蝴蝶蘭新型雜交品種揮發(fā)性成分分析

童妍　張燕萍　胡美娟　曹映輝　章楊婷　仝恩慧　王文君　趙凱　彭東輝　周育真

摘 要：? 為研究不同蝴蝶蘭（Phalaenopsis） 品種的關鍵致香成分，該研究采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）的芳香植物香氣收集分析方法，結合對8個香花蝴蝶蘭新型雜交品種盛花期花朵進行花香成分檢測，并以此為基礎進行主成分、聚類及香氣品質分析。結果表明：（1）從8個蝴蝶蘭新型雜交品種中共鑒定出96種物質，分為萜烯類、醛類、酯類、醇類、酮類、醚類、酚類和芳香族化合物，其中萜烯類物質為主要揮發(fā)性物質。（2）主成分分析顯示，各新型雜交品種被劃分在3個象限中，F2中揮發(fā)性成分種類和數量均最多，萜烯類物質主要是桉葉油醇、α-香柑油烯；F1、F4、F5與F8為一組，揮發(fā)性成分種類最少，萜烯類物質主要是芳樟醇；F3、F6與F7為一組，揮發(fā)性成分種類較多，萜烯類物質主要是α-香柑油烯。（3）聚類分析結果與主成分分析一致，8個蝴蝶蘭新型雜交品種聚為3類，F1、F4、F5與F8關系較近，為花香氣味類型；F3、F6與F7的關系更近，為木質型花香品質；而F2與其他7個新型雜交品種卻顯示有較遠的遺傳距離，揮發(fā)性物質貢獻率相對平均，花香成分復雜，兼具木香型、薄荷香型和果香型等。綜上表明，花香物質可以作為潛在特征標記物來區(qū)分香味特征各異的品種群體。該研究結果為蝴蝶蘭種質資源梳理、特定芳香品種選育及產品加工生產等進一步開發(fā)利用研究提供了理論依據。

關鍵詞： 蝴蝶蘭， 揮發(fā)性成分， GC-MS， 聚類分析， 遺傳距離

中圖分類號：? Q946文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2023）06-1016-11

Volatile component analysis of new hybrid varieties of Phalaenopsis

TONG Yan1， ZHANG Yanping1， HU Meijuan1， CAO Yinghui1， ZHANG Yangting1，

TONG Enhui1， WANG Wenjun1， ZHAO Kai2， PENG Donghui1， ZHOU Yuzhen1*

（ 1. College of Landscape Architecture， Fujian Agricultural and Forestry University， Key Laboratory of National Forestry and

Grassland Administration for Orchid Protection and Utilization， Fuzhou 350002， China; 2. College of

Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou 350117， China ）

Abstract：? Phalaenopsis was the genus with the highest ornamental and commercial values among orchids. Phalaenopsis with fragrance were rarely distributed in the market due to selection constraints， such as affinity， ploidy and breeding age. Therefore， research on? transferring aroma traits into commercial Phalaenopsis are of great significance to the breeding of Phalaenopsis. In order to investigate the key aroma-causing components among different varieties of Phalaenopsis， the floral fragrance components of the eight new hybrid varieties in full blooming period were examined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. The principal components， clustering and aroma quality analysis were performed based on the identification of floral substance components. The results were as follows： （1） 96 substances were detected in eight varieties of Phalaenopsis， mainly divided into eight categories of terpenes， aldehydes， esters， alcohols， ketones， ethers， phenols and aromatic compounds， among which terpenes were dominant in quantity and content and were the main volatile substances of Phalaenopsis. （2） Principal component analysis showed that eight varieties were divided into three quadrants， F2 had the most volatile components and the most quantity， terpenes were mainly 1，8-cineole， α-bergamotene， linalool and （+）-calarene; F1， F4， F5 and F8 were divided into a group without ketones， ethers or phenols， and they had the least volatile components and terpenes were mainly linalool; F3， F6 and F7 were divided into a group with more volatile components and the terpenes were mainly α-bergamotene. （3） The results of cluster analysis were consistent with the principal component analysis， and the eight varieties were clustered into three categories， F1， F4， F5 and F8 were more closely related to each other as floral odor types; F3， F6 and F7 were more closely related to each other as woody floral quality; F2 showed a long genetic distance from the other seven varieties， with complex floral components and relatively average contribution of volatile substances， and both woody， minty and fruity types. This study shows that floral fragrance substances can be used as potential trait markers to distinguish between groups of varieties with different fragrance characteristics and provide a theoretical basis for further development and utilization research through cross selection to achieve specific floral fragrance Phalaenopsis selection and product processing and production.

Key words： Phalaenopsis， volatile component， GC-MS， cluster analysis， genetic distance

花香化合物是植物花朵釋放的次生代謝物，在植物中表現出明顯的多樣性，一種植物中存在十幾種甚至上百種揮發(fā)物質。普遍認為花香物質有引誘傳粉者、提供食物源信號、抵御昆蟲和病原體侵害等功能（Dobson， 1994；Shulaev et al.， 1997；孔瑩等，2012）?；ㄏ阕鳛椤盎ɑ艿撵`魂”，現已有2 000多種花香物質從90個屬991種植物類群中被鑒定出來（Jette et al.， 2006）。國內外已開展大量芳香植物育種工作，如育成四季開花、芳香濃郁香花月季群（李晉華等，2018）；培育具有香味的常綠杜鵑品種（Ashworth et al.， 2003）；培育出30余個適宜北方陸露地栽培的梅花香花品種（陳俊愉等，1995；趙靚，2019）；此外，山茶也相繼培育出芳香品種（范正琪等，2014）。隨著蝴蝶蘭鮮切花和盆栽蝴蝶蘭市場的發(fā)展，以及人們對芳香植物的喜愛，香型蝴蝶蘭市場的需求擴大，培育不同香型的蝴蝶蘭品種將成為未來重要的育種方向。

肖文芳等（2020，2021）鑒定得到大葉蝴蝶蘭（Phalaenopsis violacea）中的單萜類和倍半萜類物質居多發(fā)現，并特征香氣物質欖香素；之后，以4個蝴蝶蘭品種花朵揮發(fā)性成分進一步驗證單萜類化合物是蝴蝶蘭花朵的主要致香成分。在對蘭花花香成分差異比對時發(fā)現，蝴蝶蘭中醇類物質在數量和相對含量上占優(yōu)勢（彭紅明，2009；楊慧君，2011）。濃香型原生種熒光蝴蝶蘭（P. bellina）和大葉蝴蝶蘭花香由芳樟醇和香葉醇及其衍生物等單萜類化合物決定（Hsiao et al.， 2006， 2008）。楊淑珍和范燕萍（2008）在檢測2個品種揮發(fā)性成分時推測，L-沉香醇為香氣物質的主要成分。原生種西蕾麗蝴蝶蘭（P. schilleriana）中揮發(fā)性成分主要為萜烯類和酯類物質，包含乙酸橙花酯、橙花醇、香茅醇及乙酸香茅酯（Awano et al.， 1997）。

現代蝴蝶蘭種質資源豐富，從常綠到落葉、大花型到小花型均有，傳統雜交育種受到遺傳背景、基因組倍性、雜交親和性等制約，香花育種進程緩慢，市場中鮮有香花品種流通。不同物種間或同一物種不同品種間花香組分仍有差異，并且目前對不同蝴蝶蘭品種揮發(fā)性成分的研究相對較少，主要針對少數的原生種及商業(yè)品種，檢測出的特征香氣相對單一，未能通過揮發(fā)性物質對品種類群進行分類。因此，本研究采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）的芳香植物香氣收集分析方法，系統地對栽培的8個香花蝴蝶蘭新型雜交品種在盛花期時的香氣成分進行全面分析，旨在深入了解不同蝴蝶蘭品種花朵的香味組分及其含量，并以花香成分為基礎進行聚類分析，區(qū)分香味特征各異的品種群體，為芳香蝴蝶蘭種質資源梳理、特定香味品種選育及產品加工生產等進一步研究與開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

供試材料：F1（Phalaenopsis ‘Nobbys Doctor× Phalaenopsis ‘Yaphou Yellow Story）、F2（Phalaenopsis ‘Samela Blue×Phalaenopsis speciosa）、F3（Phalaenopsis speciosa ‘Jiaho Spot SM/TOGA 82P）、F4（Phalaenopsis ‘Super Zebra）、F5（GS 032）、F6（Phalaenopsis speciosa ‘Purple Pixie）、F7（Phalaenopsis speciosa×sib）、F8（Phalaenopsis ‘Yaphon Christmas Red Spots）8個香花蝴蝶蘭新型雜交品種，均取自福建農林大學森林蘭苑溫室大棚，期間正常水肥管理。各挑選3株盛花期且長勢一致的盆栽苗，于測試前1 d搬至樣品前處理室，以適應環(huán)境條件。于12月22—30日10：00—14：00期間摘取盛開7 d的鮮花進行測定，每個樣品取3個生物學重復樣本。

儀器：手動SPME進樣器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國 Supelco 公司）；Agilent 7890B GC-5977B MS和Agilent的HP-INNOWAX（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）色譜柱。

1.2 方法

1.2.1 HS-SPME萃取 取樣前將固相微萃取頭在氣相色譜進樣口老化30 min，老化溫度250 ℃。摘取盛花時期蝴蝶蘭花朵樣品，整朵撕開，置于墊片密封的25 mL萃取瓶中，加入1 μL含0.1%癸酸乙酯的甲醇（色譜級）溶液為內標，將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，萃取纖維位于樣品上方1 cm處，固定手柄，頂空瓶置于35 ℃水浴條件下吸附30 min。

1.2.2 GC-MS分析 吸附完成后將固相微萃取頭抽回，插入氣相色譜-質譜聯用儀進樣口，250 ℃下解析5 min，啟動儀器采集數據。色譜條件：采用HP-INNOWAX色譜柱，長60 m、內徑0.25 mm、液膜厚0.25 μm；載氣為高純度氦氣（99.99%），不分流模式進樣，隔墊吹掃流速為3 mL·min-1，柱流速為1 mL·min-1。程序升溫：進樣口溫度250 ℃，柱溫起始溫度45 ℃下保持1 min，先以5 ℃·min-1升至200 ℃，再以15 ℃·min-1升至250 ℃。質譜條件：傳輸線接口溫度維持在250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離方式為EI，電子能量參數70 eV，發(fā)射電流為200 μA。以掃描方式獲得質譜數據，檢測質量掃描范圍（m/z）為20～500 amu，溶劑延遲時間為3 min。

1.2.3 數據分析 香味組分經氣相色譜分離形成各自的總離子流色譜圖，解析各個峰所對應的質譜圖。將所得到的質譜數據與計算機譜庫NIST17標準庫檢索及資料進行比對，按相似度最高原則結合網站對應物質所列舉的相關文獻確定樣品中的揮發(fā)性化學成分。根據離子流峰面積歸一化法，計算各組分在總揮發(fā)物中的相對含量且進行定量分析。每個樣品分別進行3次平行重復試驗。利用軟件Excel 2010整理匯總數據且制作圖表，主成分分析、聚類分析及偏最小二乘分析運用軟件Origin Pro 2019b、Metabo Analyst 5.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同蝴蝶蘭品種花香成分及其相對含量

8個蝴蝶蘭品種中共檢測出96種揮發(fā)性成分（表1），雖然不可避免地在不同品種中測出相同的香氣物質，但每個品種都因揮發(fā)性成分不同比例的相互組合而表現出獨特的花香特征。成分乙酸甲酯在各品種中均被檢測出來，相對含量差異很大。乙酸甲酯物質在F1、F5和F7中含量較高，分別為24.69%、14.07%和17.05%，推測物質乙酸甲酯為3個品種的主要香氣成分之一。

萜烯類組分的相對含量在蝴蝶蘭中具有重要地位，不同品種的蝴蝶蘭所檢測出的萜烯類物質具有較大差異。6個蝴蝶蘭品種F1、F2、F3、F4、F6和F7中均檢測出倍半萜物質α-香柑油烯，物質釋放均為高表達，推測它是6個品種的主要香氣之一。β-紅沒藥烯在F3和F7中較高表達，含量可達12.99%和11.4%， 推測β-紅沒藥烯是F3和F7的特征香氣成分之一。在F2、F3、F6和F7中均檢測到β-香柑油烯，在F3和F6中其相對含量均高于5%，推測此物質是4個品種中的花香主要香氣之一。單萜類物質芳樟醇是F1、F2、F4、F5和F8的共有成分，在F5中相對含量最高，為16.81%，在F4和F1中相對含量較高，分別為8.94%和8.52%，推測它是這3個品種的主要香氣之一。桉葉油醇是F1、F2和F8的共有成分，在F8中的相對含量檢測最高為23.65%，在F2中檢測次之為6.68%，在F1中僅檢測出2.01%的相對含量，其余5個品種中未檢測到，推測桉葉油醇是F2和F8的主要香氣之一。檜烯在F8和F1中較高表達，相對含量分別為13.24%和6.78%，推測檜烯是構成F1和F8花香的主成分之一。在F5中檢測到（3E）-4，8-二甲基壬-1，3，7-三烯，相對含量為6.4%，判定其為F5的香氣主成分之一。此外，在F2中還檢測到特有成分倍半萜物質（+）-白菖油萜，在F8中檢測到特有成分單萜類物質（-）-α-蒎烯和（-）-β-蒎烯，在F5中檢測有單萜物質羅勒烯及別羅勒烯，在F7中檢測有反式-β-金合歡烯，F2中較多杜松烯及其相關產物。

6個蝴蝶蘭品種中，F1、F2、F3、F4、F5和F8中均檢測出微量1-己醇，F1、F3、F4、F5、F7和F8中檢測出微量反-3-己烯-1-醇，3-己烯-1-醇在F2和F4中相對含量為1.64%和0.13%，推測3-己烯-1-醇是F2中醇類組分之一。

2.2 不同蝴蝶蘭品種揮發(fā)性成分的組分比較

從8個香花蝴蝶蘭新型雜交品種盛花時期花朵GC-MS總離子流色譜圖中，分析得到萜烯類、醛類、酯類、醇類、酮類、醚類、酚類和芳香族化合物8類物質。在不同蝴蝶蘭品種中，主要揮發(fā)性物質在數量和相對含量上具有較大差異。8個蝴蝶蘭種質資源中檢測鑒定出的物質數量依次為22、35、26、10、20、31、21和31，其總相對含量依次為91.45%、88.65%、98.14%、90.94%、67.48%、98.55%、97.03%、86.65%，萜烯類數量相對其他組分較高，分別為14、26、15、5、9、15、9、24（表2）。不同蝴蝶蘭的花香組成存有差異，每種植物的揮發(fā)性成分與含量都不相同，本研究中各品種的萜烯類物質種類數量占有最多且相對含量最高，是蝴蝶蘭花朵中的主要揮發(fā)性成分。

扣除標品物質后，8個蝴蝶蘭品種中均檢測出萜烯類物質、酯類物質和醇類物質，各組分間相對含量差異較大。萜烯類物質作為蝴蝶蘭花香的主要類別，F3和F6中相對含量較高，分別為80.69%和79.96%；F2、F7、F8中，相對含量分別為70.72%、68.56%、65.02%；F1、F4、F5中，相對含量較低，分別為45.06%、39.64%、31.72%。醇類物質在各品種中檢測相對含量均較低，F2、F5和F4中相對含量分別為1.85%、1.25%和1.2%，F3中僅占0.23%。F1中的酯類物質檢測相對含量最高，為29.09%；F5和F7次之，分別為18.61%和18.14%；F4中的相對含量最少，為4.26%。F2、F3、F6和F7中均檢測出酮類物質和醚類物質，F2、F6和F7中檢測有酚類物質，F2、F6和F8中檢測有芳香族化合物，F2和F6中除醛類物質的其他組分外均檢測出有效物質，F5中除共有組分外僅檢測有醛類物質（圖1）。

2.3 不同蝴蝶蘭品種花香主成分聚類分析

不同品種的96種物質的主成分分析表明，品種與揮發(fā)性成分具有關聯，并能在一定程度上確定揮發(fā)物中的致香成分。桉葉油醇、月桂烯等物質對PC1為正影響，α-香柑油烯、β-香柑油烯、香葉基丙酮、4-甲基苯甲醚等對PC1為負影響；β-古巴烯、欖香烯、（+）-白菖油萜、苯乙醇等物質對PC2為正影響，芳樟醇、香茅醇等對PC2為負影響。

據此，根據主成分的不同8個蝴蝶蘭品種被劃分在3個象限中，F2中揮發(fā)性成分種類和數量均最多，萜烯類物質主要是桉葉油醇、α-香柑油烯、芳樟醇、（+）-白菖油萜；F1、F4、F5和F8分為一組，不含酮類、醚類、酚類物質，揮發(fā)性成分種類最少，萜烯類物質主要是芳樟醇；F3、F6和F7分為一組，α-香柑油烯含量最高，還包含香葉基丙酮、4-甲基苯甲醚等其他揮發(fā)性成分種類（圖2：A）。以8個蝴蝶蘭品種的96種揮發(fā)性成分為基礎，用數字0和1表示某一揮發(fā)性物質成分的有無，含有此種揮發(fā)性成分的數據賦值為1，沒有或未檢測即賦值為0（林榕燕等，2016），利用軟件OriginPro 2019b聚類功能將8個蝴蝶蘭品種分為3類，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（圖2：B）。遺傳距離在6.39附近第一次分支，Ⅰ類中僅包含F2 1個品種；在5.87附近時第二次分支，Ⅱ類由F1、F4、F5和F8組成；Ⅲ類由F3、F6和F7組成。遺傳距離越小，品種間的遺傳關系越近。聚類分析與主成分分析一致將8個品種劃分為同樣的3大類，揮發(fā)性物質成分可能作為潛在特征標記物質區(qū)分不同品種群體，鑒別蝴蝶蘭品種的親緣關系，梳理蝴蝶蘭芳香種質資源。

2.4 不同蝴蝶蘭品種主要差異物質及其品質分析

對鑒定出的96種物質進行偏最小二乘（PLS-DA）分析，對8個蝴蝶蘭品種可以依據絕對回歸系數的加權值篩選出的主要差異物質分離開來。將篩選出的加權系數較大的前15個花香物質列為主要差異物質，對其氣味類型及其品質進行確定。加權系數大于20的物質有5個，加權系數大于10的物質有10個。其中，α-香柑油烯的加權和值最高，為68.725。α-香柑油烯作為最主要差異物質，貢獻率最高，在F3、F6和F7中的表達量較高；β-紅沒藥烯、4-甲基苯甲醚、α-姜黃烯等其他4個差異物質表達量在3個品種中表達均較高，整體呈現木質型氣味類型。F1、F4、F5、F8和F2中的花香物質成分氣味較為繁雜，有薄荷型、木香型、清香型和果香型之分，按差異物質芳樟醇貢獻率能夠將5個品種分為兩類，即F1、F4、F5和F8中具有玫瑰花香的物質釋放較多，F2中玫瑰花香的芳樟醇成分表達較少（圖3）。主要差異物質按香氣類型可分為木香型、花香型、發(fā)酵香型、薄荷香型、清香香型、果香型和草藥香型7種，其中有6種物質呈現木香型類型，氣味品質更具層次變化（表3）。香氣物質可以依據香氣品質類型，按貢獻率判斷關系，區(qū)分香味特征各異的各個品系。

3 討論與結論

花香是植物的天然產物，即使檢測出相同的香氣成分，每一個品種也可表現出獨特的花香特征。與前人研究結果一致，8個蝴蝶蘭品種盛花期花朵96種揮發(fā)性物質中，萜烯類物質的數量及相對含量較多，是蝴蝶蘭揮發(fā)性物質的主要組分（Hsiao et al.， 2008）?；ㄏ阆阄兜男纬梢揽扛鞣N揮發(fā)物的相互作用，其香型主要由擁有較高氣味值的揮發(fā)物決定。肖文芳等（2021）發(fā)現，蝴蝶蘭8個品種的揮發(fā)性成分、相對含量和氣味品質差異較大，已有報道的芳樟醇、沉香醇、香葉醇等揮發(fā)性成分除外，本研究中新檢測出桉葉油醇和α-香柑油烯。芳樟醇存在于多種植物的揮發(fā)油中，在各種香型的香精配方中占有重要地位。本研究發(fā)現，在所測定的8個蝴蝶蘭品種中，有4個蝴蝶蘭品種的花香香味是由帶有玫瑰花香的芳樟醇決定的，包括F1、F4、F5和F8；F3、F6和F7中木質型芳香由α-香柑油烯決定；F2為復合型花香，由桉葉油醇、α-香柑油烯、芳樟醇等物質共同提供。深度挖掘不同香型的香花品種，將花香成分進行合理的歸類，形成物種特異性，為進一步有效開發(fā)利用花香物質、培育具有不同香味的蝴蝶蘭新品種甚至是蘭科蝴蝶蘭屬的新品種提供新的思路。

花香代謝產物作為生物體表型的重要性狀之一，其形成具有多樣性，對芳香植物的相關研究近年來已成為熱門領域（孔瀅等，2012）?；ㄏ愠煞址彪s多變，遺傳機理復雜，植株個體受到親本遺傳的影響，選育的后代出現性狀分離，可能是引起后代花香形成具有差異的主要原因之一。此外，香氣變化還受到多種因素的影響，如細胞結構、內源物質的量、物質揮發(fā)效率以及物質釋放方式等。細胞結構及細胞內含物影響花香物質累積與釋放，在釋放到細胞外前，花香物質以各種形式存在于細胞內，內源物質是其揮發(fā)的基礎（EL-Sharkawy et al.， 2005）。不同類型的物質釋放到細胞外的方式有所不同，花香物質釋放到細胞外的轉運蛋白及相關酶發(fā)揮的作用機理還需要進一步探究。原生蝴蝶蘭種質豐富，接近一半的原生種均具有香氣特征，傳統雜交技術制約香花育種進程。隨著花香分子生物學的研究進展，分子育種已成為改良植物花香的重要途徑（Jadaun et al.， 2017）。通過對植物花香化合物的代謝產物、主要代謝途徑及合成關鍵酶和基因的研究，可更直觀有效地了解生物學過程及其形成機理，通過導入外源基因或阻斷其相關代謝途徑來進行花香遺傳改良，從而打破芳香植物育種的種種限制，為解釋蝴蝶蘭不同品種花香的多樣性，理解蝴蝶蘭花香物質合成及定向育種目標的高效實現奠定基礎。

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（責任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2022-07-26

基金項目：? 國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFD1001000302）。

第一作者： 童妍（1998-），碩士研究生，研究方向為園林植物與應用，（E-mail）2474842013@qq.com。

*通信作者：? 周育真，博士，講師，研究方向為園林植物遺傳育種與應用，（E-mail）zhouyuzhencn@163.com。