌株均經(jīng)過單孢分離純化，通過對菌落形態(tài)、產(chǎn)孢表型、分生孢子、分生孢子梗特征的觀察及ATPase、ALT、GPD3 個基因的序列和系統(tǒng)發(fā)育分析比較綜合鑒定為Alternaria alternata[3]。

表1 新疆地區(qū)采集的棗上鏈格孢菌株信息

供試藥劑為戊唑醇（96.7%原藥，江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司）、異菌脲（98%原藥，北京中植科華農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司）、咪鮮胺（98%原藥，北京中植科華農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司）。溶劑為丙酮（99.5%分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（99.5%分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、異丙醇（99.7%分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

含藥培養(yǎng)基的制備：用電子天平稱取適量的戊唑醇、異菌脲和咪鮮胺的原藥，分別溶于異丙醇、丙酮和甲醇中，配成濃度較高的母液。用各自的溶劑分別將母液稀釋到所需的質(zhì)量濃度，取300 μL 稀釋液[17]加入到已冷卻至60 ℃以下300 mL PDA 培養(yǎng)基中，得到最終需要的含藥平板。含藥平板中，戊唑醇的濃度為0、0.1、0.25、1、2.5、5 μg/mL，異菌脲的濃度為0、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL，咪鮮胺的濃度為0、0.05、0.25、1、2、4 μg/mL。每個處理重復(fù)3 次。

1.2 試驗方法

1.2.1采用菌絲生長速率法測試對藥劑的敏感性

將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d 左右，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，用接種針挑取菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板的中央，26 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗培養(yǎng)。每個處理3 次重復(fù)。26 ℃下培養(yǎng)6 d 后，用十字交叉法測量各個平板的菌落直徑。計算菌落平均直徑，按下列公式計算菌絲生長抑制率。

抑菌率（%）＝［（對照平板菌落直徑－含藥平板菌落直徑）/（對照平板菌落直徑－5）］×100

通過Excel 軟件進行藥劑濃度對數(shù)值和菌絲生長抑制幾率值之間的線性回歸分析，將菌絲生長抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值，藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對數(shù)值，以X（藥劑濃度的對數(shù)值）和Y（抑制率對應(yīng)的幾率值）做線性回歸分析得到回歸方程Y＝a＋bX，當Y＝5時，求出X的反對數(shù)[18]即為各藥劑的EC50。并制作鏈格孢菌株對各藥劑的敏感性頻數(shù)分布圖。

1.2.23 種殺菌劑對采自棗果實和葉片菌株抑制效果的差異性分析

通過SPSS 軟件（IBM SPSS Statistics 23）采用獨立樣本t 檢驗法分析3 種殺菌劑對不同部位菌株抑制效果的差異性。以菌株采集部位作為自變量，分為果實和葉片兩組，3 種殺菌劑的EC50值為因變量，置信區(qū)間為95%。當顯著性數(shù)值大于0.05 時，則殺菌劑對不同部位菌株的抑制效果無差異；當顯著性數(shù)值小于0.05 時，則殺菌劑對不同部位菌株的抑制效果有差異。

1.2.33 種殺菌劑對采自不同地區(qū)菌株抑制效果的差異性分析

通過SPSS 軟件采用獨立樣本t 檢驗法分析3 種殺菌劑對不同地區(qū)菌株抑制效果的差異性。以菌株采集地點作為自變量，分為阿拉爾市和阿克蘇市兩組，3種殺菌劑的EC50值為因變量，置信區(qū)間為95%。當顯著性數(shù)值大于0.05 時，則殺菌劑對不同地區(qū)菌株的抑制效果無差異；當顯著性數(shù)值小于0.05 時，則殺菌劑對不同地區(qū)菌株的抑制效果有差異。

1.2.43 種殺菌劑EC50的相關(guān)性分析

將3 種藥劑EC50值對應(yīng)導(dǎo)入SPSS 軟件中，作出散點圖，然后用皮爾森相關(guān)性算法計算兩兩藥劑對鏈格孢防治效果的相關(guān)性（a＝0.05）。-1＜r＜1，r 的絕對值越接近1，表明相關(guān)性越強，越接近于0，說明相關(guān)性越弱。相關(guān)程度劃分如下：0.8＜|r|＜1.0，為極強相關(guān)；0.6＜|r|＜0.8，為強相關(guān)；0.4＜|r|＜0.6，為中等程度相關(guān)；0.2＜|r|＜0.4，為弱相關(guān)；0.0＜|r|＜0.2，為極弱相關(guān)或無相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢菌株對3 種殺菌劑的敏感性

戊唑醇可以有效抑制鏈格孢菌株的菌絲生長，菌落直徑隨著藥劑濃度的增加而逐漸減?。▓D1）。戊唑醇抑制鏈格孢菌的EC50處于0.362～4.512 μg/mL 之間，中值為0.768 μg/mL，最高值是最低值的12.46 倍，EC50平均值為（1.010±0.691）μg/mL。根據(jù)EC50極差R＝maxX－minX＝4.512－0.362＝4.150 μg/mL，將EC50數(shù)據(jù)分成10 組，戊唑醇對47株鏈格孢菌株EC50的頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線（圖2）。用SPSS 軟件中的K-S 檢驗得到P為0＜0.05，不符合正態(tài)分布。大多數(shù)菌株保持敏感，但菌株H6的EC50值為4.512 μg/mL，明顯高于其他菌株，出現(xiàn)了敏感性下降的亞群體。

圖1 不同濃度戊唑醇對新疆棗上鏈格孢菌株的抑制效果

圖2 戊唑醇對新疆棗上鏈格孢菌的EC50頻數(shù)分布

異菌脲能有效地抑制鏈格孢菌株的菌絲生長，菌落直徑隨著藥劑濃度增加而逐漸減小。異菌脲對鏈格孢菌株的EC50處于0.407～1.207 μg/mL 之間，最高值是最低值的2.96 倍，EC50平均值為（0.764±0.178）μg/mL。根據(jù)EC50極差R＝maxX－minX＝1.207－0.407＝0.800 μg/mL，將EC50數(shù)據(jù)分成9 組，異菌脲對47 株鏈格孢菌株的EC50頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線（圖3）。用SPSS 軟件中的K-S 檢驗得到P為0.2＞0.05，符合正態(tài)分布。

圖3 異菌脲對新疆棗上鏈格孢菌的EC50頻數(shù)分布

咪鮮胺能有效地抑制鏈格孢菌株的菌絲生長，菌落直徑隨著殺菌劑濃度增大而逐漸減小。咪鮮胺對鏈格孢菌株的EC50處于0.163～2.198 μg/mL 之間，最高值約是最低值的13.48 倍，EC50平均值為（0.776±0.421）μg/mL。根據(jù)EC50極差R＝maxX－minX＝2.198－0.163＝2.035 μg/mL，將EC50數(shù)據(jù)分成8 組，咪鮮胺對47 株鏈格孢菌株的EC50頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線（圖4）。用SPSS 軟件中的K-S 檢驗得到P為0.2＞0.05，符合正態(tài)分布。

圖4 咪鮮胺對新疆棗上鏈格孢菌的EC50頻數(shù)分布

2.2 3 種殺菌劑對來自不同采樣部位菌株抑制效果的比較

通過獨立樣本t 檢驗法分析3 種殺菌劑對采自果實和葉片菌株抑制效果的差異性，由于在戊唑醇對鏈格孢菌株EC50值中，菌株H6 的EC50明顯高于其他菌株，導(dǎo)致EC50值頻率不符合正態(tài)分布，因此3 項獨立樣本t 檢驗及后續(xù)的相關(guān)性檢測中是在去除H6 菌株的EC50值后再進行分析。結(jié)果顯示，戊唑醇、異菌脲及咪鮮胺對來自果實和葉片菌株抑制效果的獨立樣本t 檢驗顯著性數(shù)值分別為0.164、0.424 和0.742，全部大于0.05（表2），因此來自果實和葉片的菌株對3 種殺菌劑的敏感性沒有相關(guān)性。

表2 3 種殺菌劑對來自不同采樣部位菌株的抑制效果

2.3 3 種殺菌劑對來自不同地區(qū)菌株抑制效果的比較

通過獨立樣本t 檢驗法分析3 種殺菌劑對不同地區(qū)菌株抑制效果的差異性。由于塔里木大學(xué)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)的樣本量太少，故只對阿拉爾市和阿克蘇市采集的菌株進行獨立t 檢驗。結(jié)果顯示，戊唑醇、異菌脲及咪鮮胺對來自阿拉爾市和阿克蘇市菌株抑制效果的獨立樣本t 檢驗顯著性數(shù)值分別為0.270、0.796 和0.377，全部大于0.05（表3），因此來自不同地區(qū)的菌株對3 種殺菌劑的敏感性沒有相關(guān)性。

表3 3 種殺菌劑對來自不同地區(qū)菌株抑制效果的差異性

2.4 3 種殺菌劑之間的交互抗藥性分析

用46 株鏈格孢菌株對戊唑醇、異菌脲、咪鮮胺3 種藥劑敏感性的EC50進行皮爾森相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，戊唑醇與異菌脲的相關(guān)系數(shù)為0.327，為弱相關(guān)；戊唑醇與咪鮮胺的相關(guān)系數(shù)為0.084，為極弱相關(guān)；咪鮮胺與異菌脲的相關(guān)系數(shù)為0.161，為極弱相關(guān)（圖5）。

圖5 3 種藥劑EC50的皮爾森相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

有效地防治鏈格孢引起的黑斑病，監(jiān)測病原菌對藥劑的敏感性并制定科學(xué)的施藥方案十分重要。本研究采用菌絲生長速率法研究了在新疆不同棗產(chǎn)區(qū)采集的47 株鏈格孢菌對三唑類殺菌劑戊唑醇、二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲和咪唑類殺菌劑咪鮮胺的敏感性，結(jié)果表明，3 種殺菌劑均能有效抑制鏈格孢菌的菌絲生長。

在本試驗中，戊唑醇抑制鏈格孢菌株的EC50平均值為1.010 μg/mL，戊唑醇的EC50頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線。崔毓等[11]通過菌絲生長速率法，采用來源于未使用過戊唑醇的果園的菌株，建立了棗黑斑病病原菌對戊唑醇的敏感基線（0.168 μg/mL），該研究用到的藥劑為制劑而不是原藥，因而與本研究結(jié)果之間無法進行比較。劉霞等[9]、劉礎(chǔ)榮等[5]的試驗中，戊唑醇對核桃和棗上鏈格孢菌抑制的EC50平均值分別為1.78、3.25 μg/mL，兩項研究中的平均EC50值均高于本研究得到的值。異菌脲和咪鮮胺抑制47株鏈格孢菌株的平均EC50值分別為0.764、0.776 μg/mL，兩種藥劑EC50頻數(shù)分布均符合正態(tài)分布。因此可將供試菌株的平均EC50值作為棗黑斑病菌對戊唑醇、異菌脲、咪鮮胺的敏感基線，作為將來開展棗黑斑病菌田間抗藥性監(jiān)測的參考。

戊唑醇、異菌脲、咪鮮胺都能有效地抑制鏈格孢菌絲生長，但長期、連續(xù)多次地使用單一殺菌劑會產(chǎn)生抗藥性[19]。為延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長殺菌劑的使用時間，田間生產(chǎn)時應(yīng)選用不同種類的殺菌劑輪換使用[20]。鄢海峰等[21]發(fā)現(xiàn)防治由鏈格孢屬真菌引起的蘋果斑點落葉病，異菌脲與戊唑醇質(zhì)量比4∶1 的復(fù)配劑比單劑防治效果更好，并且用藥量更低。無論是田間自然產(chǎn)生還是實驗室誘導(dǎo)產(chǎn)生對異菌脲有抗性的鏈格孢菌都對戊唑醇敏感，表明異菌脲與戊唑醇之間沒有交互抗藥性[22]。本試驗對3 種殺菌劑抑制病原菌的效果進行皮爾森相關(guān)性分析，3種殺菌劑對病原菌的抑制效果之間為弱相關(guān)和極弱相關(guān)。上述結(jié)果表明，戊唑醇、異菌脲、咪鮮胺3種殺菌劑之間沒有交互抗性，生產(chǎn)上可以將3 種殺菌劑交替使用，延緩抗藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，新疆棗不同生長時期可以采用戊唑醇、咪鮮胺等藥劑防治鏈格孢引起的棗黑斑病。在化學(xué)藥劑防治方面，需要持續(xù)關(guān)注鏈格孢菌的抗藥性，開展抗藥性監(jiān)測，為田間棗黑斑病的防治及抗藥性治理提供參考信息。