基于偏最小二乘法-判別分析算法分析五味子不同炮制品高效液相色譜指紋圖譜的變化

趙李妮，林 波，梁振綱，方 草△

（1. 海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102； 2. ?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南 ?？?570102）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill. 的干燥成熟果實，又稱北五味子，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效［1］?！侗静菥V目》曰“五味子，入補藥熟用，入嗽藥生用”，五味子常用炮制品有醋五味子和酒五味子［2］。五味子生品以斂肺止咳、生津斂汗為主，醋制后酸澀收斂之性增強，酒制后益腎固精作用增強［3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子、醋五味子和酒五味子均有鎮(zhèn)靜催眠、祛痰、保肝護肝等作用，但醋五味子和酒五味子鎮(zhèn)靜催眠作用均優(yōu)于五味子生品，祛痰作用弱于五味子生品，同時酒五味子的保肝護肝作用較醋五味子和五味子生品強［4-5］。故借助藥物分析手段及化學計量學分析方法初步探討五味子、醋五味子和酒五味子化學成分的差異，可為五味子炮制及炮制品的質(zhì)量控制及進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。2020年版《中國藥典（一部）》收載的五味子炮制品僅有醋五味子，缺少酒五味子的相關(guān)炮制及質(zhì)控研究，且僅以五味子醇甲的含量作為定量分析指標，不能全面反映五味子的內(nèi)在質(zhì)量，以及五味子、醋五味子和酒五味子的質(zhì)量變化。相關(guān)研究多集中在化學成分含量變化［6-10］，針對五味子、醋五味子和酒五味子3種炮制品指紋圖譜的比較，同時采用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）算法分析差異性成分的研究較少。本研究中收集10批五味子，獲得五味子及其炮制品的色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版分別建立五味子及其炮制品高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，通過PLS-DA比較不同炮制方法（醋制和酒制）對五味子指紋圖譜的影響，以期為五味子藥材的研究提供實驗依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世科技＜上海＞有限公司）；SECURA125-1CN 型電子天平（德國賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為十萬分之一）；BKE - 1006DHT 型數(shù)控超聲波清洗器（杭州博可超聲波儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；JC - FW - 100 型粉碎機（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司，功率為800 W，轉(zhuǎn)速為26 000 r/min）。

1.2 試藥

五味子醇甲對照品（批號為110857-201714，含量以99.9% 計），原兒茶酸對照品（批號為110809 -201205，含量以99.9%計），五味子甲素對照品（批號為110764-201915，含量以99.5%計），5-羥甲基糠醛對照品（批號為111626-201711，含量以99.4%計），五味子乙素對照品（批號為110765-201512，含量以99.0%計），檸檬酸對照品（批號為111679 - 201602，含量以97.0%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水；五味子藥材來源于安徽省亳州市張仲景中藥飲片有限公司，共10 批，經(jīng)海南大學藥學院鄧世明教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Polaris Amide - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）［11］，梯度洗脫（0～7 min 時10%A，7～25 min 時10%A →35%A，25～35 min時35%A →60%A，35～45 min時60%A，45～60 min 時60%A →95%A，60～70 min 時95%A →10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 五味子炮制品制備

五味子：除去果梗和雜質(zhì)，洗凈，曬干，編號為S1-S10。

醋五味子：取凈五味子，按2020年版《中國藥典（四部）》0213 炮制通則項下醋炙法炮制，五味子與醋的比例為100∶30（m/V）［12］，編號為S11-S20。

酒五味子：取凈五味子，按2020年版《中國藥典（四部）》0213 炮制通則項下酒炙法炮制，五味子與酒的比例為100∶20（m/V）［13］，編號為S21-S30。

2.3 溶液制備

取對照品各適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并配制成含質(zhì)量濃度分別為檸檬酸0.199 mg/mL、原兒茶酸0.250 mg/mL、5-羥甲基糠醛0.257 mg/mL、五味子醇甲0.173 mg/mL、五味子甲素0.217 mg/mL、五味子乙素0.195 mg/mL 的混合對照品溶液，備用。取藥材細粉1.0 g（過3 號篩），精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定，超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為40 kHz）40 min［14-15］，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號S1），按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD分別小于0.76%和1.83%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號S1），按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于制備后0，2，4，8，16，24 h時進樣測定，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD分別小于0.58%和1.97%（n= 6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（編號S1）6 份，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD分別小于0.77%和1.60%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5 HPLC 指紋圖譜建立

2.5.1 指紋圖譜建立及相似度評價

分別取五味子（編號S1 - S10）、醋五味子（編號S11-S20）和酒五味子（編號S21-S30），按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A 版進行分析，結(jié)果見圖1?？芍逦蹲又讣y圖譜共標定19 個共有峰，醋五味子和酒五味子共標定21 個共有峰。10 批五味子與對照品指紋圖譜的相似度分別為0.991，0.993，0.989，0.992，0.974，0.967，0.998，0.991，0.996，0.982；醋五味子與對照品指紋圖譜的相似度分別為0.995，0.969，0.987，0.969，0.994，0.992，0.989，0.994，0.978，0.963；酒五味子與對照品指紋圖譜的相似度分別為0.984，0.992，0.985，0.974，0.988，0.994，0.991，0.988，0.971，0.969。

A. 五味子 B. 醋五味子與酒五味子圖1 五味子及其炮制品高效液相色譜指紋圖譜及對照指紋圖譜（R）A.Schisandrae Chinensis Fructus B.Vinegar - processed Schisandrae Chinensis Fructus and wine - processed Schisandrae Chinensis FructusFig.2 HPLC fingerprints of Schisandrae Chinensis Fructus and processed Schisandrae Chinensis Fructus and their reference fingerprints（R）

2.5.2 共有指紋峰標定與分析

由圖2 可知，與混合對照品溶液色譜圖保留時間比對，共標定出6 個色譜峰，分別為檸檬酸（2 號峰）、原兒茶酸（4 號峰）、5 - 羥甲基糠醛（6 號峰）、五味子醇甲（8 號峰）、五味子甲素（10 號峰）、五味子乙素（20 號峰）。五味子甲素色譜峰保留時間居中，與相鄰色譜峰分離度較好，且性質(zhì)穩(wěn)定［16］，故以五味子甲素色譜峰作為參照，計算五味子指紋圖譜中其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.41%～1.83%（n=10）和4.36%～41.05%（n=10），醋五味子和酒五味子指紋圖譜中其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.67%～1.43%（n= 20）和10.52%～52.36%（n= 20），表明五味子炮制前后建立的指紋圖譜共有峰保留時間相對穩(wěn)定，而峰面積差異較大。

2. 檸檬酸 4. 原兒茶酸 6.5 - 羥甲基糠醛 8. 五味子醇甲10. 五味子甲素 20. 五味子乙素圖2 混合對照品溶液高效液相色譜圖2.Citric acid 4.3，4 - Dihydroxybenzoic acid 6.5 - Hydroxymethyl furfural 8.Schizandrin 10.Deoxyschizandrin 20.γ-SchisandrinFig.2 HPLC chromatogram of the mixed reference solution

2.6 PLS-DA

2.6.1 PLS-DA 模型構(gòu)建

為真實、準確、形象地反映五味子與酒五味子、醋五味子間的差異，本研究中采用SIMCA - P 14.1 統(tǒng)計軟件，構(gòu)建共有峰峰面積矩陣M（X×Y），建立PLS-DA模型，依次提取到3 個主成分，能說明94.9%X變量和99.5%Y變量的變化，并擁有99.4%Q2預測能力［17-19］，表明所建PLS- DA 模型有較好的穩(wěn)定性和預測力，能有效判別分析五味子、醋五味子和酒五味子的差異。模型分析結(jié)果見圖3至圖5。

圖3 PLS-DA得分散點圖Fig.3 PLS - DA score scatter plots

2.6.2 數(shù)據(jù)分析

由圖3可知，得分矩陣圖中各點的聚焦狀態(tài)反映了五味子、醋五味子和酒五味子內(nèi)在質(zhì)量的異同。由圖4可知，載荷散點圖中各點距離中心的離散程度反映該保留時間對應的共有峰峰面積對樣品內(nèi)在質(zhì)量的影響大小，離散度越大，影響越大。其中，6號和8號色譜峰離散度較大。由圖5可知，變量重要性投影（VIP）值可直觀反映共有峰對樣品內(nèi)在質(zhì)量的影響大小，VIP 值大于1的變量為引起五味子、醋五味子和酒五味子間化學成分差異的主要標志物［18］。五味子（編號S1-S10）、醋五味子（編號S11-S20）和酒五味子（編號S21-S30）各自聚為一類，區(qū)分明顯，表明五味子、醋五味子和酒五味子化學成分的峰面積存在差異。共標記6 個差異標志物，按影響大小依次為6 號峰（5-羥甲基糠醛）、8 號峰（五味子醇甲）、18號峰、10號峰（五味子甲素）、5號峰和19號峰。

圖4 PLS-DA載荷散點圖Fig.4 PLS - DA loading scatter plots

圖5 PLS-DA VIP值圖Fig.5 VIP plot of PLS - DA

3 討論

3.1 指認指標成分選擇

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，五味子的主要成分木脂素為聯(lián)苯環(huán)辛烯型化合物，結(jié)構(gòu)中具有許多羥基和甲氧基，可使蛋白質(zhì)的生物學活性發(fā)生改變，使五味子發(fā)揮肝臟保護作用。五味子中有機酸類成分含量約占10%［4］，是五味子發(fā)揮抑制血小板聚集、抗氧化、收斂止瀉、增強心血管功能等藥理作用的主要活性成分，五味子生品中葡萄糖等單糖在高溫炮制過程中可轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛，且5- 羥甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化、降壓、改變血液流變學等藥理活性，故本研究中選擇木脂素類（五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素）、有機酸類（檸檬酸、原兒茶酸）及5-羥甲基糠醛作為指認指標成分。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究中采用二極管陣列檢測器（DAD）對供試品溶液進行190～400 nm 全波長掃描，結(jié)果于250 nm 波長處指紋圖譜色譜峰數(shù)量較多，基線平穩(wěn)，色譜峰分離度均大于1.5，對稱因子均在0.95～1.05范圍內(nèi)，且6個指標成分的峰形、峰高適中，故選擇250 nm 波長作為檢測波長。曾比較乙腈- 水系統(tǒng)、甲醇- 水系統(tǒng)，以及添加不同濃度消尾劑（磷酸、醋酸、甲酸）的流動相系統(tǒng)對指紋圖譜的影響，結(jié)果乙腈-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫）的洗脫能力、色譜峰峰形均明顯優(yōu)于其他流動相系統(tǒng)。故最終選擇此流動相。

3.3 供試品處理方法優(yōu)化

通過比較不同提取方法（超聲、回流和冷浸）對提取效果的影響發(fā)現(xiàn)：加熱回流對5 - 羥甲基糠醛穩(wěn)定性影響較大，超聲較冷浸時間短，效果好，故選擇超聲法提取。同時考察不同體積分數(shù)有機溶劑（45%，70%，100%甲醇溶液和45%，70%，100%乙醇溶液）作為提取溶劑及不同提取時間（30，40，50 min）對提取效果的影響，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時指紋圖譜色譜峰較多，6 個指標成分的含量較高，提取時間為40 min 時指紋圖譜各色譜峰提取率最高，故選擇甲醇超聲提取40 min 作為五味子、醋五味子和酒五味子供試品處理方法。

3.4 五味子炮制前后指紋圖譜分析

五味子、醋五味子和酒五味子的指紋圖譜中，五味子有19個共有峰，而醋五味子和酒五味子均標定了21個共有峰，將醋五味子和酒五味子合并建立指紋圖譜共有模式，且經(jīng)相似度分析，30 批樣品與對照指紋圖譜相似度均大于0.9。以五味子甲素為參照峰，其他共有峰相對保留時間基本一致，而相對峰面積差異較大，表明指紋圖譜中化學成分基本相同，但不同批次間化學成分含量有差異。由峰面積分析結(jié)果可知，醋五味子和酒五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素較五味子生品均有不同程度增加，而檸檬酸和原兒茶酸均有不同程度降低，這與醋五味子和酒五味子的鎮(zhèn)靜催眠作用增強，而祛痰作用減弱有一定相關(guān)性。本研究因條件限制僅指認了其中6個化學成分，不能全面體現(xiàn)其他共有峰對五味子炮制前后藥理作用變化的影響，后續(xù)可考慮采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對共有峰進行進一步分析。

3.5 方法評價

本研究中建立的五味子及其炮制品（醋五味子、酒五味子）HPLC 指紋圖譜分析方法有效、準確，同時結(jié)合PLS - DA 判別分析，可為五味子生熟異用的理論研究提供參考。