通脈降濁顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

張賀廷，李 磊△，楊 永，王洪強(qiáng)，丁小凡

（1. 安徽省阜陽市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 阜陽 236025； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 3. 安徽省阜陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安徽 阜陽 236069）

通脈降濁顆粒由丹參、半夏、制首烏、山楂、決明子、蒼術(shù)、膽南星、絞股藍(lán)、姜黃等12 味中藥組方，具有活血化瘀、降濁祛濕、清熱益腎功效，臨床用于痰濁瘀阻所致眩暈、胸悶、乏力、口干口苦、肢體困重、舌苔黃膩或黃白相兼，有齒痕、瘀點(diǎn)，脈滑、弦等癥。方中君藥丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛、活血行氣，為治療血證的要藥，治療瘀阻心脈、胸痹心痛療效較好［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有保護(hù)心血管、抗動脈粥樣硬化、調(diào)血脂等作用［2-4］，所含丹酚酸B 具有抗心肌缺血、抗氧化活性［5］及抑制千里光堿所致肝毒性等［6］。決明子有調(diào)血脂、保肝、明目功效［7］，其中的橙黃決明素是一種潛在的血管擴(kuò)張劑［8］，熱裂解酶水解物具有抗高血壓作用［9］。姜黃、山楂具有活血化瘀、行氣溫中功效，姜黃中的姜黃素具有調(diào)血脂、抗氧化功效［10］。蒼術(shù)、決明子、絞股藍(lán)、膽南星、干姜、黃連具有化濕健脾、降濁祛痰等功效，絞股藍(lán)有較強(qiáng)的調(diào)血脂作用［11-12］，黃連中的活性物質(zhì)小檗堿、黃連素等具有較強(qiáng)的降血壓、調(diào)脂、抗炎活性，還有誘導(dǎo)血管擴(kuò)張的作用［13］；膽南星中的活性物質(zhì)有膽汁酸、黃酮等，有保護(hù)肝功能的作用［14］；干姜主要活性物質(zhì)6- 姜酚等物質(zhì)具有抗炎、降壓功效，以上藥物均為臣藥。制首烏清熱益腎，杜仲具有補(bǔ)肝腎、養(yǎng)筋骨、降血壓功效，均為佐藥。為了有效控制通脈降濁顆粒的質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中丹參、決明子、姜黃進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定丹參中丹酚酸B 的含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD - 10A 型檢測器；Scanner - 3 型薄層掃描儀（瑞士Camag 公司）；ME55 型分析天平（梅特勒-托利多有限公司，精度為十萬分之一）；JK-DY300型超聲波清洗器（合肥金克尼機(jī)械制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

丹參對照藥材（批號為120923 - 201816），決明子對照藥材（批號為121011 - 201506），姜黃對照藥材（121188 - 201605），丹酚酸B 對照品（批號為111562 -201916，純度為96.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；通脈降濁顆粒（醫(yī)院制劑，批號分別為20200513，20200514，20200515，20200601，20200602，20200603）；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

丹參［15-17］：取樣品（批號為20200513）5 g，研細(xì)，加入30 mL乙醇超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取丹參對照藥材0.5 g，加10 mL 乙醇，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取丹酚酸B 對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（3∶2∶4∶2∶0.5，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1 - 3. 供試品溶液 4. 對照藥材溶液 5. 對照品溶液 6. 陰性對照品溶液A. 丹參（254 nm） B. 決明子（365 nm） C. 姜黃（365 nm）圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（254 nm） B.Cassiae Semen（365 nm） C.Curcumae Longae Rhizoma（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

決明子［18-19］：取樣品（批號為20200513）5 g，研細(xì)，加30 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL 使溶解，用鹽酸調(diào)pH 至2，加乙酸乙酯萃取2 次，每次20 mL，合并有機(jī)相，揮干，加1 mL 乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺決明子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取決明子對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

姜黃［20-22］：按丹參TLC 鑒別項下方法制備供試品溶液。按處方工藝制備缺姜黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取姜黃對照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷- 甲醇- 甲酸（96∶4∶0.7，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 丹酚酸B 含量測定

2.2.1 色譜條件［23-24］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計應(yīng)大于3 000。

2.2.2 溶液制備

取丹酚酸B對照品16.25 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為0.162 5 mg/mL的對照品溶液。取裝量差異項下的樣品，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)吸收峰，且丹酚酸B分離度及拖尾因子均符合要求，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

1. 丹酚酸BA. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.Salvianolic acid BA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2 項下丹酚酸B 對照品溶液0.5，1，2，4，8，16 μL，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=10 988X+28 600（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.081 25～2.600 00 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2.2 項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為40.72 μg/mL），按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果丹酚酸B 峰面積的RSD為0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20200513）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD為0.24%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20200513）樣品6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果丹酚酸B平均含量為1.35 mg/ g，RSD為1.97%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號為20200513）樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入丹酚酸B（質(zhì)量濃度為40.72 μg/ mL）對照品溶液50 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定與含量限度

含量測定：取6 批（批號分別為20200513，20200514，20200515，20200601，20200602，20200603）樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算含量。結(jié)果6 批樣品中丹酚酸B 含量分別為每袋18.62，19.18，20.30，13.44，12.87，14.70 mg。

含量限度：根據(jù)2020 年版《中國藥典（一部）》記載，由丹參中丹酚酸B（丹酚酸B 含量不低于3.0%）含量計算通脈降濁顆粒中丹酚酸B 最低理論值為每袋28.14 mg，以水煎液中轉(zhuǎn)移率最低32%計算，丹酚酸B含量每袋不低于9.0 mg。考慮到丹酚酸B在水中的溶解度及實(shí)際生產(chǎn)中可能的損耗及藥材批次間的差異，結(jié)合實(shí)際測量值，最終擬訂每袋含丹參以丹酚酸B含量計不少于10.0 mg。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

在對通脈降濁顆粒中12種主要物質(zhì)進(jìn)行TLC 鑒別發(fā)現(xiàn)，通脈降濁顆粒中姜黃、決明子、丹參藥材的TLC斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。但顆粒中蒼術(shù)的TLC 鑒別結(jié)果顯示，薄層色譜對應(yīng)位置無蒼術(shù)對應(yīng)TLC 斑點(diǎn)。查閱文獻(xiàn)［25 - 26］發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)中主要TLC 鑒別物質(zhì)蒼術(shù)素在高溫加熱過程中易揮發(fā)，在TLC 鑒別過程中會有斑點(diǎn)不清晰或無斑點(diǎn)的情況。本研究中通過優(yōu)化蒼術(shù)TLC 鑒別方法，仍未能檢測到其TLC 斑點(diǎn)。考慮到我院制劑室中藥顆粒劑提取設(shè)備采用蒸汽發(fā)生器供氣，設(shè)備功率較小，提取濃縮過程耗時較長，該制劑在制備過程中經(jīng)高溫水煮后可能導(dǎo)致蒼術(shù)中蒼術(shù)素及其他藥材中揮發(fā)油類、水溶性物質(zhì)揮發(fā)或分解，從而導(dǎo)致TLC 斑點(diǎn)不清晰或無斑點(diǎn)。

對顆粒劑中山楂、絞股藍(lán)、蒼術(shù)、膽南星、杜仲、干姜、姜半夏、制首烏等其余藥材進(jìn)行TLC 鑒別，發(fā)現(xiàn)前6 種藥材分離效果較差，且斑點(diǎn)不清晰；制首烏TLC 鑒別中，陰性樣品存在一定干擾，在改變展開劑后仍不能排除陰性干擾，故暫未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 提取方法選擇

本研究中考察了加熱回流提取與超聲提取對通脈降濁顆粒中丹酚酸B 含量的影響，結(jié)果丹酚酸B 含量分別為1.32，1.13 mg/ g，故最終選擇加熱回流提取。同時，考察了不同提取溶劑（75%甲醇、50%甲醇、100%甲醇）及不同取樣量對通脈降濁顆粒中丹酚酚酸B含量的影響，結(jié)果顯示，以75%甲醇為提取溶劑時含量最高，取樣量為1.5～2.5 g 時含量差異不明顯。故最終確定2.2.2項下樣品處理方法。

3.3 質(zhì)量控制

中藥制劑處方藥味較多，其活性物質(zhì)相對豐富，很難用一種成分衡量其臨床療效，在制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用一種或幾種物質(zhì)也不能完全代表該處方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合中藥傳統(tǒng)的煎煮方法與臨床實(shí)際療效，在對其工藝研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂中考察加水量、煎煮時間與煎煮次數(shù)，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況進(jìn)行制訂。本制劑在質(zhì)量控制中以君藥丹參的活性物質(zhì)為指標(biāo)，丹參的活性物質(zhì)包括脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮ⅡA及水溶性成分酚酸類如丹酚酸B、丹參素等，考慮到本制劑以水為溶劑提取，故在質(zhì)量控制中以水溶性成分相對較穩(wěn)定的丹酚酸B為主要指標(biāo)考察［27］。

3.4 方法評價

本研究中建立的定性、定量方法簡便易行、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于通脈降濁顆粒的質(zhì)量控制。